Khảo sát quy trình vi nhân giống cây măng tây (asparagus officinalis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY (Asparagus officinalis) Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Thị Minh Thu Sinh viên thực hiện: Huỳnh Kim Đỉnh Mã sớ sinh viên: 58131175 Khánh Hồ – 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY (Asparsgus officinalis) GVHD: TS Phạm Thị Minh Thu SVTH: Huỳnh Kim Đỉnh MSSV: 58131175 Khánh Hòa, tháng 8/2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG PHIẾU THEO DÕI TIẾN ĐỘ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỀ TÀI / KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP (Dùng cho CBHD nộp báo cáo ĐA/KLTN của sinh viên) Tên đề tài: Khảo sát qui trình vi nhân giống măng tây (Asparagus officinalis) Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Thị Minh Thu Sinh viên được hướng dẫn: Huỳnh Kim Đỉnh MSSV: 58131175 Khóa: 2016 – 2020 Ngành: Công nghệ sinh học Lần KT Ngày 20/3/2020 30/3/2020 Kiểm tra mẫu cấy thí nghiệm Hồn thành cơng việc 7/5/2020 Kiểm tra mẫu cấy thí nghiệm Hồn thành cơng việc 14/5/2020 Kiểm tra mẫu cấy thí nghiệm Hồn thành cơng việc 28/5/2020 Kiểm tra viết tổng quan tài liệu Hồn thành cơng việc Nội dung Kiểm tra đề cương thiết kế thí nghiệm Nhận xét của GVHD Hồn thành cơng việc Kiểm tra giữa tiến độ của Trưởng BM Ngày kiểm tra 9/6/2020 Đánh giá cơng việc hồn thành: % Ký tên Được tiếp tục:  Không tiếp tục:  ……………… 15/6/2020 Kiểm tra thu số liệu Hồn thành cơng việc 15/7/2020 Kiểm tra toàn luận văn lần Hồn thành cơng việc 30/7/2020 Kiểm tra tồn luận văn lần Hồn thành cơng việc Nhận xét chung (sau sinh viên hoàn thành ĐA/KL): Điểm hình thức: /10 Điểm nội dung: ./10 Điểm tởng kết: ./10 Đồng ý cho sinh viên: Được bảo vệ: Không được bảo vệ: Khánh Hòa, ngày 11 tháng 08 năm 2020 Cán bộ hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) Phạm Thị Minh Thu LỜI CAM ĐOAN Tôi xin được cam đoan đề tài: “Khảo sát qui trình vi nhân giống măng tây (Asparagus officinalis)” cơng trình nghiên cứu độc lập tơi thực hướng dẫn trực tiếp giảng viên TS Phạm Thị Minh Thu Nghiên cứu được thực trường Đại học Nha Trang, với số liệu kết quả thu được hồn tồn trung thực, khơng chép chưa được công bố công khai cơng trình khác trước Tấc cả tài liệu thông tin tham khảo báo cáo được liệt kê rõ ràng trích dẫn đầy đủ tài liệu tham khảo Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm với lời cam đoan Sinh viên thực Huỳnh Kim Đỉnh LỜI CẢM ƠN Để thực hồn thành đề tài tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, quý thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Môi trường ban lãnh đạo Trung tâm thí nghiệm thực hành tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến giảng viên TS Phạm Thị Minh Thu trực tiếp tham gia quản lý, hướng dẫn, giúp đỡ, góp ý, chỉnh sửa,…trong suốt trình thực đề tài Gửi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Thị Thanh Thuận, Bùi Thị Kiều Duyên, Trương Trần Anh Tuấn, Nguyễn Hùng Duy, Lê Nhật Hưng lớp 58CNSH quan tâm giúp đỡ hỗ trợ động viên suốt trình thực đề tài Lời cảm ơn cuối xin gửi đến ba mẹ, người thân bạn bè ln chỗ dựa tinh thần để tơi có thêm nhiều động lực hoàn thành tốt đề tài cách trọn vẹn Đây cơng trình nghiên cứu thời gian học tập trường khơng tránh khỏi nhiều điều thiếu sót kính mong nhận được góp