Nghiên cứu quy trình nhân giống cây măng tây (asparagus officinalis l ) in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG NGUYỄN THỊ NHẬT TUYÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY (ASPARAGUS OFFICINALIS L.) IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Ngƣời hƣớng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày khóa luận trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tác giả khoá luận Nguyễn Thị Nhật Tuyên LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm – Đại học Đà Nẵng, học hỏi đƣợc nhiều kiến thức lý thuyết nhƣ thực hành thí nghiệm phƣơng pháp ni cấy mơ tế bào thực vật, qua thân tơi trƣởng thành tƣ duy, bố trí tiến hành nghiên cứu khoa học Để hoàn thành đƣợc Khóa luận tốt nghiệp này, ngồi nỗ lực thân, tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tận tình giúp đỡ mặt khoa học TS Nguyễn Minh Lý Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô thuộc Khoa Sinh – Môi trƣờng truyền dạy cho nhiều kiến thức nhƣ kĩ thực hành thí nghiệm q trình tơi thực đề tài khóa luận Tơi xin gởi lời cảm ơn đến thành viên nhóm nghiên cứu, ln giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm nghiên cứu thời gian thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, kích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt đƣợc kết tốt Xin trân trọng cảm ơn Đà Nẵng, tháng 04 năm 2019 Sinh viên thực Nguyễn Thị Nhật Tuyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .1 DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY MĂNG TÂY 1.1.1 Đặc điểm sinh học kĩ thuật trồng măng tây .6 1.1.2 Giá trị kinh tế 1.1.3 Giá trị dinh dƣỡng dƣợc liệu 1.1.4 Tình hình sản xuất măng tây 1.2 NGHIÊN CỨU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY IN VITRO 1.2.1 Nghiên cứu nƣớc 1.2.2 Nghiên cứu nƣớc 1.3 GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO 10 1.3.1 Sơ lƣợc kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro 10 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu .11 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 11 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .11 2.3.1 Khử trùng mẫu vật 11 2.3.2 Phát sinh callus in vitro .12 2.3.3 Tái sinh chồi in vitro 12 2.3.4 Nhân nhanh chồi in vitro 12 2.3.5 Tạo rễ in vitro 13 2.3.6 Bố trí thí nghiệm xử lí thống kê .13 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .15 3.1 XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC KHỬ TRÙNG MẪU MĂNG TÂY 15 3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG (KTST) ĐẾN SỰ PHÁT SINH CALLUS TỪ MĂNG 16 3.2.1 Ảnh hƣởng 2,4-D đến khả phát sinh callus từ măng non măng tây 16 3.2.2 Ảnh hƣởng BAP + NAA đến khả phát sinh callus từ măng non măng tây 20 3.3 ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG (KTST) ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CHỒI IN VITRO TỪ CALLUS MĂNG TÂY .23 3.3.1 Ảnh hƣởng BAP NAA đến khả phát sinh chồi in vitro từ callus măng tây 23 3.4 ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG (KTST) ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO TỪ CALLUS MĂNG TÂY 25 3.4.1 Ảnh hƣởng KIN đến khả nhân nhanh chồi in vitro từ callus măng tây25 3.5 ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG (KTST) ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO RỄ CÂY MĂNG TÂY IN VITRO 28 3.5.1 Ảnh hƣởng MS đến khả tạo rễ in vitro tạo măng tây hoàn chỉnh .28 3.5.2 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ in vitro tạo măng tây hoàn chỉnh29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .33 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .34 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D Dichlorophenoxylacetic acid BAP – Benzylaminopurine KTST Kích thích sinh trƣởng KIN Kinetin MS Murashige Skoog (1962) NAA α- Naphthaleneacetic acid g/l Gam/lít mg/l Miligam/lít DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Hiệu công thức khử trùng mẫu măng tây 15 Bảng 3.2: Sự ảnh hƣởng 2,4 – D đến phát sinh callus 17 Bảng 3.3: Sự ảnh hƣởng BAP + NAA đến phát sinh callus 20 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng BAP NAA đến khả phát sinh chồi in vitro 23 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng KIN đến khả nhân nhanh chồi măng tây in vitro sau tuần nuôi cấy 26 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng MS đến khả tạo rễ măng tây in vitro sau tuần nuôi cấy 28 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ măng tây in vitro sau tuần nuôi cấy 30 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Mẫu măng tây non 11 Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 13 Hình 3.1: Mẫu măng sau tuần nuôi cấy, không bị nhiễm 16 Hình 3.2: Callus phát triển mơi trƣờng MS có bổ sung 2,4 – D , ngang tỉ lệ 5mm 19 Hình 3.3: Callus phát triển mơi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP 0,5 mg/l NAA, ngang tỉ lệ 5mm 21 Hình 3.4: Callus phát triển mơi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP 0,5 mg/l NAA 22 Hình 3.5: Mẫu callus măng tây tái sinh chồi sau tuần nuôi cấy đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi soi 25 Hình 3.6: Callus măng tây tái sinh chồi mơi trƣờng MS bổ sung 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA sau tuần nuôi cấy 25 Hình 3.7: Nhân nhanh chồi măng tây in vitro môi trƣờng MS bổ sung KIN sau tuần nuôi cấy 27 Hình 3.8: Phát sinh rễ măng tây môi trƣờng thay đổi thành phần MS sau tuần nuôi cấy, ngang tỉ lệ 10 mm 29 Hình 3.9: Phát sinh rễ măng tây môi trƣờng thay bổ sung NAA sau tuần nuôi cấy, ngang tỉ lệ 10 mm 31 Hình 3.10: Quy trình nhân giống măng tây (Asparagus officinalis L.) in vitro 32 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài “SỨC KHỎE”- Vấn đề ln đƣợc đặt lên hàng đầu thời kì phát triển nhân loại Để đảm bảo vấn đề ngƣời phải thƣờng xuyên cải thiện điều kiện sống, đặc biệt bữa ăn ngày Yêu cầu nguồn thực phẩm không đảm bảo lƣợng, chất lƣợng an toàn thực phẩm nhu cầu thị hiếu mà phải có nguồn dinh dƣỡng, dƣợc tính cao giúp cải thiện nâng cao sức khỏe ngƣời Vì