Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây hoa dã yên thảo (petunia hybrida)

TÓM TẮT Nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích nhân nhanh số lượng cây, tạo giống cây khỏe, sạch bệnh, chất lượng giống được đồng đều sau khi nuôi cấy.. Để có thể chủ động được số lư

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG

CÂY HOA DÃ YÊN THẢO (Petunia hybrida)

Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Thị Minh Thu

Sinh viên thực hiện : Mai Thị Thảo

Mã số sinh viên : 55131688

Khánh Hòa: 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG

CÂY HOA DÃ YÊN THẢO (Petunia hybrida)

GVHD : TS Phạm Thị Minh Thu SVTH : Mai Thị Thảo

MSSV : 55131688

Khánh Hòa, tháng 6/2017

LỜI CẢM ƠN

Đồ án tốt nghiệp “Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây hoa Dã yên thảo

(Petunia hybrida)” là một cột mốc quan trọng nhất trong những năm tháng sinh viên

của em Để có thể bắt đầu thực hiện và hoàn thành đồ án em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ Lời đầu tiên cho em được gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến những người đã giúp đỡ em hoàn thành đồ án này:

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, ban lãnh đạo cùng với quý thầy cô của Viện Công nghệ Sinh Học và Môi Trường đã tạo mọi điều kiện và nhiệt tình chỉ dẫn em trong suốt thời gian em học tập tại trường cũng như khi em làm đồ án

Em xin bày tỏ lòng biết ơn TS Phạm Thị Minh Thu đã định hướng ý tưởng, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, sửa luận văn và động viên trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần trong suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện đề tài

Nha Trang, tháng 06 năm 2017

Sinh viên

Mai Thị Thảo

TÓM TẮT

Nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích nhân nhanh số lượng cây, tạo giống cây khỏe, sạch bệnh, chất lượng giống được đồng đều sau khi nuôi cấy Bước đầu của

thí nghiệm là có thể tạo được vật liệu in vitro từ mẫu ngoài tự nhiên Đối với các mẫu

khác nhau thì thời gian và nồng độ của chất khử trùng cũng sẽ khác nhau Thời gian quá dài hoặc quá ngắn, nồng độ chất khử trùng quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả của quá trình khử trùng Mẫu lá sau khi được xử lý sơ bộ bằng ethanol 70%, được khử trùng bằng NaOCl 1% trong vòng 12 phút cho tỷ lệ mẫu sạch

và sống cao nhất là 60% Mẫu chồi sau khi được xử lý sơ bộ bằng ethanol 70%, được khử trùng bằng NaOCl 1% trong vòng 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và sống cao nhất là 80% Để tăng nhanh hệ số nhân chồi ta tiến hành tạo cụm chồi trên môi trường MS +

30 g/l đường sacharose + 8 g/l agar + 1,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA Để các chồi được tách nhau và chiều cao chồi đủ lớn thì ta tiến hành kéo dài chồi trên môi trường

MS + 30 g/l đường sacharose + 8 g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA Môi trường MS là một môi trường giàu dinh dưỡng và cũng là môi trường thích hợp cho sự

ra rễ của cây Dã yên thảo, những cây con trên môi trường này sau ba tuần nuôi cấy đủ

điều kiện để đưa ra vườn ươm Cuối cùng, cây Dã yên thảo nuôi cấy in vitro được đưa

ra ngoài tự nhiên có tỷ lệ sống cao nhất (50%) là trên môi trường gồm đất thịt + sơ dừa

+ trấu hun.Từ một mẫu lá in vitro ban đầu, sau năm tuần nuôi cấy trên môi trường tạo cụm chồi (MS + 1,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA) ta sẽ thu được 90 mẫu chồi in vitro Mẫu chồi in vitro tiếp tục được chuyển qua môi trường MS để tạo rễ Khi đã tạo thành

được một cây hoàn chỉnh thì ta có thể tiến hành chuyển chúng ra môi trường tự nhiên, 50% số cây con có sức sống ổn định trên môi trường bao gồm đất thịt có bổ sung thêm

sơ dừa và trấu hun

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về cây hoa Dã Yên Thảo 3

1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.2 Nguồn gốc và mô tả 3

1.1.2.1 Nguồn gốc 3

1.1.2.2 Mô tả 3

1.1.3 Một số loại hoa Dã yên thảo 4

1.1.4 Nhân giống và kỹ thuật chăm sóc Dã yên thảo 6

1.1.4.1 Nhân giống Dã yên thảo 6

1.1.4.2 Kỹ thuật chăm sóc hoa Dã yên thảo 7

1.1.5 Nhược điểm của hoa Dã yên thảo 7

1.2 Sơ lược về nhân giống in vitro 8

1.2.1 Lịch sử phát triển công nghệ tế bào thực vật 8

1.2.2 Ý nghĩa của việc NCMTBTV 8

1.2.3 Hiện trạng NCMTBTV ở Việt Nam 11

1.2.4 Một số thành tựu trong NCMTBTV ở Việt Nam 11

1.2.5 Thuận lợi và khó khăn trong NCMTBTV ở Việt Nam 12

1.2.6 Thành phần dinh dưỡng trong NCMTBTV 12

1.2.6.1 Nguồn Cacbon 13

1.2.6.2 Các loại muối khoáng 13

1.2.6.3 Vitamin 15

1.2.6.4 Các chất điều hòa sinh trưởng 15

1.2.6.5 Chất độn – thạch (agar) 19

1.2.6.6 Các chất bổ sung (than hoạt tính) 19

1.2.6.7 pH 20

1.3 Các nghiên cứu in vitro hoa Dã yên thảo 21

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

2.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 23

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2.2 Môi trường nuôi cấy 23

2.2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 23

2.3.2 Nội dung thí nghiệm 24

2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu in vitro từ lá và chồi 24

2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo bằng phương pháp tạo cụm chồi in vitro 26

2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Tạo rễ in vitro cây Dã yên thảo 27

2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Rèn luyện cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên 27

2.4 Phương pháp phân tích số liệu 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tạo vật liệu in vitro từ các bộ phận khác nhau của cây Dã yên thảo (lá, chồi) 29