ý q thầy bạn bè để chỉnh sửa hồn thiện đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng năm 2020 Sinh viên thực Huỳnh Kim Đỉnh TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Đây đề tài nghiên cứu để khảo sát qui trình vi nhân giống măng tây (Asparagus officinalis) Các thí nghiệm được thiết kế bước: khử trùng tạo vật liệu in vitro, nhân chồi tạo rễ Trong bước khử trùng, yếu tố ảnh hưởng đến tỉ lệ nảy mầm hạt được khảo sát gồm: thời gian ngâm, nồng độ chất khử trùng thời gian khử trùng; bước nhân chồi tiến hành khảo sát ảnh hưởng BAP NAA đến nhân chồi măng tây; bước tạo rễ tiến hành khảo sát ảnh hưởng NAA đến tạo rễ chồi măng tây Kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt măng tây được ngâm thời gian 24 khử trùng với NaOCl 5% vòng phút cho tỷ lệ hạt nảy mầm đạt giá trị 90,00% tỷ lệ nhiễm 0,00%, đốt thân sau ni cấy mơi trường MS + 0,5 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + g/l agar cho kết quả số chồi phát sinh có thân tốt, sức sống mạnh so với nghiệm thức được thực Chưa xác định được môi trường tạo rễ tốt cho chồi măng tây Như vậy, đề tài bản xác định được thông số cho bước tạo vật liệu nhân chời, nhiên cịn cần nghiên cứu thêm bước tạo rễ MỤC LỤC TRANG BÌA TURNITIN BÁO CÁO ĐỘC SÁNG QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI PHIẾU THEO DÕI TIẾN ĐỘ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỀ TÀI / KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN TRÍCH YẾU LUẬN VĂN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu măng tây (Asparagus officinalis) 1.2 Phân loại 1.3 Đặc điểm thực vật học .7 1.4.1 Giá trị kinh tế măng tây 1.4.2 Giá trị dinh dưỡng măng tây .10 1.4.3 Giá trị dược liệu măng tây 12 1.5 Tình hình sản xuất, tiêu thụ măng tây giới nước 14 1.5.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ măng tây giới .14 1.5.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ măng tây nước 16 1.6 Các phương pháp nhân giống truyền thống măng tây .16 1.6.1 Phương pháp nhân giống hữu tính 17 1.6.2 Phương pháp nhân giống vơ tính .17 1.7 Giới thiệu phương pháp vi nhân giống .18 1.7.1 Khái niệm vi nhân giống 18 1.7.2 Các giai đoạn trình vi nhân giống 19 1.7.3 Ý nghĩa phương pháp vi nhân giống 21 1.7.4 Ưu nhược điểm phương pháp vi nhân giống .21 1.8 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống Măng tây giới Việt Nam 22 1.8.1 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống Măng tây giới .22 1.8.2 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống măng tây Việt Nam 26 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2.1 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 28 2.2 Vật liệu nghiên cứu 28 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2.2 Các trang thiết bị hóa chất cần thiết .28 2.2.3 Môi trường nuôi cấy 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Chuẩn bị môi trường 29 2.3.2 Thực thí nghiệm 30 2.3.2.1 Khảo sát qui trình khử trùng hạt măng tây 30 2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng BAP NAA đến nhân chồi măng tây 33 2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng NAA đến tạo rễ chồi măng tây 35 2.3.3 Xử lý số liệu 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Quy trình khử trùng hạt măng tây 38 3.2 Ảnh hưởng BAP NAA đến nhân chồi măng tây .40 3.3 Ảnh hưởng