vậy, loại vừa có giá trị dinh dƣỡng vừa có giá trị dƣợc liệu đối tƣợng đƣợc ngƣời tiêu dùng ƣa chuộng nhà khoa học hƣớng đến nghiên cứu Măng tây (Asparagus officinalis L.) đƣợc biết đến loại mang lại giá trị dinh dƣỡng, thẩm mỹ mà tạo giá trị kinh tế cao [5] Hiện nay, măng tây đƣợc trồng, tiêu thụ rộng rãi đƣợc ngƣời tiêu dùng ƣa chuộng giới lẽ loại chứa nhiều chất dinh dƣỡng, khoáng chất vitamin tốt cho thể [25] Ngoài ra, loại thực phẩm giàu dƣợc tính theo kết nghiên cứu gần đây, nhà khoa học chiết xuất đƣợc 141 hợp chất hóa học quý hiếm, có đến 31 chất trực tiếp có tác dụng phịng chống điều trị bệnh ung thƣ [25] Loài đƣợc đánh giá thích hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhƣỡng Việt Nam Hiện nay, nƣớc ta măng tây đƣợc trồng phổ biến Ninh Thuận, Bình Thuận, Hải Phịng, Bình Phƣớc số tỉnh thành khác Phƣơng pháp nhân giống măng tây đƣợc sử dụng phổ biến sinh sản hữu tính để tạo loại giống F1 Bên cạnh đó, biện pháp nhân giống rễ đƣợc sử dụng tƣơng đối rộng rãi [5] Măng tây thƣờng đƣợc trồng với mục đích thu hoạch măng làm rau xanh Giá măng tây thị trƣờng giao động từ 80.000 - 180.000 đồng/kg mang lại tiềm lớn để phát kinh tế cho ngƣời nông dân Tuy nhiên, tất hạt giống măng tây F1 đƣợc trồng nƣớc ta giống nhập với giá thành cao, giao động mức 50 - 70 triệu đồng/kg, chí có giống lên đến 100 triệu đồng [28],[30] Vì vậy, yêu cầu đƣợc đặt ngành sản xuất măng tây phải xây dựng đƣợc nguồn cung cấp giống nội địa với giá thành thấp để nâng cao hiệu kinh tế cho ngƣời sản xuất Công nghệ sinh học công cụ quan trọng nhân giống cải thiện đặc điểm di truyền nhiều lồi thực vật, bao gồm loại nơng nghiệp, dƣợc liệu có giá trị kinh tế cao Việc nghiên cứu kĩ thuật nhân giống măng tây in vitro đƣợc nhiều nhà nghiên cứu tiến hành nƣớc Tuy nhiên, đến Việt Nam chƣa có quy trình sản xuất giống măng tây in vitro hoàn thiện đƣợc ứng dụng Xuất phát từ sở trên, định thực đề tài “Nghiên cứu quy trình nhân giống Măng Tây (Asparagus officinalis L.) in vitro” Mục tiêu Xây dựng đƣợc quy trình nhân giống măng tây xanh (Asparagus officinalis L.) in vitro qua nuôi cấy phát sinh callus từ măng Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Kết đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học ảnh hƣởng yếu tố ngoại sinh nội sinh đến q trình nhân giống vơ tính măng tây xanh phƣơng pháp ni cấy in vitro, góp phần làm phong phú sở liệu kỹ thuật nhân giống măng tây Nguồn măng tây in vitro sở để chủ động sản xuất nhanh, liên tục với chất lƣợng giống tốt, giá thành rẻ, đáp ứng nhu cầu giống nhƣ sản xuất thƣơng phẩm măng tây xanh quy mô lớn N M O A P Q A R Hình 3.4: Callus phát triển mơi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP 0,5 mg/l NAA [M] Mẫu măng tây vừa cấy [N] Callus măng tây sau tuần nuôi cấy [O] Callus măng tây sau tuần nuôi cấy [P] Callus măng tây sau tuần nuôi cấy [Q], [R] Callus măng tây (3 tuần) soi kính hiển vi soi 22 3.3 ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG (KTST) ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CHỒI