3.3 Ảnh hưởng của CĐHTTTV đến giai đoạn nhân chồi 36

3.4 Tạo rễ in vitro cây Dã yên thảo 41

3.5 Rèn luyện cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên 48

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Kiến Nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên 5

Hình 1.2: Công thức hóa học của một số auxin 16

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình khử trùng đơn giản tạo vật liệu in vitro từ mẫu lá 25

Hình 3.1: Mẫu lá khử trùng bằng NaOCl 1% sau 7 ngày nuôi cấy 31

Hình 3.2: Mẫu chồi khử trùng bằng NaOCl 1% sau 7 ngày nuôi cấy 33

Hình 3.3: Chồi ngủ cây Dã yên thảo trên môi trường MS 35

Hình 3.4: Chồi ngọn cây Dã yên thảo sau một tuần nuôi cấy trong tối 36

Hình 3.5: Quá trình nhân nhanh bằng cách tạo cụm chồi ở cây Dã yên thảo 38

Hình 3.6: Mẫu lá trên môi trường tạo cụm chồi sau bốn tuần nuôi cấy 39

Hình 3.7: Cụm chồi cây Dã yên thảo trên môi trường kéo dài chồi sau hai tuần nuôi cấy 40

Hình 3.8: Sự tạo rễ của cây Dã yên thảo trên môi trường MS sau bốn tuần nuôi cấy 42

Hình 3.9: Sự tạo rễ in vitro của cây Dã yên thảo sau bốn tuần nuôi cấy 43

Hình 3.10: Sự ra rễ in vitro trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy 45

Hình 3.11: Sự tạo rễ in vitro trên môi trường MS bổ sung thêm 0,3 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy 45

Hình 3.12: Sự tạo rễ in vitro trên môi trường MS có bổ sung thêm 0,5mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy 46

Hình 3.13: Sự tạo rễ in vitro trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy 46

Hình 3.14: Sự tạo rễ in vitro trên môi trường MS có bổ sung thêm 1,5 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy 47

Hình 3.15: Sự tạo rễ in vitro trên môi trường MS có bổ sung thêm 2 % AC 47

Hình 3.16: Cây Dã yên thảo sau một tháng rèn luyện ngoài tự nhiên 50

Hình 3.17: Cây Dã yên thảo ra hoa ngoài tự nhiên 50

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Ảnh hưởng của CĐHSTTV đến khả năng tạo cụm chồi 26

Bảng 2.2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA và AC đến sự tạo rễ in vitro 27

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của giá thể đến sức sống của cây hoa Dã yên thảo 28

Bảng 3.1: Hiệu quả khử trùng đối với mấu lá cây Dã yên thảo 29

Bảng 3.2: Hiệu quả khử trùng đối với mẫu chồi cây Dã yên thảo 29

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP + NAA đến khả năng tạo cụm chồi 37

Bảng 3.4: Sự ra rễ của cây Dã yên thảo ở các nồng độ NAA khác nhau 41

Bảng 3.5: Sự ảnh hưởng của IAA và AC đến sự ra rễ của cây Dã yên thảo 44

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của giá thể tới sự rèn luyện cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên 49

MS: Murashige and Skoog

IAA:  - Indo accetic acid

NAA: Naphthylacetic acid

BAP: 6 benzyl amino purin

AC: Than hoạt tính

Tp HCM: Thành phố Hồ Chí Minh

NCMTBTV: Nuôi cấy mô tế bào thực vật

CĐHSTTV: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Cùng với sự phát triển trong đời sống vật chất, đời sống tinh thần và nhu cầu thưởng thức cái đẹp của con người cũng không ngừng tăng lên Trong đó hoa là một thứ vẻ đẹp đến từ thiên nhiên mà con người dễ dàng thưởng thức nhất, luôn là tâm điểm của mọi sự chú ý, nhất là vào những dịp lễ, tết, và các hoạt động văn hóa Hoa không những là một sự lựa chọn cho những ngày lễ ngày tết, hoa còn là một lựa chọn tốt cho việc giải tỏa tâm trạng Cuộc sống xã hội càng phát triển thì những lo toan, suy nghĩ hàng ngày càng nhiều khiến cho con người ta cảm thấy mệt mỏi, áp lực Nếu như không thể giải tỏa được những thứ đó kịp thời thì có thể gây nên trầm cảm hoặc nặng hơn Con người ta khi được thả hồn mình vào thiên nhiên, tự nhiên sẽ cảm thấy thư giãn và đem lại cảm giác thoải mái, lấy lại được cân bằng sau những giờ làm việc căng thẳng Việc ngắm nhìn những bông hoa trên ban công là một ý tưởng không tồi đối với những ai ở thành phố Có nhiều loại hoa được sử dụng để trồng trên ban công như hoa Lan, hoa Đồng Tiền,….trong số đó có hoa Dã yên thảo – nữ hoàng hoa ban công Hoa

Dã yên thảo được người ta lựa chọn trồng ngày càng nhiều bởi vì chúng rất dễ trồng, hoa của chúng rất đẹp Ban đầu hoa Dã yên thảo được nhân lên là do dùng hạt hoặc giâm cành Nhưng do giá thành vẫn còn cao, số lượng giống không đủ để đáp ứng được nhu cầu của thị trường nên việc trồng hoa trên ban công vẫn còn là một việc làm

xa sỉ đối với nhiều người Bằng những tiến bộ của khoa học kỹ thuật nói chung, phát triển của ngành nuôi cấy mô tế bào thực vật nói riêng đã có thể giải quyết được những nhược điểm của việc nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo bằng phương pháp truyền thống Để có thể chủ động được số lượng giống thì việc nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là hết sức cần thiết để đáp ứng nhu cầu của những người yêu hoa và phần nào giảm giá thành của hoa để có thể đưa hoa đến với tất cả mọi người Xuất phát từ những cơ sở đó tôi đã chọn và thực hiện

nghiên cứu đề tài : “Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây hoa Dã yên thảo

(Petunia hybrida)”

Mục đích

Tìm ra được công thức tốt nhất, để hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây hoa Dã yên thảo, để có thể tạo nên một cây hoa trong thời gian ngắn nhất, chất lượng tốt nhất với chi phí thấp nhất

Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát thời gian, nồng độ chất khử trùng đến khả năng sống của các bộ phận khác

nhau của cây Dã yên thảo (lá, chồi)

- Khảo sát ảnh hưởng của CĐHSTTV lên giai đoạn nhân chồi

- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên giai đoạn cấy chuyền kéo dài chồi

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên giai đoạn tạo rễ

- Khảo sát khả năng sống của cây hoa Dã yên thảo trên các giá thể khác nhau

Loài: Petunia hybrida

Tên thông thường: Petunia

Tên Việt Nam: Dã yên thảo, Dạ yên thảo, Yên thảo hoa, Dạ yến thảo

Đây là một loại cây lai mà tổ tiên có từ nhiều loài khác của chi Putenia, ví như:

P axillaris BSP (Large White Putenia) hoa dạng ống hẹp, màu trắng hoặc P violace

Lindl (Violet – Flowered Putenia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím Ngày nay các vườn nhà từ loài lai này còn cho ra các loại hoa kép hay cánh hoa xòe ngón rất đẹp

1.1.2.2 Mô tả

Dã yên thảo là một cây sống hàng năm, cây cao 15 – 30 cm Thân có lông mịn bao quanh, phân nhánh từ các nách lá thật, một nách lá có thể phân nhiều nhánh Lá đơn mọc đối hay luân phiên, mặt trên và dưới của lá có phủ lông mịn Lá hình oval,

mềm mại, mép nguyên không có răng cưa

Hoa cô độc, mọc trên một cọng dài 2 – 3 cm, đài hoa cao 1 – 2,5 cm Hoa lưỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dưới của ống vành Nang hủy ngăn thành hai mảnh, hạt nhiều và rất nhỏ Hoa Dã yên thảo nguyên thủy có hình phễu, tuy nhiên sự lai tạo

đã cho nhiều hình hoa khác nhau: hoa cánh đơn, hoa cánh kép với mép có viền và gợn sóng, mép dúng hình cung nhọn ở giữa Màu sắc hoa có thể thay đổi từ tía đến trắng, tía đến đỏ, đỏ đến cam, tím đến tím nhạt Đặc biệt nhiều loại hoa Dã yên thảo trắng thuần khiết hay xanh nhạt pha hơi đỏ (màu hoa oải hương) có mùi thơm dễ chịu

Dã yên thảo là cây hàng năm, nở hoa vào mùa hè Dã yên thảo ưa sáng, sẽ trở nên mảnh khảnh và trở nên ít hoa trong tối Cây thích hợp với điều kiện độ ẩm vừa phải, có thể sống trong điều kiện hơi khô nhưng không thích ứng với điều kiện ngập úng Cây thích hợp với khí hậu nóng ẩm, không chịu được nhiệt độ quá lạnh hoặc quá nóng Dã yên thảo trồng được trên hầu hết các loại đất, nhưng tốt nhất là đất màu mỡ, đất có pH

1.1.3 Một số loại hoa Dã yên thảo

Cánh có thể đơn lớp hoặc đa lớp, dạng gợn sóng Hoa có thể có sọc, đốm hoặc viền

quanh cánh với nhiều màu sắc khác nhau như đỏ tía, màu hoa cà, màu oải hương, hồng, đỏ, trắng, vàng Khi chạm vào cánh và cuống hoa thấy hơi dính và có mùi thơm rất khác biệt Dựa vào hình dạng hoa có thể chia hoa Dã yên thảo ngoài tự nhiên thành

ba loại:

Dã yên thảo đơn: Đây là loại đầu tiên được du nhập đến Việt Nam và cũng là loại phổ

biến nhất Hoa đơn sắc, có hình dáng giống như chiếc loa nhỏ, hoa nở dày và liên tục, cây thân thảo, phát triển bò ngang, chiều dài tối đa được khoảng 80 – 100 cm, thích

hợp trồng trong các chậu treo rủ Cây bụi, có rất nhiều hoa nhưng hoa chỉ có một lớp cánh, đường kính của hoa lên tới 5 – 7,5 cm, rất dễ trồng

Dã yên thảo kép: Hoa dạ yến thảo kép có màu sặc sỡ, bông to, gồm nhiều lớp cánh

xếp chồng lên nhau, 1 bông hoa có thể gồm 2-3 màu hòa trộn Cây thân bụi và cứng cáp hơn dạ yến thảo đơn, phát triển thẳng đứng, chiều cao 30-50 cm

Dã yên thảo lượn sóng: Đây là loại hoa dạ yến thảo mới nhất, được tạo ra do công

nghệ sinh học, hoa có hình dạng giống như dạ yến thảo đơn, thân cây cũng phát triển

bò ngang nhưng có thể dài đến 5m Đây là loại dạ yến thảo khỏe nhất, phát triển nhanh nhất, hoa nhiều và thơm nhất Giống như cái tên của mình, những cây dạ yến thảo biển sóng trưởng thành cho rất nhiều hoa, hoa tầng tầng lớp lớp giống như những cơn sóng biển cuộn trào, là cây thân leo, mùi thơm benzen đặc trưng vì trên cây có rất nhiều tinh dầu

a b c

Hình 1.1: Cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên

a Cây Dã yên thảo đơn

b Cây Dã yên thảo kép

c Cây Dã yên thảo lượn sóng

Chú ý: Đối với hoa Dã yên thảo kép thì thường sẽ bền hoa hơn hoa Dã yên thảo đơn

1.1.4 Nhân giống và kỹ thuật chăm sóc Dã yên thảo

1.1.4.1 Nhân giống Dã yên thảo

Có hai cách để nhân giống hoa Dã yên thảo: thứ nhất là nhân giống bằng phương pháp truyền thống (hạt và giâm cành), thứ hai là nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy

mô

- Nhân giống bằng phương pháp truyền thống:

Đối với việc trồng bằng hạt thì cần chú ý đến một số điểm như sau:

+ Dụng cụ gieo hạt: Có thể sử dụng khay, vỉ, chậu trồng,…

+ Làm đất kỹ trước khi gieo hạt, nên bổ sung thêm sơ dừa vào đất để tạo nên độ thông thoáng cho đất