NAA đến tạo rễ chồi măng tây 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC PL1 Phụ lục A: Môi trường nuôi cấy PL1 Phụ lục B: Chi phí sản xuất măng tây PL3 Phụ lục C: Kết quả nghiên cứu PL5 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µM : Micromol 2,4 – D : 2,4-Dichlorphenoxy acetic acid 2iP : 6-Di-methyl-allyl-aminopurine Atm : Atmosphere BAP : 6-Benzyl aminopurine CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật cs; et al : Cộng IAA : β-Indole acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid MS : Môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) NAA : α-Naphthalene acetic acid NT : Nghiệm thức QCK : Quang chu kỳ SE : Sai số chuẩn TB : Trung bình i 13 Mato M C, Rua M Land Ferro E (1988) ‘Changes in levels of peroxidases and phenolics during root formation in Vitis cultured in vitro’, Physiologia Plantarum, 72(1), pp 84–88 doi: 10.1111/j.1399-3054.1988.tb06626.x 14 Morton J F (1995) Plant Resources of South-East Asia 6, Economic Botany doi: 10.1007/bf02862341 15 Murphy and Andrew R (2018) ‘William Penn: A Life.’, Oxford University Press ISBN 978-0-19-023426-3 16 Palfi, Marina Jurkoic, Zorica Cosic, Jasenka Tomic Obrdalj, Helena Jurkovic (2017) ‘Sadrzaj ukupnih polifenola i antioksidacijska aktivnost samonikle i kultivirane sparoge u Hrvatskoj’, Poljoprivreda, 23(1), pp 56–62 doi: 10.18047/poljo.23.1.9 17 Paudel N, Aryal M, Puri R (2018) ‘Effect of hormone for in vitro propagation of Asparagus racemosus Wild.’, Current Life Sciences, 4(4), pp 53–61 doi: 10.5281/zenodo.1407185 18 Pegiou, Eirini Mumm, Roland Acharya, Parag De Vos, Ric C.H, Hall, Robert D (2020) ‘Green and white asparagus (Asparagus officinalis): A source of developmental, chemical and urinary intrigue’, Metabolites, 10(1) doi: 10.3390/metabo10010017 19 Perlmutter D (2002) Genetical and nutritionl influences on the spear quality of white asparagus (Asparagus officinalis L.) Landbauforschung Volkenrode Sonderheft 265 ‘http://www.drhoffman.com/hoffapril/’ 20 Pindel A (2017) ‘Micropropagation of Asparagus densiflorus via axillary shoots, indirect organogenesis and somatic embryogenesis’, Folia Horticulturae, 29(2), pp 143–153 doi: 10.1515/fhort-2017-0014 21 Rahman Md Hafizur, Kabir N, Chishti S (2012) ‘Asparagus officinalis extract controls blood glucose by improving insulin secretion and β-cell function in 52 streptozotocin-induced type diabetic rats’, British Journal of Nutrition, 108(9), pp 1586–1595 doi: 10.1017/S0007114511007148 22 Rao P.S, Beri R.M, Budhiraja R.P (1952) ‘Studies on tuber mucilage : Part V Mucilage from the tubers of Asparagus adscendens Roxb.’, J Sci Industr Res 11B : 127 - 128 23 Rasouli H (2016) ‘Plant cell cancer: May natural phenolic compounds prevent onset and development of plant cell malignancy? A literature review’, Molecules, 21(9), pp 14–21 doi: 10.3390/molecules21091104 24 Ren J, Chen W, Knaflewski M (2012) ‘Factors affecting Asparagus (Asparagus officinalis L.) root development in vitro’, Acta Scientiarum Polonorum, Hortorum Cultus, 11(6), pp 107–118 25 Richie JP (1992) ‘The role of glutathione in aging and cancer.’, Experimental Gerontology 27 (5-6): 615-626 http://www.drhoffman.com/hoffapril/ 26 Shih-Wei Loo (1945) ‘Cultivation of excised stem tips of asparagus in vitro’ Slabbert