IN VITRO TỪ CALLUS MĂNG TÂY 3.3.1 Ảnh hƣởng BAP NAA đến khả phát sinh chồi in vitro từ callus măng tây BAP chất điều tiết sinh trƣởng có tác dụng tích cực việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trƣởng mô phân sinh làm hạn chế già hóa tế bào Trong tái sinh từ callus nhân giống in vitro, BAP có vai trị đặc biệt quan trọng việc kích thích hình thành chồi non, định hệ số nhân chất lƣợng chồi Ngồi hệ thống ni cấy, việc kết hợp tỉ lệ cytokinin/auxin quan trọng phát sinh hình thái Đối với phát sinh, sinh sản chồi chồi nách cần tỉ lệ cytokinin/auxin lớn Tuy nhiên trình cịn chịu ảnh hƣởng nồng độ hai nhóm chất nồng độ khác cho kết khác Tiến hành thí nghiệm với kết hợp BAP NAA nồng độ khác nhau, kết đƣợc thể dƣới bảng 3.4: Bảng 3.4: Ảnh hƣởng BAP NAA đến khả phát sinh chồi in vitro Nồng độ Nồng Tỉ lệ callus Hệ số nhân Hình thái, kích thƣớc BAP độ NAA (mg/l) (mg/l) 0 - - - 0,5 0,25 30,15 ± 1,58a 2,69 ± 1,21a Màu xanh non, dạng tạo chồi (%) chồi (chồi/mẫu) chồi (mm) cụm, cao 1,0 - 2,0 mm 1,0 0,5 55,55 ± 2,53 b 4,27 ± 1,35b Màu xanh non, dạng cụm, cao 2,0 – 3,0 mm 1,5 0,75 76,18 ± 2,12c 5,22 ± 1,55 c Màu xanh non, dạng cụm, cao 3,0 – 4,0 mm 23 2,0 1,0 87,20 ± 2,42 d 6,39 ± 0,57 d Màu xanh non, dạng cụm, cao 3,0 – 5,0 mm 2,5 1,25 41,20 ± 2,12e 3,55 ± 0.57e Màu xanh non, dạng cụm, cao 2,0 – 3,0 mm 3,0 1,5 23,80 ± 2,53 a 1,85 ± 1,02 f Màu xanh non, dạng cụm, cao 1,0 – 2,0 mm 3,5 1,75 - - - 4,0 2,0 - - - Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 Dấu:“ - ” khơng có tượng tái sinh chồi từ callus Đối với phƣơng án đối chứng không bổ sung BAP + NAA công thức (3,5 mg/l BAP + 1,75 mg/l NAA; 4,0 mg/l BAP + 2,0 ml/g NAA) không cho tỉ lệ tái sinh chồi từ callus, nồng độ BAP + NAA lớn ức chế trình phát sinh chồi callus măng tây Môi trƣờng nuôi cấy bổ sung 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA cho tỉ lệ phát sinh chồi cao chiếm 87,20 ± 2,42 % Chồi thu đƣợc có màu xanh non, dạng cụm măng, với hệ số nhân chồi 6,39 (chồi/mẫu) có chiều cao từ 3,0 – 5,0 mm Cịn mơi trƣờng có bổ sung 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA cho tỉ lệ tái sinh chồi mức độ trung bình 55,55 ± 2,53 % Qua đó, mơi trƣờng MS có bổ sung 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA cho hiệu callus tái sinh chồi đạt tỉ lệ cao 24 Hình 3.5: Mẫu callus măng tây tái sinh chồi sau tuần nuôi cấy đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi soi Hình 3.6: Callus măng tây tái sinh chồi môi trƣờng MS bổ sung 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA sau tuần ni cấy 3.4 ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG (KTST) ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO TỪ CALLUS MĂNG TÂY 3.4.1 Ảnh hƣởng KIN đến khả nhân nhanh chồi in vitro từ callus măng tây Kinetin thƣờng đƣợc sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật để kích thích hình thành callus (kết hợp với auxin) tái tạo mô chồi từ callus (có nồng độ auxin thấp hơn) làm nhân nhanh hệ số