+ Đủ ánh sáng khi gieo hạt

+ Gieo hạt sau 5 - 7 ngày thì sẽ cho ra cây con, sau khoảng 20 ngày thì có thể đem cây con

ra vườn ươm Sau một tháng có thể chuyển cây con ở trong vườn ươm ra ngoài thị trường

Ưu điểm của việc nhân giống bằng hạt là đơn giản, dễ dàng thực hiện, dụng cụ đơn giản dễ tìm, dễ vận chuyển Nhưng bên cạnh còn tồn tại một số nhược điểm như sau: Việc thu hoạch hạt của cây Dã yên thảo rất phức tạp, hạt nhỏ, khó bảo quản Tỷ lệ lên của hạt phụ thuộc hoàn toàn vào môi trường, tốn nhân công trong việc làm đất, chăm sóc cây con,…

Đối với việc trồng bằng cách giâm cành cần chú ý đến một số điểm sau:

+ Cây Dã yên thảo dùng để giâm cành thì cần sử dụng những cành khỏe, không bị bệnh, không thối thân Không nên lựa chọn cây Dã yên thảo quá già để giâm cành sẽ ảnh hưởng đến sức sống của cây và chất lượng của cây sau này

+ Tiến hành cắt cành và giâm cành vào lúc trời mát như vậy sẽ tránh làm cho cây bị héo, ảnh hưởng đến sự phát triển của cây sau này Nếu lúc cắt cành mà chưa thể tiến hành giâm cành luôn có thể cho cành vào trong lọ nhỏ có chứa một ít nước để tránh làm mất nước của cành giâm

+ Độ dài cành giâm phải tối thiểu là ba đốt lá, có thể tỉa bớt đốt lá cuối để dễ dàng cho thao tác giâm xuống giá thể Vết cắt nên cắt vát để cây có thể dễ dàng hút nước, chất dinh dưỡng và rễ cây dễ phát triển hơn

+ Nên bổ sung thêm sơ dừa và trấu hun vào trong đất dùng để giâm cành cũng như đất

để trồng cây Dã yên thảo

+ Sau 5 - 7 ngày là rễ đã phát triển tốt có thể đưa ra trồng

Ưu, nhược điểm của phương pháp giâm cành là đây là một phương pháp cổ điển, dựa vào kinh nghiệm người lao động là chính, tương đối dễ làm, dụng cụ đơn giản, tỷ lệ cây sống cao Nhưng với cách làm này không đủ để cung cấp cây hoa cho thị trường vì cần phải có một số lượng cành giâm rất lớn Bên cạnh đó, số lượng nhân công lao động cần dùng nhiều, tốn thời gian, và sẽ làm cho giá thành của hoa tăng lên trong khi chất lượng giống không đồng đều

- Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô: Khắc phục được những nhược điểm

trên của phương pháp nhân giống truyền thống (trồng bằng hạt, giâm cành) Phương pháp nuôi cấy mô đã tạo được giống có một chất lượng đồng đều, sạch bệnh, thời gian nhân giống ngắn nhưng tạo ra một số lượng cây lớn đủ cung cấp cho nhu cầu của thị trường Hoa tạo ra thì đẹp, bền màu, không cần nhân công quá nhiều, giảm giá thành cho người tiêu dùng Nhưng phương pháp này có thao tác tương đối phức tạp, dụng cụ, thiết bị đắt tiền,…nên cần những người có chuyên môn, kinh nghiệm, tinh thần trách nhiệm

1.1.4.2 Kỹ thuật chăm sóc hoa Dã yên thảo

- Thường ngắt ngọn khi cây còn nhỏ để gia tăng số lượng về mầm

- Không trồng trong chậu quá nhỏ, đất thịt, đất cát mịn vì sẽ không bền cây

- Khi cây quá già thực hiện cắt bớt phần thân ngọn, gìn giữ phần thân (nên thực hiện vào những ngày mát) Nếu muốn thay đất cho chậu hoa thì nên thực hiện vào mùa xuân, bổ sung thêm chất dinh dưỡng cây sẽ bật nhiều mầm, trong một thời gian ngắn lại tiếp tục ra hoa, bởi vì cây được trẻ hóa

- Tránh đặt chậu hoa ở những nơi có gió to vì sẽ làm tổn thương cây hoa

- Khi cây già cỗi có biểu hiện lá nhỏ, cành gầy, sắc hoa không thắm thì cần bổ sung thêm phân giàu đạm (có thể là nước tiểu pha loãng) và tổng hợp dinh dưỡng vi lượng

- Tưới nước thường xuyên vừa đủ, vì đất quá khô hay quá nhiều nước đều ảnh hưởng không tốt đến cây

1.1.5 Nhược điểm của hoa Dã yên thảo

- Là cây thân thảo, nhạy cảm đặc biệt với sự thay đổi nhiệt độ và thời tiết của mùa hè

- Không chịu được mưa nhiều, không chịu úng (chậu hoa nên để ở những nơi không chịu mưa trực tiếp)

- Bộ rễ rất nhạy cảm với nhiệt độ ngoại cảnh, trên 360C thì cần phải che chắn chậu hoa nếu không rễ sẽ bị nẫu

- Bị nhiễm nấm làm nhũn thối cổ rễ, hoặc khô teo lại tại gốc giữa những cành liên kết với thân chính do tổn thương khi đóng gói vận chuyển

- Cây sẽ chết ngay khi bị mất nước, cây bị mất nước có hiện tượng héo rũ, bổ sung nước lại cũng rất khó phục hồi như trước do cây có lá mỏng, hoa, lá nhiều, thân rỗng

Vì vậy cần quan tâm bổ sung nước một cách đầy đủ Có thể kiểm tra cây đã đủ nước hay chưa khá đơn giản chỉ bằng cách dùng một que tre cắm xuống bầu đất:

+ Que ướt: thừa nước

+ Que se ẩm: nước thích hợp

+ Que sáng màu: thiếu nước

1.2 Sơ lược về nhân giống in vitro

1.2.1 Lịch sử phát triển công nghệ tế bào thực vật

Được chia làm ba giai đoạn:

- Khởi đầu: 1902 – 1933: Haberlandt G (1902), nhà thực vật học người Đức, tìm ra

“Tính toàn năng của tế bào thực vật” Tuy nhiên, ông đã không thành công với các tế bào mô mềm, biểu bì do chúng không phân chia được