M.M, Lindeque J.M, Ferreira D.I (1990) ‘Rapid in vitro multiplication of Asparagus’ 27 Snafi Al, Ali Esmail (2013) ‘The Pharmacological Importance of Benincasa hispida A review’, International Journal of Pharma Sciences and Research, 4(12), pp 165–170 28 Souci SW, Fachmann W, Kraut H (2000) 'International Journal of Pharma Sciences and Research', Food composition and nutrition tables Medpharm, Stuttgart, Germany 29 Subramanian B (2014) ‘PTC Direct In vitro Propagation of Asparagus adscendens Roxb’, (December) 30 Tandon M and Shukla YN (1995) ‘Tandon M and Shukla YN (1995) Phytoconstituents of Asparagus adscendens, Chlorophytum arundinaceum and Curculigo orchioides : A review.’, J Med Aroma Plant Sci 17 : 42 - 50 53 31 Thakur Shubha, Tiwari K.L, Jadhav S.K (2015) ‘In vitro approaches for conservation of Asparagus racemosus Willd.’, Plant volume 51, pages 619– 625(2015)Cite this article 32 Trivedi HK and Upadhyay KK (1993) ‘AIDS - A serious problem of modern world.’, Sachitra Ayurved 45 : 821 - 824 33 Uchneat M S and Irene E, P (2019) ‘States Plant Patent ( 10 ) Patent No  ’:, 3(May 2008), pp 1–4 34 Vaughan, John Griffith; Geissler, Catherine Alison; Nicholson, B (2018) ‘Scientific classification Kingdom’:, pp 1–12 54 PHỤ LỤC Phụ lục A: Môi trường nuôi cấy Bảng PL A1 Công thức môi trường MS bản (Murashige Skoog, 1962) Stock MS1 (50X) Nồng độ (mg/l) Thành phần Nồng độ stock (g/200ml) KNO3 1900 19 KH2PO4 170 1,7 NH4NO3 1650 16,5 MgSO4.7H2O 370 3,7 MS2 (100X) CaCl2.2H2O 440 8,8 MS3 (100X) H3PO3 6,2 0,124 MnSO4.4H2O 22,3 0,446 CoCl2.6H20 0,025 0,5 mg CuSO4.5H2O 0,025 0,5 mg ZnSO4.4H2O 8,6 0,172 MS4 (100X) MS5 (100X) NaMoO4.2H2O 0,25 mg KI 0,83 16,6 mg FeSO4.7H2O 27,8 0,556 Na2-EDTA 37,3 0,746 Myo-inositol 100 Thiamin.HCl 0,1 mg Pyridoxine.HCl 0,5 10 mg Nicotinic acid 0,5 10 mg Glycin 40 mg PL1 Dung tích dùng cho 1l môi trường MS 20 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml PL1 Bảng PL A2 Một số thơng sớ của chất điều hịa sinh trưởng thực vật CĐHSTTV Mw Dung mơi hịa tan Bảo quản BAP 225,26 NaOH 1N 2-8℃ IAA 175,19 NaOH 1N 0℃ IBA 203,24 NaOH 1N 0℃ Kinetin 215,22 NaOH 1N 0℃ NAA 186,21 NaOH 1N 2-8℃ 2,4 – D 221,04 EtOH 50% 2-8℃ Bảng PL A3 Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 121℃ (Burger, 1988) Thể tích mơi trường (ml) Thời gian khử trùng tới thiểu (phút) 20 ÷ 25 24 50 26 100 28,5 250 31,2 500 35 1000 40 2000 48 PL2 PL2 Phụ lục B: Chi phí sản xuất măng tây Bảng PL B1 Tởng chi phí trồng chăm sóc măng tây gieo trồng hạt giớng diện tích STT CÔNG VIỆC SỐ LƯỢNG ĐƠN GIÁ THÀNH TIỀN Hạt giống 20.000 hạt 1.000 đ/1 hạt 20.000.000đ Ươm giống+Giá thể+bao nilon 20.000 1.500 đ/1 30.000.000đ Làm đất+Vôi+Vỏ đậu+Tro trấu/Xơ dừa 30.000kg 1.000 đ/1m² 30.000.000đ Bón lót phân trùn+Lân+Vi sinh 40.000kg 1.500 đ/1kg 60.000.000đ Hệ thống tưới nhỏ giọt+Thoát nước hệ thống 40.000.000đ 40.000.000đ Phân vi sinh cải tạo đất lít×6 lần 140.000đ/1 lít 7.560.000đ 140kg×18 lần 12.000đ/kg 30.240.000đ 15.000kg×2 lần 2.000đ/kg 60.000.000đ lít×9 lần 140.000 đ/lít 7.560.000đ (1lần/1 tháng×6 tháng) Phân NPK (10 ngày/1 lần×6 tháng) Phân trùn+Lân+WEHG (2 lần/6 tháng) Thuốc trừ sâu diệt cỏ (1 lần/1 tháng× tháng) PL3 10 Điện, nước tưới cây+sinh hoạt 11 Lao động chăm sóc (1 người/2000m²) 1000Kw×6 tháng 1.600đ/kwh 5người×9tháng 4.000.000đ/tháng