chồi in vitro Ở thí nghiệm này, sử dụng KIN nồng độ khác (1,0 – 4,0 mg/l) để nhân nhanh chồi in vitro măng tây Kết đƣợc thể bảng 3.5: 25 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng KIN đến khả nhân nhanh chồi măng tây in vitro sau tuần ni cấy Nồng độ KIN Hệ số nhân chồi Hình thái kích thƣớc (mg/l) (chồi/mẫu) chồi (mm) 1,0 6,5 ± 1,7a 2,0 4,8 ± 1,45b 3,0 4,36 ± 1,89 chồi mảnh, thân nhỏ cao (30 - 40 mm) b chồi mảnh, thân nhỏ cao (30 - 40 mm) chồi cứng cáp, cao (20 - 30 mm) 4,0 6,25 ± 1,89a chồi cứng cáp, cao (30 - 40 mm) Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Hƣờng, Nguyễn Thị Thu Ngà, Trần Thị Hồng (năm 2018) đánh giá ảnh hƣởng nồng độ KIN đến phát sinh đa chồi măng tây in vitro cho kết tốt công thức bổ sung 2,5 mg/l KIN đạt giá trị 96,67% sau tuần nuôi cấy [7] Ở nghiên cứu với môi trƣờng cho hiệu MS có bổ sung 3% sucrose; 0,7% agar, pH= 5,8 bổ sung 1,0 mg/l KIN (hệ số nhân chồi 6,5 ± 1,7 chồi/mẫu) 4,0 mg/l KIN (với hệ số nhân chồi 6,25 ± 1,89 chồi/mẫu) Sự khác hai kết liên quan đến đến nguồn nguyên liệu thí nghiệm, giống kiểu gen mẫu qui định Tuy nhiên, hai nồng độ khác KIN bảng lại cho hình thái chồi khác công thức môi trƣờng bổ sung 1,0 mg/l cho mẫu chồi mảnh, thân nhỏ, cao 30 – 40 mm công thức môi trƣờng bổ sung 4,0 mg/l KIN cho chồi cứng cáp, cao 30 – 40 mm Chính vậy, tùy vào mục đích sử dụng mẫu mà lựa chọn công thức môi trƣờng cho mẫu chồi thích hợp 26 Do mục tiêu đề tài tạo măng tây in vitro hoàn chỉnh nên nghiên cứu sử dụng công thức bổ sung 4,0 mg/l chồi cứng cáp, để đảm bảo cho măng tây in vitro khỏe mạnh dễ dàng thích nghi với điều kiện sống bên ngồi S U T V Hình 3.7: Nhân nhanh chồi măng tây in vitro môi trƣờng MS bổ sung KIN sau tuần nuôi cấy [S] Mẫu chồi nhân nhanh môi trƣờng bổ sung KIN [T] Mẫu chồi nhân nhanh môi trƣờng bổ sung KIN [U] Mẫu chồi nhân nhanh môi trƣờng bổ sung KIN [V] Mẫu chồi nhân nhanh môi trƣờng bổ sung KIN 27 3.5 ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG (KTST) ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO RỄ CÂY MĂNG TÂY IN VITRO 3.5.1 Ảnh hƣởng MS đến khả tạo rễ in vitro tạo măng tây hồn chỉnh Trong q trình sinh trƣởng in vitro, môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung dung dịch MS (Murashige Skoog - 1962) bao gồm khoáng đa lƣợng, vi lƣợng, vitamin chất hữu thiết yếu cần trình sống thực vật Tuy nhiên, nồng độ chất MS thay đổi mang đến kết ni cấy khác Trong đó, việc thay đổi nồng độ MS ảnh hƣởng đến trình phát sinh rễ in vitro Nên thí nghiệm này, tiến hành thay đổi nồng độ MS (1/4, 1/2, MS) để đánh giá khả phát sinh rễ với măng tây in vitro đƣợc tạo thí nghiệm Kết đƣợc thể bảng 3.6: Bảng 3.6: Ảnh hƣởng MS đến khả tạo rễ măng tây in vitro sau tuần nuôi cấy Nồng độ Tỉ lệ phát Số rễ Hình thái kích MS sinh rễ (%) (rễ/mẫu) thƣớc rễ (mm) Rễ dạng chùm, ¼ MS 30,15 ± 2,51a 5,78 ± 1,06a mảnh, màu vàng dài 20 – 25 mm Rễ dạng chùm, ½ MS 84,79 ± 2,99b 6,84 ± 1,55b mảnh, màu vàng dài 25 – 35 mm Rễ dạng chùm, MS 87,30 ± 2,51b 7,33 ± 1,01b