- Giai đoạn 1934 – 1965:

+ Phát hiện ra hormon tăng trưởng thực vật đầu tiên

+ Xây dựng được môi trường cơ bản: MS, N6, B5

- Giai đoạn 1965 – 1978 - đến nay: Phát hiện ra kỹ thuật nuôi cấy mô có ý nghĩa: tạo cây đơn bội, nuôi cấy tế bào trần,…

1.2.2 Ý nghĩa của việc NCMTBTV

Ưu điểm của NCMTBTV

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp

khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ

vô cùng hữu ích Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng

hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do: Các

phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson, 1964) Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm

giá trị thương phẩm Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray,1960)…

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 - 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở

Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm

nổi trội như:

Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012/ năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987)

Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế

Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952) Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh Bằng cách này, ở khoai tây, virus

A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958; Wang and Huang, 1975)

Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong

những điều kiện sinh thái nhất định Như ở cây cọ dầu, phải mất 10 - 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn Nhưng

bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500000 cây con

giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky,1970)

Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất liên tục Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen

Nhược điểm của NCMTBTV

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực vật

Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao

động có tay nghề

Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị soma,

đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi nuôi cấy

từ callus) Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng là

tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật

1.2.3 Hiện trạng NCMTBTV ở Việt Nam

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển những năm 1980 Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng Hiện nay có rất nhiều phòng nuôi cấy mô ở các Trường Đại học, các Viện Nghiên cứu, các Sở Khoa học và Công nghệ ở các Tỉnh, Thành phố Đà Lạt là nơi có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của tư nhân phục vụ cho công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ Đà Lạt đã trở thành một trung tâm sản

xuất rau, hoa quả lớn nhất của cả nước

1.2.4 Một số thành tựu trong NCMTBTV ở Việt Nam

Phương pháp chọn giống nuôi cấy mô đã được áp dụng lâu đời, bởi các nhà trồng hoa, các nhà chọn giống muốn nhân nhanh các giống đặc cấp cải thiện hiệu quả của từng thời kỳ chọn lọc

Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm và đưa giống ra sản xuất đại trà nhanh chóng hơn nhiều so với phương pháp truyền thống Nhờ kết quả này mà một người có thể sản xuất ra 130000 cây hồng/năm từ một gốc hồng Chỉ có ba người, Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm Giống và Kỹ thuật cây trồng Phú Yên có thể tạo ra

500000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng

Với công nghệ mới này năng xuất của người nông nghiệp tăng thêm 2500 lần – không có lĩnh vực công nghệ nào sánh nổi

Ở miền Bắc, nhân bản vô tính thực vật được ứng dụng ở hầu hết các nông, lâm sản, bảo tồn thành công giống gene của các loại gỗ quý: Cây Đăng lấy gỗ, Chè vang – một loại chè rất khó trồng Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống lúa chịu hạn DR1, nhân bản nhiều loại khoai tây, mía,… Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến

bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc vừa ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây Lô hội – một loại dược liệu quý của địa phương Từ năm

2001 đến nay, Sở Khoa học và Công nghệ Lạng Sơn hàng năm cung cấp đến hàng vạn

cây Bạch Đàn Europhylla

Bước sang 2008 công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới Nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan rừng quý

hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là loài Lan Hài hồng - loài lan hài có duy nhất hương thơm trên thế giới

Hiện nay, 100% nông dân Đà Lạt đã sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô

1.2.5 Thuận lợi và khó khăn trong NCMTBTV ở Việt Nam

Thuận lợi: Đảng và nhà nước luôn tạo mọi điều kiện giúp đỡ Đội ngũ cán bộ nghiên cứu ngày càng được nâng cao cả về chất lượng và số lượng Bên cạnh đó, có điều kiện làm việc học hỏi với cán bộ tổ chức nghiên cứu, đào tạo nước ngoài

Khó khăn: Nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ: Các đề tài/dự án được xây dựng và đưa vào triển khai trên cơ sở đề xuất của các cá nhân và đơn vị nghiên cứu khoa học tương tự như các đề tài/dự án khác do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn quản lý Chưa có các đơn đặt hàng và yêu cầu của các cơ quan quản lý của các Bộ/ngành địa phương và doanh nghiệp

1.2.6 Thành phần dinh dưỡng trong NCMTBTV

Đến nay đã có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây dựng

và thử nghiệm có kết quả Hầu hết, tất cả các loại môi trường đều gồm các nhóm chính sau đây:

6 Chất làm thay đổi trạng thái của môi trường – agar

7 Các chất bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy

Các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và

phân hóa của thực vật trong nuôi cấy in vitro Việc sử dụng môi trường nuôi cấy rất

khác nhau phụ thuộc vào một số yếu tố sau:

- Đối tượng cây trồng và mô nuôi cấy khác nhau sẽ có nhu cầu khác nhau về môi trường

- Mục đích nghiên cứu hoặc phương pháp nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hóa hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần, dịch lỏng tế bào, vi nhân giống,…)

- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng)

- Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy

1.2.6.1 Nguồn Cacbon

Đường sacharose là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả là các mẫu nuôi cấy có màu xanh có khả

năng quang hợp Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương

thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường Đường đóng góp khoảng 50 – 70% vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000) Nguồn cacbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là saccharose, nồng độ thích hợp là 2 - 3% Nồng độ đường này có thể thay đổi phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy, 0,2% đối với chọn dòng tế bào và tăng đến 12% để cảm ứng stress nước Tiếp đến là glucose và maltose cũng hay được đưa vào môi trường nuôi cấy Khi khử trùng đường saccharose bị thủy phân một phần, tạo điều kiện thuận lợi cho cây hấp thu Saccharose bị thủy phân tạo ra glucose và fructose, đầu tiên cây sẽ sử dụng glucose sau đó đến fructose Các loại đường khác như fuctose, lactose, galactose,…cũng đã được thử nghiệm nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng cho các trường hợp đặc biệt

1.2.6.2 Các loại muối khoáng

Các nguyên tố khoáng được dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô tế bào thực vật được phân chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng: Nhóm đa lượng

và nhóm vi lượng

- Nhóm đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm khoảng 0,1 - 1,5% khối lượng

khô của thực vật Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối vô cơ Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,…