chăm sóc bầu TỔNG CỘNG THÁNG 14.400.000đ 180.000.000đ ~479.760.000đ Tổng chi phí trờng măng tây từ hạt giống (giống nhập từ USA) ước tính từ trờng giống đến thi thu hoạch măng tây - tháng đầu/1 PL3 Bảng PL B2 Tởng chi phí trồng chăm sóc măng tây trồng giớng diện tích STT CƠNG VIỆC SỐ LƯỢNG ĐƠN GIÁ THÀNH TIỀN Cây giống F1 20.000 8.000đ/cây 160.000.000đ Làm đất+Vôi+Vỏ đậu+Tro trấu/Xơ dừa 30.000kg 1.000đ/m² 30.000.000đ Hệ thống tưới nhỏ giọt+Thoát nước hệ thống 30.000.000đ 40.000.000đ Phân vi sinh cải tạo đất lít×6 lần 140.000đ/lít 5.040.000đ 140kg×18 lần 12.000đ/kg 30.240.000đ 15.000kg×2 lần 2.000đ/kg 60.000.000đ lít×6 lần 140.000đ/lít 5.040.000 đ (1 lần/tháng×5 tháng) Phân NPK (10 ngày lần×6 tháng) Phân trùn+Lân+WEHG (3 tháng/lần) Thuốc trừ sâu diệt cỏ (1 tháng/lần×6 tháng) Điện, nước tưới cây+Sinh hoạt 1.000Kw×6 tháng 1.600 đ/kwh 9.600.000đ Lao động chăm sóc người×6 tháng 4.000.000đ 1người/tháng 120.000.000đ (1 người/2000m²) TỔNG CỘNG THÁNG ~459.920.000đ Tổng chi phí trờng măng tây từ giống (giống nhập từ USA) ước tính từ trồng giống đến thi thu hoạch măng tây - tháng đầu/1 PL4 Phụ lục C: Kết quả nghiên cứu Bảng PL C1 Kết quả tỉ lệ nảy mầm hạt măng tây sau tuần nuôi cấy Tỉ lệ nảy mầm hạt măng tây sau tuần nuôi cấy Duncan NT N Subset for alpha = 0.05 2 55.0000 65.0000 65.0000 65.0000 65.0000 65.0000 65.0000 70.0000 70.0000 75.0000 75.0000 80.0000 80.0000 90.0000 Sig .131 135 124 111 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000 Bảng PL C2 Kết quả tỉ lệ nhiễm của hạt măng tây sau tuần nuôi cấy Tỉ lệ nhiễm của hạt măng tây sau tuần nuôi cấy Duncan NT N Subset for alpha = 0.05 0000 0000 0000 PL5 0000 5.0000 2 5.0000 5.0000 5.0000 Sig .373 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000 PL5 Bảng PL C3 Kết quả sự phát sinh chồi từ mẫu đốt măng tây sau tuần nuôi cấy Số chồi/mẫu Duncan NT N Subset for alpha = 0.05 14 10 2.1000 15 10 2.3000 12 10 2.4000 13 10 2.7000 10 3.0000 10 10 3.2000 11 10 3.3000 Sig .130 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000 Chiều cao chồi (mm) Duncan NT N Subset for alpha = 0.05 13 25 10.6000 11 28 14.7500 15 22 17.4091 12 21 18.7619 14 20 21.3500 PL6 21.3500 10 28 24 Sig 31.1071 31.1071 33.7917 085 080 628 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 23.635 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed PL6 Bảng PL C3 Kết quả sự phát sinh rễ của chồi măng tây sau tuần nuôi cấy Số chồi/mẫu Duncan NT N Subset for alpha = 0.05 20 1.5000 19 10 1.6000 18 10 1.8000 17 16 Sig 4.5000 9.5000 827 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 8.108 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed PL7 ... pháp vi nhân giống 21 1.7.4 Ưu nhược điểm phương pháp vi nhân giống .21 1.8 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống Măng tây giới Vi? ??t Nam 22 1.8.1 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống Măng. .. ưu qui trình ni cấy in vitro măng tây nói riêng qui trình sản xuất giống măng tây thương mại nói chung CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về măng tây (Asparagus officinalis) Măng tây (Asparagus. .. nghiên cứu vi nhân giống Măng tây thế giới Với giá trị mà măng tây mang lại cộng với vi? ??c nhân giống truyền thống tốn thời gian hệ số nhân giống khơng cao vi? ??c ứng dụng kĩ thuật vi nhân giống