mảnh, màu vàng dài 25 – 35 mm Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 28 Đối với cơng thức bổ sung ¼ thành phần MS vào môi trƣờng nuôi cấy mẫu chồi măng tây in vitro tạo rễ (30,15 ± 2,51%) Mơi trƣờng ni cấy bổ sung ½ MS MS cho tỉ lệ chồi măng tây tạo rễ cao xấp xỉ (84,79 ± 2,99 % 87,3 ± 2,53 %) Thu đƣợc - rễ màu vàng, dạng chùm, mảnh dài 25 – 35 mm W X Y Z Hình 3.8: Phát sinh rễ măng tây môi trƣờng thay đổi thành phần MS sau tuần nuôi cấy, ngang tỉ lệ 10 mm [W], [Y] Mẫu chồi phát sinh rễ môi trƣờng bổ sung ½ MS [X], [Z] Mẫu chồi phát sinh rễ môi trƣờng bổ sung MS 3.5.2 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ in vitro tạo măng tây hồn chỉnh NAA loại hc mơn thực vật thuộc nhóm auxin, thƣờng đƣợc thêm vào q trình vi nhân giống để kích thƣớc q trình phát sinh rễ cho in vitro Ngoài nơng nghiệp, NAA loại chất kích thích cho trình tạo rễ nên đƣợc sử dụng rộng rãi cho vƣờn cảnh, giâm thân Với nồng độ 29 khác NAA cho tác dụng kích thích hay ức chế q trình tạo rễ thực vật Vì thế, chúng tơi ứng dụng thay đổi thí nghiệm đánh giá khả tạo rễ cho măng tây in vitro Kết đƣợc thể bảng 3.7 nhƣ sau: Bảng 3.7: Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ măng tây in vitro sau tuần nuôi cấy Nồng độ NAA (mg/l) Tỉ lệ phát Số rễ Hình thái kích thƣớc sinh rễ (%) (rễ/mẫu) rễ (mm) Rễ ít, ngắn, cứng cáp, 0,5 74,59 ± 1,13a 5,14 ± 0,51a màu vàng dài 13 – 15 mm Rễ ít, ngắn, cứng cáp, màu 1,0 66,67 ± 2,91a 4,01 ± 0,64b vàng dài 13 – 15 mm Rễ ít, ngắn, cứng cáp, màu 1,5 38,09 ± 2,97b 2,23 ± 0,23c vàng dài 15 – 18 mm Rễ ít, ngắn, cứng cáp, màu 2,0 36.05 ± 1,84b 2,17 ± 0,4c vàng dài 15 -18 mm Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 Theo nghiên cứu Ngô Phƣơng Ngọc Lâm Ngọc Phƣơng (2015) đánh giá ảnh hƣởng nồng độ NAA đến phát sinh rễ măng tây in vitro cho kết tốt công thức bổ sung 3,0 mg/l NAA [6] Nhƣng nghiên cứu công thức bổ sung 0,5 mg/l NAA vào môi trƣờng MS để tạo rễ cho chồi măng tây in vitro đạt hiệu cao 74,59 ± 1,13% với hệ số tạo rễ 5,14 ± 0,51 (rễ/mẫu) Ở môi trƣờng ni cấy cịn lại bổ sung: 1,0; 1,5; 2,0 mg/l NAA 30 cho kết tạo rễ nhƣng đạt giá trị trung bình thấp Các mẫu rễ thu đƣợc có màu vàng, ngắn nhƣng cứng cáp, dài 13,0 – 18,0 mm Có khác kết nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng NAA đến khả phát rễ cho măng tây in vitro điều kiện trồng khác khí hậu, thổ nhƣỡng, nguồn giống kiểu gen mẫu Hình 3.9: Phát sinh rễ măng tây môi trƣờng thay bổ sung NAA sau tuần nuôi cấy, ngang tỉ lệ 10 mm [1] Mẫu chồi phát sinh rễ môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l NAA [2] Mẫu chồi phát sinh rễ môi trƣờng bổ sung 1,0 mg/l NAA [3] Mẫu chồi phát sinh rễ môi trƣờng bổ sung 1,5 mg/l NAA [4] Mẫu chồi phát sinh rễ môi trƣờng bổ sung 2,0 mg/l NAA 31 Tt Thu mẫu măng tây non kích thƣớc 18 - 25 cm Mơi trƣờng MS 3% sucrose; K Bảo quản ngăn mát tủ lạnh (4⸰C) < ngày 0,7 % agar; + 1,0 mg/l NAA K Khử trùng trùng cồn 70⸰ (5 phút) javen 5% (5 phút) Môi trƣờng MS; 3% sucrose; 0,7 % agar; pH = 5,8; 