+ Nito (N): Được sử dụng ở hai dạng NO3 và NH4 riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau Nito trong cây có chức năng là kiến tạo nên các acid amin, amit, protein, acid nucleic, nucleotid, các coenzyme,…

+ Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4, các dạng ion khác SO2 hoặc SO3thường kém tác dụng, thậm chí còn độc Lưu huỳnh trong cây có chức năng là thành

phần của cystein, cystin, metionin và protein Tham gia cấu tạo acid lipoic, coenzyme

A, thiamin pyrophosphat, glutathion, biotin, adenosin 5 phospho sulfat, 3 phosphat adenosin

+ Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu sử dụng phospho rất cao Phospho là một trong những thành phần cấu trúc phân tử nucleic acid Ngoài ra khi phospho ở dạng H2PO4- và HPO42- còn có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy Chức năng của phospho trong cây là tham gia cấu tạo của các phosphat đường, acid nucleic, các nucleotid, các coenzyme, các phospho lipid, acid phytic, …có vai trò chìa khóa trong các phản ứng

có liên quan đến ATP

- Nhóm vi lượng: Các nguyên tố này có hàm lượng nhỏ hơn 0,1% khối lượng chất

khô Các nguyên tố vi lượng bao gồm các nguyên tố là Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co…

+ Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia Sắt thường tạo phức hợp với thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi phức hợp này thường mất khả năng giải phóng sắt cho các nhu cầu trao đổi sắt trong tế bào Tốt nhất là nên sử dụng sắt ở dưới dạng phức chelet với citrate hoặc với EDTA (Ethylen Diamin Tetraacetic Acid)

Từ các phức chất này, Fe được giải phóng ra trong một phạm vi pH rộng Sắt trong cây

có chức năng thiết lập các cytochrom và các protein có chứa sắt không có cấu tạo hem

có liên quan đến quang hợp, hô hấp, cố định nito

+ Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các aminom acid tự do và DNA tăng lên, nhưng lượng RNA và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến kém phân bào Mangan có chức năng trong cây là cần cho hoạt động của một số ezyme dehydrogenase, decacboxylase, kinase, oxidase, peroxidase Có liên quan đến enzyme hoạt hóa caion khác và sự thải oxy trong quang hợp

+ Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây nên các biểu hiện như thừa auxin vì thực tế B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm Mô nuôi cấy có biểu hiện hóa mô sẹo nhiều, nhưng thường là loại mô sẹo xốp, mộng nước, kém tái sinh B có chức năng trong cây là phức hợp với manitol, mannan, acid poly manuronic, và các cấu tử khác của thành tế bào có liên quan đến ựu kéo dài tế bào và sự trao đổi acid nucleic

+ Molypden (Mo): Là ion đóng vai trò co - factor trong hệ thống nitrat reductase, như vậy Mo đóng vai trò trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật Mo có chức năng trong cây là tham gia vào nitrogenase, nitrat reductase, xanthin dehyrogenase

+ Đồng (Cu): Có chức năng trong cây là cấu tử của enzyme oxydase acid ascorbic, tyrosinase, monoaminoxydase, uricase, cytochromoxydase, phenolase, laccase, lactocyamin

1.2.6.3 Vitamin

Các viamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006) Các loại vitamin B1, B6, PP và

myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro Mặc dù các loại mô và

tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp vitamin, nhưng

thường không đủ về lượng, nên thường được bổ sung từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B

1.2.6.4 Các chất điều hòa sinh trưởng

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều CĐHTTTV là hết sức cần thiết CĐHSTTV là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật CĐHSTTV được sử dụng thông thường là các hormon thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự như chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene Trong đó, auxin và

cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất

- Auxin là phytohocmon đầu tiên trong cây được phát hiện vào năm 1934 Trong cây,

nó chính là acid  - indol acid (IAA) Con người đã tổng hợp rất nhiều chất có bản chất hóa học khác nhau nhưng chúng có hoạt tính sinh lý tương tự IAA gọi là auxin tổng hợp Có bốn loại auxin được sử dụng trong nuôi cấy mô là:

+  - Indo accetic acid (IAA) tồn tại tự nhiên

+ Naphthyl acetic acid (NAA)

+ 2,4 – Dichlorphenoxy acetic acid (2,4 – D)

+ Indoly butyric acid (IBA)

z - Indo accetic acid (IAA) Naphthylacetic acid (NAA)

Indolybutyric acid (IBA)

Hình 1.2: Công thức hóa học của một số auxin

Riêng IAA là auxin tự nhiên còn NAA; 2,4 – D; IBA là các auxin nhân tạo, thường thì auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các auxin oxy hóa auxin (auxin – oxydase) không có tác dụng Auxin là nhóm chất tăng trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng

để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được kết hợp với các chất của nhóm cytokine Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

- Kiểu tăng trưởng và phát triển cần nghiên cứu

- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

- Sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và ngoại sinh

Đặc tính của auxin: Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào

Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào Đặc điểm chung của auxin là tính chất phân chia tế bào Các hoocmon thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch rễ Nói chung các auxin được hòa tan trong ethanol hoặc NaOH loãng (Razdan 1994) Mặc dù, những chi tiết ở mức độ phân tử về hoạt động của auxin vẫn chưa được biết nhiều, nhưng một số nghiên cứu về di truyền và phân tử đã cung cấp những kết quả thú vị Trong những năm qua, một số gen mã hóa cho protein liên kết auxin (auxin binding proteins) đã được tạo dòng (cloning) và khảo sát các đặc điểm của chúng, và thông tin mới về gen cảm ứng auxin (auxin – induced gene) cũng đã thu được Auxin

có tác dụng hoạt hóa các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính dãn nở của tế bào trong phản ứng với áp suất trương Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ gene và kích thích quá trình tạo rễ

Các auxin có liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ…Đối với nuôi cấy

mô, auxin được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin cho môi trường ra chồi

Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin được tóm tắt như sau:

- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ức chế đến sự sinh trưởng của các chồi bên Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ phát sinh chồi nách, nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (chồi đỉnh bị ngắt bỏ) bằng một lớp keo

có chứa auxin thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng Cơ chế ức chế chồi đỉnh liên quan đến một chất điều hòa tăng trưởng khác là ethylene Auxin IAA kích thích chồi bên sản sinh ethylene làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh

- IAA đóng vai trò kích thích sự phân hóa của các mô dẫn

- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô

- Auxin có sự ảnh hưởng khác nhau đến sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ đối với môi trường

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)

- Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp

- Cytokinin: Lần đầu tiên được Skoog (khoảng 1950) phát hiện trong một thí nghiệm

chiết suất acid nucleic bị sơ suất Các cytokinin là dẫn xuất của các ademin, đây là hoocmon liên quan đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa trong nuôi cấy mô Các loại cytokynin được sử dụng thường xuyên là: N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin), 6-benzylaminopurine (BAP); 6- - dimethyl-aminopurine (2-iP) Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BAP và kinetin là các cytokinin nhân tạo Nói chung chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng

Một số hợp chất được phát hiện trong thời gian gần đây có hoạt tính gần giống cytokinin là N,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea Hiệu quả đặc biệt của các chất gốc urea lên sự sinh trưởng của mô thực vật cần phải được nghiên cứu thêm

- Kinetin được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau khi khử trùng

ở nhiệt độ cao hay đun sôi Trong cơ thể sống không có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa

Trong tự nhiên cũng tồn tại một hormone phân bào khác, Letham là người đầu tiên đã phân lập, tinh chế và cho kết tinh thành công hormone phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin (zea: ngô)

- Tương tự các cytokinin khác, zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin Trong thực tiễn nuôi cấy mô người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt, thường thay thế zeatin bằng kinetin hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đó là:

- 6-Benzylaminopurine (BAP): Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất

Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc

từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ

Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

- Kích thích phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

- Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này

1.2.6.5 Chất độn – thạch (agar)

Là một loại polysaccharide thu được từ một số loại tảo (chủ yếu là tảo đỏ Rhodophyta), trong đó có rau câu mọc ở vùng đầm phá Việt Nam Chúng có ưu điểm hơn các tác nhân tạo gel khác, bởi vì một số lý do sau đây:

- Thứ nhất: Gel của agar không phản ứng với thành phần của môi trường

- Thứ hai: Chúng không bị thủy phân bởi enzyme thực vật và duy trì ổn định ở tất cả các nhiệt độ nuôi cấy

Agar được sử dụng cho môi trường dinh dưỡng rắn lại, ở 800C thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và ở 400C chuyển sang trạng thái gel Khả năng ngậm nước của thạch là từ 6 – 12 g thạch/ 1 lít nước

1.2.6.6 Các chất bổ sung (than hoạt tính)

Có rất nhiều chất được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy mô như: Amino acid và các nguồn nitrogen khác; Nước dừa; Bột chuối; Một số hỗn hợp dinh dưỡng hữu cơ

phức tạp khác; Dịch chiết nấm men; Dịch thủy phân casein; Hỗn hợp amino acid nhân tạo; Than hoạt tính;…

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và tác dụng khử độc Khi

bổ úng than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy thì sẽ kích thích tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây thường xuyên nhưng lại có tác dụng cản đối với thuốc lá, đậu nành, trà mi Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng lên ba mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi trường Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do hút chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường NAA, kinetin, IAA, BAP, 2iP liên kết với than hoạt tính Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy Than hoạt tính thường được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,5 - 3,0% (w/v)

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy đã kích thích sinh trưởng và phân hóa

ở một số loài ha lan, cà rốt, cây thường xuân, cà chua Ngược lại, nó gây ức chế ở

thuốc lá, đậu tương và một số loài thuộc chi Camellia Nói chung, than hoạt tính đươc

rửa acid và đươc trung hòa trước khi được bổ sung nó ở nồng độ 0,5 - 3,0% vào môi trường nuôi cấy Than hoạt tính cũng có tác dụng làm giảm độc tố bằng cách đào thải chất độc (ví dụ: phenol) được tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại

1.2.6.7 pH

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy Trong khi chuẩn bị môi trường thì pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH từ 5,0 – 6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong khi pH thấp hơn sẽ làm ảnh hưởng đến

quá trình đông của agar

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình hấp thu chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào Vì vậy đối với từng loại môi trường nhất định và đối với từng trường hợp cụ thể của loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường

về mức ổn định ban đầu

Đối với mô sẹo của từng loài cây, pH ban đầu thường là 5,5 – 6,0 Sau bốn tuần nuôi cấy pH có thể đạt đến 6,0 – 6,5 Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hoặc tế bào trần trọng lượng môi trường nhỏ thì việc điều chỉnh pH là một việc bắt buộc

1.3 Các nghiên cứu in vitro hoa Dã yên thảo

Kết quả nghiên cứu của Trần Nguyên Vũ và ctv (1999) cho thấy các đoạn thân

và lá của chồi non đang sinh trưởng trong điều kiện in vitro được nuôi cấy trên môi

trường MS có BA hoặc BA và NAA Kết quả được ghi nhận trên hoa kép và hoa đơn sau mười ngày nuôi cấy Tỷ lệ (%) thành lập chồi cao nhất là từ mẫu lá ghi nhận trên môi trường MS + 0,5 M BA đối với giống hoa kép và MS + 2 M BA đối với giống hoa đơn Chồi được tái tạo từ lóng thân của hai giống trên môi trường MS + 0,5 M

BA + 0,05 M NAA Theo Kedong (2001) môi trường MS + 1 mg/l BA cũng rất thích hợp cho việc tái sinh chồi từ lá của cây Dã yên thảo Kết quả nghiên cứu của Hassan

và cs (2010) cho thấy trong thí nghiệm nhân chồi thì số lượng chồi trung bình cao nhất với môi trường MS + 0,8 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA Đối với thí nghiệm tái sinh chồi

từ mẫu lá của hoa Dã yên thảo thì tỷ lệ chồi được tái sinh là 45% đã được quan sát trong môi trường MS + 2,0 mg/l BA Theo Trần Quốc Cường (2011), môi trường MS + 2,0 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA cho tỷ lệ chồi tái sinh từ lá là tốt nhất 88,9% và cho số chồi cao là (4 chồi) Môi trường MS + 0,2 mg/l TDZ cho tỷ lệ tái sinh chồi từ lá là 100% Số chồi tái sinh cao nhất là 9,9 chồi, chiều cao chồi cao nhất là 2,3 cm Theo kết quả nghiên cứu của Anas Yousef Abu-Rayya (2010), sự kết hợp của nồng độ BA (0; 0,1; 0,4; 0,8 mg/1) với nồng độ NAA (0,0; 0,1 mg/1) được sử dụng với môi trường