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA 1,5 mg/l BAP + 0,75 mg/l NAA Môi trƣờng MS; 3% sucrose; 0,7 % agar; + 4,0 mg/l KIN Môi trƣờng MS 3% sucrose; 0,7 % agar; 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA Hình 3.10: Quy trình nhân giống măng tây (Asparagus officinalis L.) in vitro 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, rút số kết luận nhƣ sau: Công thức khử trùng mẫu măng tây non hiệu là: Cồn 70 phút, rửa lại nƣớc cất vô trùng, Javen 5% phút, sau rửa lại lần nƣớc cất (1 phút, phút, phút) Môi trƣờng tạo callus hiệu từ mẫu măng tây non MS có bổ sung 3% sucrose; 0,7 % agar; pH = 5,8; 1,0 mg/l BAP kết hợp với 0,5 mg/l NAA 1,5 mg/l BAP kết hợp với 0,75 mg/l NAA Môi trƣờng phát sinh chồi hiệu từ callus mẫu măng tây MS có bổ sung 3% sucrose; 0,7 % agar; pH = 5,8; 2,0 mg/l BAP kết hợp với 1,0 mg/l NAA Môi trƣờng nhân nhanh chồi hiệu từ chồi măng tây in vitro MS có bổ sung 3% sucrose; 0,7 % agar; pH = 5,8 4,0 mg/l KIN Môi trƣờng phát sinh rễ hiệu cho mẫu măng tây in vitro MS có bổ sung 3% sucrose; 0,7 % agar; pH = 5,8 0,5 mg/l NAA Đề nghị Hồn thiện quy trình cấy chuyển callus măng tây để trì callus thu đƣợc Nghiên cứu để tìm điều kiện thành phần môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu để hồn thiện quy trình ni cấy tạo măng tây in vitro tốt Nghiên cứu đánh giá khả thích nghi, sinh trƣởng măng tây điều kiện vƣờn ƣơm ứng dụng măng tây in vitro nông nghiệp 33 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Báo điện tử: Nông nghiệp Việt Nam; Rau, hoa Việt Nam Đỗ Ngọc Cƣờng, trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh (12/2013) “Nhân giống măng tây (Asparagus officinalis L.) kỹ thuật in vitro” Giáo trình cơng nghệ sinh học “Kỹ thuật nhân giống in vitro” Lê Hồng Triều, Công ty Việt Hoa Mỹ “Kỹ thuật trồng chăm sóc măng tây xanh” Lê Văn Hồng “Giáo trình – Cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật” Ngô Phƣơng Ngọc Lâm Ngọc Phƣơng (2015) “Vi nhân giống măng tây (Asparagus officinalis L.) Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng Tạp chí Trường Đại học Cần Thơ, số 40(2), tr 83-89 Nguyễn Thị Hƣờng, Nguyễn Thị Thu Ngà, Trần Thị Hồng (2018) “Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy in vitro Măng Tây (Asparagus officinalis L.)” Tạp chí Khoa học nghiên cứu giảng dạy sinh học năm 1028, tr.1034 – 1040 Nguyễn Văn Tạm (7/2018) “Kỹ thuật trồng thâm canh măng tây” Sổ tay khuyến nông – khuyến ngƣ (7/2013) “Kỹ thuật trồng măng tây xanh” 10 Trƣơng Thị Bích Phƣợng, Nguyễn Cao Bảo Quang, Ngơ Thị Minh Thu, Hồng Thị Kim Hồng, Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Thị Thu Liên (2017) “Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro măng tây (Asparagus officinalis L.) WEBSITE 11 https:// www.worldlistmania.com/20-worlds-largest-asparagus-producin 12 https://www.wikipedia.org 13 Wibsite trung tâm khuyến nông quốc gia: khuyennongvn.gov.vn/ TIẾNG ANH 14 Ameena Abdulla H S Al Malki and Khaled M.Suliman Elmeer (2010) “Influence of auxin and cytokinine on in vitro multiplication of Ficus Anastasia” African Journal of Biotechnology 34 15 Amnon Levi& KennethC Sink (1992) “Asparagus somatic embryos: Production in suspension culture andconversion to plantlets on solidified medium as influenced bycarbohydrate regime” 16 Bojnauth G, Puchooa S and Bahorun T (2010) “In vitro regeneration of Asparagus officinalis: Primary results, Food and agriculture research concil, Reduit, Mauritius” 17 Desjardins Y (1992) “Micropropagation of Asparagus officinalis L.” Agriculture and Forestry 18 FAO, Glonal Consumption of Asparagus (2017) 19 Jianwu Ren, Wenjing Chen, Mikołaj Knaflewski (2012) “Factors affecting Asparagus (Asparagus officinalis L.) root development in vitro”Acta Sci Hortorum Cultus (11/2012)” 20 KanjiMamiyaa, YujiSakamoto (2000) “Effects of sugar concentration and str ength of basal medium on conversion of somatic embryos in Asparagus officinalis L.” 21 M Peng, D J Wolyn (1999) “Improved callus formation and plant regeneration for shed microspore culture in asparagus (Asparagus officinalis L.)” 22 Mamiya K., Sakamoto Y., Onishi N and Hirosawa T (2001) “Synthetic seeds of Asparagus officinalis L.” in Bhojwani S.and Soh W.Y Eds Current Trends in the Embryology of Angiosperms, Springer Netherlands 23 Murashige T., Skoog F, (1962) “A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco cultures” Physiol Plant 24 Nataša Štajner (2012) “Micropropagation of Asparagus by In Vitro Shoot Culture” 25 R.F Sandsted, D.A Wilcox, T.A Zitter, and A.A Muka, Cornell University, Ithaca, NY (1984) “Asparagus Information Bulletin, Informationn Bulletin 202” 26 Shen S., Zou D., Zhang C., Liu S (1995) “Improved rate of callus and plantlet from anther culture of asparagus (Asparagusofficinalis L.)” 35 27 Takeo Saito, Shuji Nishizawa, Shigeo Nishimura (1991) “Nghiên cứu cải tiến điều kiện nuôi cấy phôi soma Măng Tây (Asparagus officinalis L.) sử dụng lọc khí vơ trùng” 28 Vincent A Fritz, Carl J Rosen, William D Hutchison, Roger L Becker Janna Beckerman, Jerry A Wright, Cindy B.s.Tong, and Terry Nennich “Asparagus production guide” 29 Wang J.Y., Zhang X.P., Yang R., Li X.F, (2010) “Effects of auxins on the propagation of Asparagus officinalis L J East China Normal Univ (Nature Science)” 30 World’s Langest Asparagus Producing Countries 36 ... chƣa có quy trình sản xuất giống măng tây in vitro hoàn thiện đƣợc ứng dụng Xuất phát từ sở trên, định thực đề tài ? ?Nghiên cứu quy trình nhân giống Măng Tây (Asparagus officinalis L. ) in vitro? ??... Nguyễn Thị Thu Liên (201 7) ? ?Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro măng tây (Asparagus officinalis L. ) WEBSITE 11 https:// www.worldlistmania.com/20-worlds-largest-asparagus-producin 12 https://www.wikipedia.org... Đại học Nơng l? ?m Thành phố Hồ Chí Minh (12/201 3) ? ?Nhân giống măng tây (Asparagus officinalis L. ) kỹ thuật in vitro? ?? Giáo trình cơng nghệ sinh học “Kỹ thuật nhân giống in vitro? ?? L? ? Hồng Triều,