MS cơ bản Hai nguồn mẫu được sử dụng là lá và chồi, thu được tỷ lệ tái sinh từ lá là thấp nhất Chồi cao nhất (1,7) thu được với môi trường MS cung cấp 0,4 mg/1 BA và 0,1 mg/l NAA Tuy nhiên, trong trường hợp số lượng chồi khai thác cao hơn thu được với 0,8

mg /l BA và 0,1 mg/1 NAA

Kết quả nghiên cứu của Trần Nguyên Vũ và ctv (1999) cho thấy việc bổ sung nước dừa 5 % có tác dụng kéo dài chồi non Cây con có bộ rễ khỏe mạnh được trồng thủy canh ½ MS từ 7 – 10 ngày trước khi đưa ra vườn ươm Theo Huỳnh Ngọc Minh Tâm (2005) đã cho thấy môi trường tốt nhất để nhân giống cây Dã yên thảo gồm có: nước cá, nồng độ đường 50 g/l và auxin được chọn là NAA Điều kiện thuần dưỡng có

tỷ lệ sống cao nhất là trùm bọc nilon kín trong vòng một tuần

Theo kết quả nghiên cứu của Kortessa Dimasi-Theriou và cs thì ảnh hưởng của ethylene lên sự hình thành chồi và rễ từ lá cây Dã yên thảo như sau: Giảm ethylene nội sinh bằng cách thêm KmnO4 một chất hấp thụ ethylene sẽ làm giảm số lượng chồi Tương tự, bổ sung Ag+

, một chất ức chế ethylene cũng dẫn đến sự hình thành chồi kém Bổ sung vào môi trường 0,01 – 10 ppm ethylene làm tăng số lượng chồi nhưng không ảnh hưởng đến chiều cao và khối lượng tươi Ethylene nồng độ 10 ppm gây nên

sự hình thành rễ ngẫu nhiên đáng kể, trong khi ở nồng độ thấp (0,1 – 1,0 ppm) nó không ảnh hưởng đến sự hình thành rễ

Tác động của nhiều yếu tố bao gồm đồng hồ sinh học nội sinh, ánh sáng, và nhiệt

độ đối với sự hình thành và phát tán của VPBs (Các phenylpropanoid và benzenoit dễ bay hơi của hoa (VPBs)), những chất dễ bay hơi trong hoa của Petunia × hybrida (Mitchell Diploid và cs, 2010) Đồng hồ sinh học nội sinh đã được đề xuất như một yếu tố quan trọng nhất điều chỉnh sự phát xạ nhịp nhàng của VPBs và sự biểu hiện của các gen cấu trúc liên quan đến con đường sinh tổng hợp đầu tiên của các VPB nhưng không ảnh hưởng đến mức biểu hiện của các gen cấu trúc liên quan đến con đường cuối cùng và các cơ quan điều tiết liên quan đến VPB Trái ngược với ánh sáng, nhiệt

độ là một yếu tố liên tục ảnh hưởng đến sự phát thải của các VPB Phát xạ VPBs có thể được ức chế trong một thời gian ngắn bằng cách tăng nhiệt độ

Kết quả về quy trình nhân giống cây Dã yên thảo của Trung tâm Ứng dụng Tiến

bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Bến Tre như sau: Tạo vật liệu in vitro bằng cách xử lý

sơ bộ đế hoa trong ethanol 70% trong vòng 1 phút, khử trùng bằng Javen 3% trong vòng 15 phút Sau đó tạo cụm chồi bằng môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA Tái sinh cây trên môi trường ½ MS có bổ sung 0,1 – 0,15% than hoạt tính

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ ngày 18.02.2017 – 03.6.2017 tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật Trường đại học Nha Trang

2.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây hoa Dã yên thảo (Petunia hybrida) màu hồng thu ngoài môi trường tự nhiên

2.2.2 Môi trường nuôi cấy

Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy người ta không cân hoá chất mỗi lần pha mà thường chuẩn bị trước dưới dạng các dung dịch đậm đặc (hay stock), sau

đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng Các stock này thường được bảo quản dài ngày trong

tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu

- Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng gồm có: NAA, BAP, IAA

áp suất hơi nước bão hòa là 103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 1210C Ở nhiệt

độ 1210

C, hầu hết các sinh vật có trong môi trường đều bị tiêu diệt, kể cả ở dạng bào

tử

2.2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng / 8 giờ tối

Nhiệt độ: 25 20

C Cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, 50

mẫu/công thức

2.3.2 Nội dung thí nghiệm

2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu in vitro từ lá và chồi

Tiến hành chọn những cây Dã yên thảo khỏe mạnh, không bị sâu bệnh, không quá già,

cũng như không bị thối làm mẫu ban đầu dùng để khử trùng tạo vật liệu in vitro Chồi

Dã yên thảo được cắt dài khoảng 6 – 8 cm, nên loại bỏ bớt lá non Rửa mẫu dưới vòi nước máy cho sạch, tách riêng mẫu thành hai phần: phần lá và phần chồi Sau đó rửa mẫu trong nước xà phòng loãng trong thời gian 5 phút, tiếp tục rửa lại bằng nước cất 3-4 lần, đưa mẫu vào trong box cấy

Trong box cấy vô trùng: Rửa lại lá và chồi bằng nước cất vô trùng Tiếp đến cho mẫu vào trong ethanol 70% trong vòng 5 phút Sau đó chuyển mẫu sang lọ chất khử trùng với thời gian và nồng độ thí nghiệm Cuối cùng rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 2 lần, làm khô mẫu và cấy vào môi trường dinh dưỡng đã chuẩn bị trước (môi trường

MS hoặc MS + 1,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA)