Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây hoa chuông (sinningia speciosa)

Trong khi đó, hoa chuông Sinningia speciosa cũng có thể được nhân giống in vitro khá đơn giản, có phản ứng khá nhanh và cho thấy đặc điểm phát triển cũng như việc tái sinh chồi với

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

-o0o -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG

CÂY HOA CHUÔNG (Sinningia speciosa)

Giảng viên hướng dẫn : TS PHẠM THỊ MINH THU

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN VĂN TIẾN

Mã số sinh viên : 55131960

Lớp : 55SH1

Khánh Hòa: 2017

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-o0o -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG

CÂY HOA CHUÔNG (Sinningia speciosa)

GVHD: TS Phạm Thị Minh Thu SVTH: Nguyễn Văn Tiến

MSSV: 55131960

Khánh Hòa, tháng 6/2017

==============================================================

LỜI CẢM ƠN

Là một trong những sinh viên thuộc viện Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường, lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn đến toàn thể Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo và các thầy cô tại văn phòng khoa đã tạo mọi điều kiện cho em nói riêng và tập thể lớp 55 CNSH nói chung trong suốt quá trình, thời gian học tập tại trường

có nhiều cơ hôi được học tập, thực hành kỹ năng và rèn luyện bản thân Và em luôn tự hào khi được là sinh viên của trường

Đồng thời em xin cảm ơn đến toàn thể quý thầy cô Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã hết mình chỉ bảo, giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức cũng như kỹ năng cho em trong suốt thời gian học tập và thực hành tại trường

Em chân thành cảm ơn cô Phạm Thị Minh Thu và cô Khúc Thị An đã tạo điều kiện cho em được thực tập tại trường ĐH Nha Trang, cảm ơn cô đã dành nhiều thời gian và công sức để hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian làm và hoàn thiện đề tài tốt nghiệp của mình

Em xin chân thành cảm ơn tất cả các anh, chị phòng thí nghiệm công nghệ cao đã tạo điều kiện và giúp đỡ đồng thời đã bỏ qua cho những sai sót, phiền phức mà chúng

em đã gây ra Em xin chúc các anh chị luôn luôn mạnh khỏe và vui vẻ

Tôi cũng đặc biệt cảm ơn những người bạn cùng lớp và hai em Giang, Kiều đã cùng làm việc với tôi Tuy chúng tôi đã có những tranh luận bất đồng với nhau nhưng nhờ vậy mà chúng tôi đã thân thiết hơn, hiểu nhau hơn sau những tháng làm việc với nhau và giúp đỡ nhau tận tình Cảm ơn các bạn và các em đã trao cho tôi khoảng thời gian quý giá tự hào này mà không biết có cơ hội nào lăp lại lần nữa hay không

Cảm ơn những người tôi yêu thương nhất chính là gia đình tôi Con xin cảm ơn ba

mẹ đã cố gắng làm việc cực khổ để tạo mọi điều kiện cho việc học tập cũng như nơi ở

xa nhà được tốt nhất Cảm ơn anh chị đã giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập xa nhà Cảm ơn toàn thể gia đình đã cho tôi một gia đình thật sự được gọi là hạnh phúc và ấm áp vô cùng

Cảm ơn tất cả mọi người và chúc toàn thể được hạnh phúc luôn vui vẻ mạnh khỏe!

==============================================================

TÓM TẮT

Hoa chuông (Sinningia speciosa) có nguồn gốc nhiệt đới (thuộc khu vực rừng nhiệt đới của Brazil ở Nam Mỹ) được người châu Âu chọn và tạo ra nhiều giống hoa mới ngày nay là một trong những loài hoa nhập nội có giá trị về kinh tế cũng như đáp ứng

được xu hướng ưa thích các loài hoa mới lạ của người chơi hoa và sự quan tâm của người trồng hoa

Cây hoa chuông trong tự nhiên có thể được nhân giống bằng hạt, đoạn thân, lá và

củ Phương pháp nhân giống truyền thống này cho hệ số nhân thấp, cần số lượng lớn cây bố mẹ, tốn thời gian, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết … Ngày nay, phương pháp nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành phương pháp nhân giống rất có hiệu quả với hệ số nhân giống cao, cây giống tạo ra hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về kiểu hình, ổn định về tính di truyền và có thể sản xuất được ở quy

mô lớn

Nghiên cứu này, nhằm với mục đích đưa ra phương pháp, qui trình để nhân rộng, nhanh chóng thông qua sự hình thành chồi ngẫu nhiên từ các bộ phận khác nhau (lá,

đoạn thân mang mắt ngủ, chồi đỉnh) Giai đoan đầu tiên là việc tạo vật liệu in vitro từ

mẫu tự nhiên Các mẫu cấy sau khi được sử lý sơ bộ sẽ được khử trùng bằng cồn 70% (2 phút), NaOCl 2% (10 phút) cho kết quả tốt nhất đối với đoạn thân mang mắt ngủ với tỷ

lệ tái sính mẫu đạt 36,36% trên môi trường MS bổ sung 0,50 mg/l BAP Môi trường nuôi cấy tối ưu giúp cho hệ số nhân chồi, chất lượng chồi tốt nhất là MS cơ bản có chứa 1,00 mg/l BAP + 0,10 mg/l NAA với mẫu cấy là đoạn thân mang mắt ngủ cho hệ số nhân chồi đạt 6,60 (lần) Môi trường khoáng MS thích hợp cho sự phát triển của chồi trong giai đoạn cấy chuyền Quá trình tạo rễ trên môi trường MS bổ sung 0,20 mg/l

NAA cho kết quả tốt nhất sau 3 tuần nuôi cấy để tạo cây giống in vitro hoàn chỉnh Giá

thể đất - trấu - xơ dừa tỷ lệ (1: 1: 1) giúp tăng tỷ lệ sống lên đến 91,67%, đồng thời giúp cây có thể phát triển tốt nhất, cho ra hoa sau 50 ngày chăm sóc

Với việc áp dụng qui trình trên từ một bình môi trường nuôi cấy chứa 3 mẫu đoạn thân mang mắt ngủ sau 4 tuần nuôi cấy sẽ có hệ số nhân chồi là 6,60 (lần) cũng như số

lượng cây con in vitro hoàn chỉnh Số cây thương phẩm đạt được gấp 6,05 (lần) so với

số lượng mẫu cấy ban đầu

==============================================================

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu 4

1.1.1 Phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm thực vật học 5

1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa chuông 6

1.1.4 Tình hình sản xuất và giá trị thương mại 7

1.2 Các phương pháp nhân giống truyền thống cây hoa chuông 9

1.2.1 Phương pháp nhân giống hữu tính 9

1.2.2 Phương pháp nhân giống vô tính 10

1.3 Phương pháp nhân giống in vitro 10

1.3.1 Sơ lược về nhân giống in vitro 10

1.3.2 Ưu nhược điểm của nhân giống in vitro 11

1.3.3 Các giai đoạn trong qui trình nhân giống in vitro 14

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nhân giống in vitro 17

1.3.5 Vai trò, tác dụng của các chất ĐHTTTV 21

1.4 Các nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro Hoa chuông (Singningia speciosa) trong và ngoài nước 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

2.1.1 Thời gian 27

2.1.2 Địa điểm 27

2.2 Đối tượng nghiên cứu 27

2.3 Nội dung nghiên cứu 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

==============================================================

2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát qui trình nhân giống in vitro cây hoa chuông 27

2.4.2 Nội dung 2: Chăm sóc cây con ngoài vườn ươm 35

2.5 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định 37

2.5.1 Các chỉ tiêu trong nuôi cấy in vitro 37

2.5.2 Các chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển 38

2.5.3 Phương pháp đánh giá chất lượng chồi in vitro và cây giống in vitro ……… 38

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Khảo sát qui trình nhân giống in vitro cây hoa chuông 39

3.1.1 Khảo sát thời gian khử trùng trên các bộ phận khác nhau (lá, đoạn thân mang mắt ngủ, chồi đỉnh) 39

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHTTTV (BAP, NAA, IAA) lên sự phát sinh chồi bất định từ các bộ phận khác nhau (lá, đoạn thân mang mắt ngủ, chồi đỉnh) 43

3.1.3 Khảo sát môi trường khoáng lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi… 52

3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính và auxin (NAA, IAA) lên sự phát sinh rễ 54

3.2 Chăm sóc cây con ngoài vườn ươm 58

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

4.1 Kết luận 62

4.1.1 Xác định được qui trình nhân giống cây hoa chuông in vitro 62

4.1.2 Xác định được giá thể phù hợp cho ươm cây in vitro ở giai đoạn vườn ươm … 62

4.2 Kiến nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 67

==============================================================

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây hoa chuông 6

Hình 1.2 Sự phong phú về màu sắc hoa chuông 9

Hình 1.3 Công thức hóa học của một số chất ĐHTTTV 24

Hình 2.1 Nguyên liệu vào mẫu 28

Hình 2.2 Mẫu cây được tái sinh từ thí nghiệm 1 30

Hình 2.3 Mô chồi được tái sinh từ thí nghiệm 2 32

Hình 2.4 Mẫu cây sau khi cấy chuyền ở thí nghiệm 3 34

Hình 2.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của các loại giá thể khác nhau lên tỷ lệ sống của cây 36

Hình 3.1 Sự tái sinh của mẫu (đoạn thân mang mắt ngủ) sau 3 tuần (a), 4 tuần (b) nuôi cấy 41

Hình 3.2 Mẫu nhiễm nấm sau 2 tuần cấy mẫu 42

Hình 3.3 Mẫu chết hóa đen sau 3 tuần cấy mẫu 42

Hình 3.4 Sự phát sinh chồi sau 4 tuần trên các nồng độ BAP khác nhau 45

Hình 3.5 Sự phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy trên các nồng độ BAP khác nhau 46

Hình 3.6 Một số mẫu chồi đạt chất lượng tốt ở các nồng độ khác nhau 48

Hình 3.7 Một số mẫu cây đạt chất lượng tốt ở các nồng độ khác nhau 51

Hình 3.8 Kết quả cấy chuyển trên môi trường khoáng MS và MS 1B sau 4 tuần 53

Hình 3.9 Kết quả ảnh hưởng của MS0 và than hoạt tính lên sự phát triển của rễ sau 4 tuần 55

Hình 3.10 Kết quả ảnh hưởng của NAA lên sự phát triển của rễ sau 4 tuần 57

Hình 3.11 Kết quả ảnh hưởng của IAA lên sự phát triển của rễ sau 4 tuần 56

Hình 3.12 Kết quả ảnh hưởng của giá thể lên tỷ lệ sống và phát triển của cây theo thứ tự các loại giá thể từ 1 – 5 sau 4 tuần 60

Hình 3.13 Sơ đồ qui trình kỹ thuật nhân giống in vitro cây hoa chuông bằng nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ 61

vật liệu khởi đầu trong nuôi cấy in vitro cây hoa chuông 40

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP lên sự phát sinh chồi bất định từ đoạn thân mang

mắt ngủ và kích thước hình thái chồi sau khi phát sinh 44 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của (BAP và NAA) lên sự phát sinh chồi bất định từ đoạn

thân mang mắt ngủ và kích thước hình thái chồi sau khi phát sinh 47 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của (BAP và IAA) lên sự phát sinh chồi bất định từ đoạn

thân mang mắt ngủ và kích thước hình thái chồi sau khi phát sinh 49 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các chất ĐHTTTV (BAP, NAA, IAA) lên sự phát sinh

chồi bất định từ đoạn thân mang mắt ngủ cho kết quả tốt nhất ở các khảo sát trong giai đoạn nhân nhanh chồi 52 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự phát triển của chồi 52 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của MS0, than hoạt tính và (NAA và IAA) lên sự hình thành

và phát triển của rễ 54 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của các loại giá thể và cách phối trộn lên tỉ lệ sống và sự

phát triển của cây con ngoài vườn ươm 59

==============================================================

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ĐHTTTV – Điều hòa tăng trưởng thực vật

ATP - Adenosin triphotphat

BAP - 6-benzyl adenine phosphat

ABA - Axit abscicic

IAA - Axit indolylacetic

IBA - Axit indolyl butyric

lux - đơn vị đo cường độ ánh sáng

MS - môi trường Murashige và Skoog

NAA- naphthylacetic acid

2, 4 - D - Axit diclorophenoxy acetic

TPHCM – Thành phố Hồ Chí Minh

==============================================================

LỜI MỞ ĐẦU

Nhân giống cây trồng có ý nghĩa và tầm quan trọng vô cùng to lớn với mục đích cao nhất là tạo ra được số lượng lớn các cá thể cây giống từ lượng mẫu giống hạn chế ban đầu Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật cũng như công nghệ sinh học và các kỹ thuật nuối cấy mô Đã tạo ra nhiều nguyên liệu hóa chất cũng như tạo được điều kiện nuôi cấy lý tưởng nhất, giúp cho hệ số nhân chồi không chỉ dừng lại ở con số một hạt, một cành lên một cây mà có thể tăng đến con số 100, 1000, 2000… hoặc tăng cao hơn Với mức độ tăng số lượng theo lũy thừa sẽ đáp ứng đầy đủ việc cung cầu của giống cây cần thiết

Từ trước đến nay, hoa cảnh được xem như là một loại cây cảnh có nhu cầu sử dụng lớn cho con người cũng như các loại cây cảnh các loại Thay vào đó, nhu cầu của con người ngày càng thay đổi theo nhiều chiều hướng khác nhau Trong đó có sở thích làm đẹp và trang trí bằng hoa cảnh

Hoa chuông (Sinningia speciosa) là giống hoa thuộc họ Tai voi (Gesneriaceae),

bộ hoa môi (Lamiales), có nguồn gốc nhiệt đới (thuộc khu vực rừng nhiệt đới của Brazil

ở Nam Mỹ) Là một trong những loại hoa được nhập về Việt Nam và khá được ưa thích trong thời gian gần đây Hoa có thời gian sinh trưởng ngắn, có thể ra hoa trong vòng 5 tháng khi gieo bằng hạt Đặc biệt, vì cố nguồn gốc nhiệt đới nên hoa khá phù hợp với điều kiện khí hậu của nhiều vùng tại Việt Nam như: Thanh Hóa, Thừa Thiên Huế, Thành phố Hồ Chí Minh, Tiền Giang

Tại Việt Nam, hoa chuông là một trong những loại hoa mới được nhập nội với nhiều ưu điểm: màu sắc, hình dáng hoa đa dạng, hương thơm thanh dịu, độ bền tự nhiên của hoa dài và được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như: trang trí làm đẹp nhà cửa, văn phòng hay kể cả công viên Chính vì nhiều ưu điểm đó, hoa chuông đã nhanh chóng trở thành một trong những loại hoa thương phẩm về kinh tế và tinh thần, đáp ứng được nhiều nhu cầu ưa thích các loài hoa mới lạ của người chơi hoa và nỗ lực tạo ra giống hoa tốt nhất của người trồng hoa

Hoa chuông tự nhiên có thể được trồng bằng hạt, đoạn thân, lá hoặc củ Những phương pháp nhân giống truyền thống này vừa cho hệ số nhân thấp đồng thời lượng giống có chất lượng không đồng đều, kèm theo nhiều mối nguy về nhiễm bệnh, tốn thời

có thể sản xuất được ở qui mô lớn đồng thời cung cấp lượng giống tốt nhất và đồng đều nhất phù hợp với yêu cầu con người

Gần đây, đã có nhiều báo cáo khác nhau về qui trình nhân giống in vitro hoa chuông

ở các trường đại học khác nhau cũng như sự sinh trưởng ở các vùng miền khác nhau cho thấy được sự thích ứng của hoa là khá rộng, trong đó có luận án tiến sĩ Lã Thị Thu Hằng năm (2012); Lê Nguyễn Lan Thanh năm (2014)

Thành phố Nha Trang hiện nay có diện tích tự nhiên là 251 km² là một thành phố ven biển và là trung tâm chính trị, kinh tế, văn hóa, khoa học kỹ thuật và du lịch của tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam Nha Trang có khí hậu nhiệt đới xavan chịu ảnh hưởng của khí hậu đại dương Khí hậu Nha Trang tương đối ôn hòa, nhiệt độ trung bình năm là 26,3⁰C Có mùa đông ít lạnh và mùa khô kéo dài Mùa mưa lệch về mùa đông bắt đầu

từ tháng 9 và kết thúc vào tháng 12 dương lịch, lượng mưa chiếm gần 80% lượng mưa cả năm (1.025 mm) Khoảng 10 đến 20% số năm mùa mưa bắt đầu từ tháng 7, 8 và kết thúc sớm vào tháng 11

Trong khi đó Trường Đại học Nha trang là một trong những trường có diện tích rộng và đang trong quá trình cải tạo cảnh quan cho trường với mục đích nhằm tăng sự hấp dẫn cho các người trong trường mà cả với người ngoài trường, và việc sử dụng cây hoa cảnh để phục vụ cho trường là rất cần thiết và cần thực hiện ngay, không những về chủng loại mà cả số lượng cần phải lớn Theo con số thống kê của Trung tâm phục vụ trường học - Thầy Nguyễn Đình Khương cho biết, mỗi năm nhà trường phải tốn khá nhiều tiền cho việc mua giống cây trồng từ các cơ sở để phục vụ cho nhu cầu cảnh quan toàn trường Nhưng thay vào đó lượng giống cây không được ổn định phụ thuộc nhiều

==============================================================

vào khí hậu cũng như lượng cung cấp từ cơ sở kèm theo các mầm bệnh do nhân giống bằng các phương pháp truyền thống là chính

Trong khi đó, hoa chuông (Sinningia speciosa) cũng có thể được nhân giống in

vitro khá đơn giản, có phản ứng khá nhanh và cho thấy đặc điểm phát triển cũng như

việc tái sinh chồi với các điều kiện nuôi cấy in vitro và dể dàng và đạt hiệu quả cao bằng

các phương pháp khác nhau Trong đề tài này chúng tôi thiết lập một qui trình nhân giống nhanh bằng cách tạo chồi bất định từ cá bộ phận của cây trưởng thành như (lá, thân, cuống, chồi đỉnh) trên các môi trường có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật phù hợp cho cây phát triển

Việc này đem lại nhiều lợi ích to lớn vừa có thể giải quiết được nguồn hoa cảnh cho trường, tiết kiệm chi phí đồng thời mang đến tiềm năng kinh tế cũng như việc cung cấp giống hoa cảnh cho thị trường Khánh Hòa sau này

Xuất phát từ những vấn đề đã nêu trên, tôi thực hiện đề tài “Hoàn thiện qui trình

vi nhân giống cây hoa chuông (Sinningia speciosa)

==============================================================

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hoa chuông có nguồn gốc từ Brazil - là một trong những loại hoa nội thất có hình dáng lạ, màu sắc đa dạng, rất được ưa chuộng trên thế giới và được tìm thấy đầu tiên tại rừng nhiệt đới Brazil năm 1785 Là một trong những loại hoa nhập nội tương đối mới lạ trên thị trường hoa cảnh Việt Nam, nên hoa chuông có giá thành cao, nguồn cung cấp không ổn định, độ bền lại giảm do thay đổi điều kiện sống

Cho đến năm 1815, hoa được trồng ở Anh và được gọi tên là Gloxinia speciosa

năm 1817 từ một người làm vườn ở Anh có tên Conrat Lddiges Năm 1825, hoa chuông

được đổi tên thành Sinningia speciosa do được xác định thuộc loài S speciosa Năm

1877, nhà thực vật học Hiern xác định thấy hoa có nhiều màu khác nhau và có cấu trúc đối xứng Cho đến ngày nay hoa chuông vẫn giữ nguyên tên cũ và có tên khoa học là

Sinningia speciosa

Các loại hoa chuông hiện nay hầu như được tạo ra nhờ sự lại tạo bởi các nhà vườn

Scotland từ hai loài hoa Sinningia speciosa và Sinningia maxima ở rùng nhiệt đới Brazil

Nam Mỹ

Thông qua quá trình lai tạo và chọn lọc, các giống hoa chuông hiện nay có nhiều

ưu điểm để phù hợp với thị hiếu của những người yêu thích hoa cảnh Là loại hoa mới nội nhập vào nước ta gần đây hoa còn có nhiều các tên gọi khác nhau như: hoa tình yêu (valentine), hoa thánh, tứ quý, tử la lan, đại nhâm đồng, hồng xiêm…

1.1.1 Phân loại

Hoa chuông (Sinningia speciosa) là loại cây sống tự dưỡng, củ nằm dưới mặt đất

và là loại cây thân thảo lưu niên thuôc:

Giới: Plantae (Thực vật)

Ngành: Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan)

Lớp: Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan)

Bộ: Lamiales (Bộ Hoa môi)

==============================================================

Họ: Gesmeriaceae (Họ Tai voi)

Chi: Sinningia (Chi Hoa chuông)

Loài: Sinningia speciosa

Sinningia speciosa thuộc một họ lớn là Gesmeriaceae Họ này có trên 2.500 loài

Hầu hết được phân bố ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Chúng thường được tìm thấy ở những nơi đất mùn, khe đá và rừng phủ mùn, đa dạng về màu sắc hoa và hình

dạng hoa, kích thước bộ lá… Chi Sinningia có khoảng 40 - 50 loài và vô số các loài lai Hiện nay Sinningia speciosa được trồng phổ biến trên thế giới như: Mỹ, Châu Âu, Trung

Quốc, Nhật, Thái Lan, Brazil, Ấn Độ, Philippin

Sinningia speciosa là loại hoa thân mềm, kích thước không cao nhỏ nhắn, xinh xắn

nhưng còn có màu sắc hoa rực rỡ và đa dạng và bạn sẽ bị lôi cuốn ngay bởi vẻ đẹp của hoa ngay từ cái nhìn đầu tiên trong khi bạn chưa biết gì về đặc điểm thực vật học của chúng Hình dáng hóa chuông được thể hiện trong Hình 1.1

Theo Nguyễn Quang Thạch và cs (2004); Dương Tấn Nhựt và cs (2005); Lã Thị Thu Hằng (2012); Ioja-Boldura và Ciulca (2013); Lê Nguyễn Lan Thanh (2014), một số đặc điểm thực vật học của cây hoa chuông đã được mô tả cụ thể như sau:

Rễ- củ: Rễ cây hoa chuông thuộc loại rễ chùm phát sinh từ củ hoặc thân phía dưới

đất, phần lớn phát triển theo chiều ngang, ở tầng đất mặt từ 10 - 20 cm Kích thước các

rễ trong bộ rễ chệnh lệch nhau không nhiều, số rễ tương đối nhiều nên khả năng hút nước và dinh dưỡng của cây rất mạnh Rễ phát sinh từ mầm rễ của hạt, từ củ, thân, cuống

lá và những cơ quan sinh dưỡng tiếp xúc trực tiếp với đất

Thân: Thuộc loại cây thân thảo có nhiều đốt giòn dễ gãy Thân dạng đứng hoặc

bò Kích thước thân to hay nhỏ, cao hay thấp, cứng hay mềm tùy thuộc vào giống và thời vụ trồng và có chiều dài thân từ 4 - 6 cm ở cây trưởng thành Trên thân có các mắt ngủ tiềm sinh ở giữa cuống lá và thân

Lá: Cây có lá đơn mọc đối trên thân, phiến lá mềm mỏng, có thể to hay nhỏ hình

thuôn hoặc oval, có màu sắc khác nhau (xanh đậm, xanh nhạt, xanh phớt hồng ) tùy thuộc vào giống Cây có ít lá, mặt trên lá bao phủ một lớp lông tơ mượt như nhung, mặt

==============================================================

dưới nhẵn, gân lá hình mạng, trung bình một chu kỳ sinh truởng của cây có từ 5 - 18 lá trên thân chính

Hoa: Hoa hình chuông, cánh mướt như nhung và viền cánh hoa có gợn sóng Hoa

khoe sắc, mọc ra từ nách lá, đơn lẻ hoặc thành chùm nhiều bông Thời gian nở hoa dài Màu sắc hoa rất đa dạng, hầu như có tất cả các màu trong tự nhiên (trắng, tím, đỏ hồng ) Một bông có thể có một màu hoặc nhiều màu pha trộn Hoa có hai dạng là hoa đơn và hoa kép, hoa kép có nhiều vòng cánh, các cánh xếp xen kẽ nhau Đường kính bông hoa tùy thuộc vào giống và thời vụ trồng, trung bình khoảng 3 - 7 cm

Quả và hạt: Quả có dạng quả nang (khi chín sẽ nứt ra theo 3 đường nứt dọc để

giải phóng các hạt), hạt nhiều và nhỏ (12.000 hạt/g), có nội nhũ

Hình 1.1 Hình ảnh cây hoa chuông

Theo Nguyễn Quang Thạch và cs (2004); Dương Tấn Nhựt và cs (2005); Lã Thị Thu Hằng (2012); Lê Nguyễn Lan Thanh (2014), quá trình sinh trưởng và phát triển của hoa chuông chịu tác động của một số yêu cầu ngoại cảnh như:

Đất: Hoa chuông là cây trồng cạn, bộ rễ ăn nông Vì vậy, yêu cầu đất trồng phải

cao ráo, thoát nước tốt, tơi xốp và nhiều mùn, thích hợp với đất có pH từ 5,80 – 7,50

==============================================================

Nhiệt độ: Hoa chuông có nguồn gốc nhiệt đới nên đa số các giống hoa chuông

được trồng hiện nay đều ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ thích hợp dao động từ 18 - 240C Trong giai đoạn ra hoa, nhiệt độ 16 - 180C sẽ kéo dài thời gian ra hoa Nhiệt độ nhỏ hơn

100C cây ngừng sinh trưởng, gây tổn thương đến lá và hoa, khi nhiệt độ lớn hơn 270C cây sinh trưởng nhanh

Độ ẩm và nước tưới: Hoa chuông là cây trồng cạn nên không chịu được úng nước

Cây hoa chuông sinh trưởng, phát triển thuận lợi nhất trong điều kiện độ ẩm đất từ 65 - 80%, độ ẩm không khí từ 60 - 75% Trong thời kỳ nở hoa nếu độ ẩm quá cao gây thối

hoa và sâu bệnh phát triển mạnh làm giảm chất lượng hoa và độ bền của hoa Cây bị

úng trong giai đoạn ra hoa, các núm hoa bị rụng và có thể gây chết Khi cây ở giai đoạn ngủ nghỉ, giảm lượng nước tưới cho cây Bảo quản củ trong giai đoạn ngủ nghỉ ở điều kiện mát mẻ nhưng phải khô ráo Khi trồng nên sử dụng chậu thoáng và thoát nước tốt Tưới nước mỗi ngày phụ thuộc vào cường độ ánh sáng và nhiệt độ Nên tưới nước vào lúc sáng sớm, tưới nước xung quanh gốc cây, không tưới quá đẫm vì cây dễ bị thối và

nhiễm bệnh Thiếu nước cây sinh trưởng kém, rút ngắn chu kỳ sinh trưởng

Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hóa mầm hoa và sự nở hoa

của cây hoa chuông Hoa chuông ưa ánh sáng tán xạ Ánh sáng trực tiếp sẽ làm cháy lá, trong thời kỳ ngủ nghỉ cây không cần ánh sáng Quang kỳ thích hợp nhất để hoa chuông phát triển là khoảng 12 - 16 giờ chiếu sáng/ngày Cường độ ánh sáng thấp (270 lux) được chấp nhận với nhiệt độ mát 180C, mức ánh sáng từ 0,50 – 1,10 Klux hoặc cao hơn được khuyến cáo để cây phát triển số lượng nụ và hoa tốt hơn Vì vậy, trong sản xuất chúng ta có thể điều chỉnh thời gian và cường độ chiếu sáng cho cây hoa chuông bằng cách dùng lưới đen che nắng, thắp đèn để điều chỉnh sinh truởng phát triển của cây, nhằm đạt hiệu quả kinh tế cao nhất

Việt Nam có số lượng diện tích trồng hoa chiếm khoảng 0,06% trong diện tích đất

tự nhiên đa số tập trung tại các vùng có truyền thống trồng hoa lâu đời như: Ngọc Hà, Quảng An, Tây Tựu (Hà Nội), Đằng Hải, Đằng Lâm (Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ Long (Quảng Ninh), Gò Vấp, Hóc Môn (TP Hồ Chí Minh), Đà lạt, Đức Trọng (Lâm Đồng), Sapa (Lào Cai) tổng diện lích trồng khoảng trên 13 000 ha

==============================================================

Việc trồng hoa tại Việt Nam phần lớn là dự vào kinh nghiệm và phụ thuộc khá nhiều vào yếu tố tự nhiên kèm theo vấn đề giống cũng được nhân giống bằng các phương pháp truyền thống như: giâm, chiết, hạt, củ… Điều này mang lại nhiều nhược điểm cho việc trồng hoa, năng suất giảm, chất lượng không đều thêm vào đó là các vấn đề về nhiễm bệnh nguy hại là nguy cơ nhiễm virut và có thể nguy hại trên diện rộng Trong thời điểm phát triển hiện nay ở các nước tiên tiến nói chung một số vùng trồng hoa trên qui mô lớn ở nước ta nói riêng đã biết sản xuất hoa bằng cách áp dụng kỹ thuật thâm canh cao (trồng hoa trong điều kiện nhà lưới và sử dụng nguồn giống có chất lượng cao

- cây giống cây mô ) đã được triển khai nhưng đối với nước ta vẫn còn ở qui mô nhỏ

và vừa chưa được đầu tư mạnh để thúc đẩy phát triển

Việt Nam được biết đến với nhiều vùng trồng hoa về đa dạng các loài như: cúc, lan, thọ, dạ yến thảo, ly…Tuy nhiên, hoa chuông chưa được trồng phổ biến do các giống hoa chuông mới được nhập vào nước ta, nguồn cung cấp giống bị động nên diện tích trồng còn rất ít, chủ yếu phục vụ công tác nghiên cứu và tập trung ở Hà Nội, Đà Lạt, TP

Hồ Chí Minh, Ở khu vực miền Trung, cây hoa chuông chưa được tiến hành trồng thử nghiệm để mở rộng diện tích

Trên thế giới, sản xuất hoa đang được phát triển mạnh và được xem là một ngành thương mại lớn mang lại lợi nhuận kinh tế cao Diện tích trồng hoa trên các nước vẫn tiếp tục được mở rộng và tăng cao Sản xuất hoa trên thế giới tiếp tục phát triển mạnh

mẽ ở các nước châu Á, châu Phi, châu Mỹ Mục tiêu sản xuất hoa hướng tới là giống chất lượng cao và giá thành thấp Châu Âu và Bắc Mỹ là thị trường tiêu thụ hoa lớn nhất thế giới

Hoa chuông được phát hiện ở Brazil từ rất sớm (năm 1785), hiện nay với nhiều màu hoa đa dạng phong phú được thể hiện ở Hình 1.2 Hoa chuông được trồng phổ biến

ở nhiều nước trên thế giới như: Anh, Đức, Hà Lan, Thái Lan, Trung Quốc Tuy nhiên, những thông tin thống kê cụ thể về diện tích trồng và tình hình tiêu thụ cây hoa chuông

ở các nước trồng hoa chưa được công bố riêng Vì vậy, diện tích trồng và tình hình tiêu thụ cây hoa chuông nói riêng cũng nằm trong xu thế phát triển chung của các loại hoa ở các nước trồng hoa lớn

Trong mười năm qua, 5 nước xuất khẩu hoa đứng hàng đầu thế giới là Hà Lan, Colombia, Kenya, Ecuador và Ethiopia Điều này nói lên sự chênh lệch về trình độ khoa

==============================================================

học kỹ thuật, sự khác biệt về điều kiện môi trường sinh thái nên ở mỗi nước có tốc độ phát triển công nghệ trồng hoa khác nhau dẫn đến sản lượng và năng suất chất lượng khác nhau ở các nước

Hình 1.2 Sự phong phú về màu sắc hoa chuông

Hoa chuông là loại hoa khá dễ chịu về việc nhân giống Trong tự nhiên hoa có thể nhân giống bằng cả hai phương pháp là hữu tính và vô tính Tuy nhiên, ở mỗi phương pháp nhân giống trên đều có sự khác biệt rõ rệt và đem lại ưu nhược điểm riêng

Là hình thức thụ phấn giữa 2 cây bố mẹ để tạo hạt, cây con được mọc lên từ hạt

Hạt giống được hình thành do kết quả thụ tinh giữa giao tử đực (hạt phấn) với giao tử cái (noãn) Cây con mang đặc tính của cả cây bố và cây mẹ (trong trường hợp thụ phấn chéo), nghiêng hẳn về cây bố hoặc cây mẹ (trong trường hợp vô phối) Cây con mọc lên

từ hạt, thường tạo thành cây giống khỏe, có khả năng sinh trưởng phát triển tốt, khả năng chống chịu cao (sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh) Đồng thời cũng mang lại những nhược điểm như dễ thoái hóa giống do bản chất là thế hệ lai có thể mang các kiểu gene khác nhau mà biểu hiện kiểu hình khác nhau về sau chất lượng sẽ giảm dần, làm khó kiểm soát được các phẩm chất của cây con do có thể có hiện tượng biến dị di truyền

==============================================================

Cây có thời gian sinh trưởng dài kèm theo khả năng thụ phấn kém khi gặp điều kiện không thuận lợi Dẫn đến chất lượng sản phẩm thấp mang lại giá trị kinh tế không cao

Nhân giống vô tính là từ một phần của các cơ quan dinh dưỡng (như rễ, thân, lá dùng phương pháp nuôi nhân tạo để mọc ra cây - mới, còn gọi là nhân giống sinh dưỡng Hoa chuông cũng có thể được nhân giống từ các cơ quan, bộ phận sinh dưỡng của cây như thân, lá, củ nhân giống vô tính phổ biến ở nhiều loại cây trồng hiện nay không chỉ

ở cây cảnh mà còn các loại cây ăn quả hay các loại cây trồng khác

Ưu điểm của phương pháp:

 Thời gian nhân giống nhanh

 Giữ được những đặc tính di truyền của cây mẹ

 Cây giống sau trồng sớm ra hoa

 Các đột biến có lợi khó bị mất đi do không phải trải qua quá trình phân bào giảm nhiễm

Nhược điểm của phương pháp:

 Cây giống nhanh bị thoái hóa (sinh trưởng phát triển không đều, giảm giá trị thương phẩm)

 Hệ số nhân thấp, cần số lượng lớn cây bố mẹ, tốn thời gian, phụ thược vào điều kiện thời tiết và cây giống dễ bị thoái hóa qua quá trình canh tác lâu dài

 Cây mẹ truyền bệnh virus sang cho cây con

1.3.1 Sơ lược về nhân giống in vitro

Để phát huy những ưu điểm và hạn chế nhược điểm của phương pháp nhân giống

vô tính truyền thống, công nghệ nhân giống in vitro cần được ứng dụng, để tạo ra cây

giống đồng nhất về kiểu hình, ổn định về di truyền, sạch bệnh Đây là kỹ thuật nhân giống đã được ứng dụng rộng rãi ở các nước có ngành sản xuất hoa tiên tiến

==============================================================

Phương pháp này có ý nghĩa vô cùng lớn trong nhân giống nhanh với những giống hạn chế về số lượng (giống quý, khó nhân giống) hoặc những cây có nhu cầu lớn, những giống cây mới, cần mở rộng diện tích một cách nhanh chóng và có thể cung cấp lượng giống lớn trong thời gian ngắn Tuy nhiên, hệ số cấy chuyển phụ thuộc vào tùy giống, càng cấy chuyền nhiều lần càng tạo biến dị Ví dụ, các nhà khoa học đã kết luận từ một chồi chuối đưa vào nuôi cấy có thể nhân ra 2000 cây chuối giống, từ một chồi dứa có thể tạo hàng triệu cây dứa giống, nếu qua con số này thì tỷ lệ biến dị cao

Đặc biệt, nhân nhanh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực sự đáp ứng được tính thời

vụ của nhu cầu Đối với nhu cầu cây cảnh nói chung và hoa nói riêng, sự biến đổi xảy

ra rất nhanh Đặc biệt với những giống hoa mới, nhu cầu thường tăng cao trong thời gian ngắn sau khi xuất hiện Ngày nay khi nhu cầu cây cảnh của con người ngày càng tăng,

một loại cây dễ tính như Sinningia speciosa phải nên được đưa vào đầu tư và phát triển mạnh nhằm nhân rộng số lượng cây kể cả số nơi trồng cây Đặc biệt, Sinningia speciosa

có khả năng phản ứng rất nhanh với các điều kiện nuôi cấy in vitro nên cần phải có sự

quan tâm nghiên cứu để đưa vào sản xuất giống trên qui mô lớn

1.3.2 Ưu nhược điểm của nhân giống in vitro

Theo Bùi Trang Việt (2000), Nguyễn Đức Thành (2000), Nguyễn Quang Thạch

và cs (2009), phương pháp nhân giống in vitro có những ưu nhược điểm sau:

Ưu điểm

 Đưa ra sản phẩm nhanh hơn:

Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một quần thể cây có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt

di truyền

 Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao:

Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cực kỳ cao, từ một cây có thể cho ra hàng triệu cây từ các bộ phận của cây gốc như lá, thân, đỉnh… trong vòng 1- 2 năm

 Chủ động trong quá trình nuôi cấy:

Quá trình nhân giống tiến hành trong phòng thí nghiệm, có thể kiểm soát một số yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, sử dụng các chất ĐHTTTV…, nên không bị phụ

thuộc vào mùa vụ hay điều kiện khí hậu như các phương pháp nhân giống truyền thống

==============================================================

 Tiết kiệm không gian:

Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên ruộng đồng và trong nhà kính theo phương

pháp truyền thống

 Tạo giống sạch bệnh, nâng cao chất lượng giống:

Đây là vấn đề ngày càng được quan tâm trên thế giới Có thể nói cùng với sự phát triển về khoa học kỹ thuật là sự phát triển mạnh mẽ của dịch bệnh và ngày càng khó trị

Nó sẽ làm giảm năng suất, chất lượng sản phẩm Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ các bệnh kể cả virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng hương pháp này thường tăng 15 – 30% so với cây gốc điều

này có ý nghĩa hết sức to lớn trong phạm trù giống sạch hiện nay

Giống sạch bệnh có thể được tạo ra một cách hiệu quả nhất thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng vì đây là bộ phận có tốc độ phân chia nhanh, được che chắn bởi những

sơ khởi lá kèm theo đó là hệ thống mạch chưa liên kết tới

 Cải tiến các giống cây trồng bằng chọn lọc dòng soma, gây đột biến, chuyển gen:

Tạo ra các biến đổi trong di truyền cần thiết trong chọn và nhân giống Đối với các phương pháp truyền thống, giống mới có thể được tạo ra một cách ngẫu nhiên bằng sự lai hữu tính và có tính thành công không cao, chưa nói đến là tạo ra các biến đổi kém hơn giống cũ Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật việc tao ra các đột biến là khá dễ dàng và nhanh chóng hơn Nuôi cấy mô có thể cảm ứng nhanh và nhiều biến dị trong các cây con tái sinh và những biến dị đó gọi là biến dị dòng soma, somaclonal variation (Jain, 2001) Năm 1969, biến dị soma đầu tiên được báo cáo trên cây mía bởi nhà nghiên cứu của Mỹ Đi kèm sau đó là hàng loạt các báo cáo trên các đối tượng khác nhau Sau đó người ta có thể kích thích các biến dị soma bằng cách nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tăng thời gian nuôi cấy và điều chỉnh nồng độ các chất ĐHTTTV

 Phương pháp nhân giống in vitro có thể duy trì và nhân nhanh các kiểu

gen quý:

Nhân giống in vitro có thể duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý cũng như nhân

nhanh được các cây hoa, cây dược liệu… khó trồng bằng hạt hay các biện pháp nhân giống truyền thống, ngoài ra còn rất nhiều các ưu điểm khác vượt trội hơn so với các

==============================================================

phương pháp truyền thống Ngày nay, trên 50 quốc gia sử dụng hơn 1800 giống cây mới

được tạo ra trực tiếp từ các đột biến hoặc gián tiếp qua lai tạo những cây đột biến đó (Ahloowalia và Maluszynski, 2001) Năm 1983 được xem như một cột mốc quan trọng trong lịch sử của kỹ thuật nuôi cấy mô Đó là sự ra đời của kỹ thuật chuyển gen, mở ra một tương lai mới mẻ cho công tác chọn giống và tạo giống, tiến tới khả năng tạo được giống thực vật đạt mọi tiêu chí mà con người mong muốn là dựa trên nguyên tắc chuyển

các đoạn gen cần được biểu hiện mong muốn vào đối tượng cần tạo nên

Nhược điểm:

Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế cao hoặc quí hiếm vẫn chưa được nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen, điều này gây hạn chế về nguồn sản phẩm

 Tính bất định về mặt di truyền:

Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo xuất hiện nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh Kết qủa là cây con không giữ được các đặc tính qúy của cây bố mẹ Ngoài ra, khi nuôi cấy kéo dài, tăng số lần cấy chuyển tùy theo loài, cũng như tăng hàm lượng chất ĐHTTTV sẽ gia tăng hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả dẫn tới cây con xuất hiện đột biến về hình thái hoặc ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và năng suất cây Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý và khắc phục nhằm đảm bảo tạo ra nguồn giống

số lượng lớn đồng nhất về mặt di truyền

 Sự nhiễm mẫu:

Một số loài vi khuẩn như Agrobacterium, Corylabacterium, Pseudomona… có thể xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn tại trong mô và gây ra tác hại khi mô bắt đầu phân chia Có thể sử dụng một số kháng sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và chất kháng sinh có thể phản ứng lên kiểu gen Ngoài ra, mẫu cấy có thể nhiễm virus hay viroid Sự xâm nhiễm có thể không gây ra sự hoại mẫu nhưng ảnh hưởng đến chất lượng cây giống sản xuất

 Sản xuất các chất độc hại từ mô:

Trong quá trình nuôi cấy, mô của một số loài thực vật sinh ra các chất tanin hoặc hydroxyphenol gây hóa nâu, hóa đen mẫu cấy và có thể khắc phục hiện tượng hóa nâu, hóa đen bằng một số biện pháp sau:

o Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy

 Chi phí sản xuất cao:

Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép hay bằng hạt tiến tới giá thành rẻ hơn

1.3.3 Các giai đoạn trong qui trình nhân giống in vitro

Theo Nguyễn Quang Thạch và cs (2006), Vũ Quang Sáng và cs (2007), George và

cs (2008), qui trình nhân giống in vitro cho tới hiện nay đã được áp dụng cho nhiều loại

cây trồng Giáo sư Murashige của trường Đại học California đã chia qui trình nhân giống

in vitro thành các giai đoạn như sau:

 Tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy:

o Chọn lọc mẫu từ cây bố mẹ:

Việc lựa chọn cây mẹ khỏe mạnh, không có triệu chứng mang bệnh,… có thể giúp giảm tỷ lệ nhiễm, tăng khả năng sống, sinh trưởng và phát triển của mẫu, giúp tăng hiệu quả qui trình nhân giống Các mô được chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định Việc lựa chọn nguồn mô cũng tùy thuộc vào loài thực vật, phương pháp, điều kiện và mục đích nuôi cấy, có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mẫu và hiệu quả của qui trình vi nhân giống

o Tạo mẫu và môi trường vô trùng cho nuôi cấy in vitro:

Được gọi chung là giai đoạn khử trùng mẫu cấy nhằm tạo nên vật liệu khởi đầu cho quá trình nuôi cấy Mục tiêu, cần phải có tỷ lệ mẫu thành công cao, nhiễm thấp, tái sinh một cách định hướng mẫu nuôi cấy, phát sinh hình thái cơ quan như chồi, cụm chồi,

rễ hoặc hình thành callus, phôi vô tính hoặc protocorm, protocorm like body tùy thuộc vào nguồn mẫu, loại thực vật và mục đích nghiên cứu, hệ số tái sinh chồi cao và chất

 Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro:

Giai đoạn nhân nhanh chồi trong nuôi cấy in vitro ảnh hưởng lớn đến kết quả của

quá trình nhân nhanh giống, nhằm tạo ra số lượng lớn chồi, cụm chồi cũng như tạo số lượng lớn cây giống sau này Là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra

hệ số nhân cao nhất Ở quá trình này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều chồi, mầm nhằm cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo Quá trình này chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần dinh dưỡng, các yếu tố vật lý, nồng độ các chất ĐHTTTV, trong đó quan trọng là cytokynin nên cần phải tạo điều kiện tốt nhất lẫn bên trong và bên ngoài một cách tốt nhất

Thời gian nhân nhanh chồi thường kéo dài 1-2 tháng trong một lượt nhân, tùy từng loại cây và mô phát sinh chồi Sau đó được cấy truyền trong khoảng thời gian nhất định tùy thuộc vào loại cây và mô cấy, tuy nhiên không nên kéo dài quá lâu, tránh biến dị tế bào soma

 Tạo cây hoàn chỉnh - ra rễ:

Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi trường tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá, rễ Trong giai đoạn này, nồng độ cytokynin

được giảm xuống và tăng nồng độ auxin nhằm kích thích sự hình thành rễ cho cây giống

==============================================================

cũng như tập trung kéo dài và phát triển chồi đạt kích thước nhất định Giai đoạn này cần 2-8 tuần là các cây con ra rễ được xem là chất lượng để chuẩn bị cho giai đoạn kế tiếp

 Chuyển cây ra điều kiện vườn ươm:

Đây là quá trình chuyển cây được sống trong điều kiện tối ưu ở phòng thí nghiệm

ra ngoài tự nhiên là giai đoạn cuối cùng của qui trình vi nhân giống Cây có khả năng thích nghi cao mang lại tỷ lệ sống cao, đem lại hiệu quả cao cho qui trình vi nhân giống

Sự biến động của các yếu tố như: thời tiết, đất đai, sâu bệnh, ánh sáng, nhiệt độ… gây

nhiều khó khăn trong việc đưa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên Do đó, trong quá

trình thích nghi, vườn ươm cần che chắn bằng lưới hoặc nylon để giảm thiểu nắng và gió, phun sương cung cấp đủ nước và độ ẩm cho cây nhằm hiệu chỉnh nhiệt độ, độ ẩm cho cây và môi trường cũng như cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng các yếu tố vi lượng

và đa lương cho cây để cây có thể phát triển tốt có sức sống cao tạo năng suất chất lượng cây tốt…

Cây giống in vitro khi đưa ra môi trường tự nhiên sẽ gặp một số vấn đề như:

 Bộ máy quang hợp và lục lạp kém phát triển

 Rễ của các chồi không có khả năng đồng hóa cacbon và thường bị chết

do rễ được hình thành từ callus thân, cho nên mối liên kết rễ - không bào và thân không tốt

 Cây sẽ bị mất nước do cấu trúc lá có lớp cutin trên bề mặt ít

Theo TS Lã Thị Thu Hằng (2012) đã khắc phục các hạn chế trên bằng cách huấn luyện cây giống, bằng các biện pháp như:

 Giảm thể nước của môi trường

 Giảm độ ẩm trong bình nuôi cấy

Thực hiện các biện pháp như: đậy nút chai bằng các vật liệu có thể thoát hơi nước

như báo, giấy lọc,… mở nắp bình trước khi trồng vài ngày, khi cho cây ra rễ in vitro cần

điều chỉnh ánh sáng, nhiệt độ cao hơn các quá trình trước…

Như vậy, tất cả các giai đoạn trong nuôi cấy in vitro bắt đầu từ mẫu in vivo cho đến khi trở thành in vitro và quay trở lại thành in vivo đều có vai trò quiết định đến sự thành công của quá trình nhân giống in vitro Điều khó khăn trong qui trình nhân giống

==============================================================

cây hoa chuông là việc tạo vật liệu khởi đầu do kết cấu bên trong và bên ngoài cây mọng nước và nhiều lông tơ trở ngại cho quá trình khử trùng Nhằm tặng hiệu quả và giải quiết được khó khăn trên ta cần phải lựa chọn nguồn mẫu phù hợp kèm theo qui trình và hóa chât khử trùng hợp lí để đạt kết quả tốt nhất trong việc tạo vật liệu khởi đầu

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nhân giống in vitro

Quá trình vi nhân giống in vitro chịu sự tác động của các yếu tố bao gồm những

tác động bên trong và bên ngoài ảnh hưởng mạnh đến sự thành công và chất lượng sản phẩm nuôi cấy Theo Nguyễn Quang Thạch và cs (2009), Ngô Xuân Bình (2010), Lã Thị Thu Hằng (2012), các yếu tố bao gồm như:

 Lựa chọn nguồn vật liệu ban đầu:

Việc lựa chọn nguồn vật liệu ban đầu ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình vi nhân giống là bước đầu tiên trong quá trình nuôi cấy phải đảm bảo kết quả và chất lượng tốt nhất Theo Mantell và cs (1985) mẫu cấy thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải có mô phân sinh hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng Các mô phát triển mạnh, có khả năng tái sinh mạnh, sạch bệnh như mô phân sinh ngọn, thượng tầng, đầu

rễ, chồi bên, lá non, cuống hoa, đế hoa,… là những mô có thể lấy cho việc tạo vật liệu ban đầu, khi nuôi cấy trên môi trường có chất ĐHTTTV sẽ có khả năng tái sinh mạnh

và đạt kết quả tốt Trong đó, việc lựa chọn cây bố mẹ để thu nhận mẫu cũng quiết định

sự thành công trong giai đoạn này Việc lựa chon cây bố mẹ cần khỏe mạnh, không quá già, sạch bệnh, không được nhiễm virus và các nấm ký sinh khác sẽ gây ảnh hưởng xấu

đến việc nuôi cấy in vitro

 Các phương pháp vô trùng mẫu:

Vật liệu mẫu ban đầu trước khi được đưa vào nuôi cấy trong điều kiện in vitro phải

trải qua bước xử lý vô trùng bằng hóa chất hoặc các tác nhân khác có tác dụng diệt khuẩn

mà không gây ảnh hưởng hay biến đổi mẫu Để tránh gây mất hay giảm khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào, khả năng tái sinh và kể cả làm biến đổi kiểu gene của mẫu… Một số hóa chất khử trùng thường được sử dụng được thể hiện

ở Bảng 1.1 Do đó, việc lựa chọn được phương pháp vô trùng hợp lý đối với cây hoa chuông sẽ tạo được khởi đầu tốt cũng như tiền đề thuận lợi cho các giai đoạn tiếp theo trong qui trình nuôi cấy

Calcium hypochlorid (Ca(OCl)2) 9 - 10 5 - 30 Rất tốt

Thủy ngân clorua (HgCl2) 0,1 - 1 2 - 10 Đạt yêu cầu

 Môi trường nuôi cấy:

Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng cho

mô tế bào thực vật có thể sinh trưởng và phát triển khi đã tách rời khỏi cơ thể ban đầu trong điều kiện vô trùng Các nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi cấy mô như nhiệt độ, ánh sáng, chất dinh dưỡng… Trong đó chất dinh dưỡng khoáng đóng vai trò quan trọng Thành phần hóa học của môi trường quiết định sự thành công của quá trình nuôi cấy Ngoài ra, thành phần môi trường và các chất ĐHTTTV sẽ cảm ứng quá trình phản phân hóa, phân hóa và phát sinh hình thái định hướng Do đó,

ở mỗi loại cây hay mỗi cơ quan tế bào khác nhau cộng thêm mục đích nuôi cấy khác nhau mà phải có yêu cầu về các thành phần môi trường sử dụng cũng khác nhau Hiện nay, phần lớn các nhà nghiên cứu hoặc các phòng thí nghiệm về nuôi cấy mô

tế bào thực vật đều sử dụng (50 – 70 %) là môi trường MS cơ bản (Murashige and Skoog) Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm: các muối khoáng đa lượng và vi lượng, vitamin, nguồn cacbon,vitamin, các hợp chất tự nhiên (nước dừa, dịch chiết nấm men, …) và các chất ĐHTTTV

o Các loại muối khoáng:

Muối khoáng cung cấp nguyên liệu tổng hợp các chất hữu cơ hoặc các đại phân

tử sinh học trong tế bào, là thành phần quan trọng của nhiều enzyme hoặc giúp điều hòa

pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào

o Nhóm cacbon hữu cơ:

Đường là nguồn cacbon chủ yếu được sử dụng, với nồng độ thích hợp thông thường

2 - 8% đa số dùng đường saccharose để cung cấp dinh dưỡng cũng như cacbon cho tế bào, vì mô sống chủ yếu theo phương pháp dị dưỡng, kèm theo khả năng quang hợp trong điều kiện ánh sáng nhân tạo giúp cây sinh trưởng bán dị dưỡng nhưng không đủ

để cấy có thể phát triển tốt Do đó, việc bổ sung các nguồn cacbon rất cần thiết cho cây

và nồng độ tùy thuộc vào mục địch nuôi cấy cũng như đặc tính của cây

o Các Vitamin:

Các vitamin cần thiết cho các phản ứng sinh hóa, giúp mô sinh trưởng tốt Tuy nhiên, tế bào trong điều kiện nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tự tổng hợp vitamin nhưng thường không đủ cho cây có thể sinh trưởng phát triển tốt trong quá trình nuôi kéo dài Do vậy, việc bổ sung vitamin cho môi trường nuôi cấy là rất cần thiết

o Các nhóm chất tự nhiên:

Các hợp chất tự nhiên có chứa chất ĐHTTTV, vitamin,… được bổ sung để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái của mô và tế bào Theo kết quả phân tích của các nhà khoa học cho thấy nước dừa có nhiều nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào như: các axit amin, axit béo, axit hữu cơ, đường, ARN, ADN, myoinositol, các chất có hoạt tính auxin, các glucosit của xytokinin, kèm theo đó trong hợp chất tự nhiên từ dịch chiết như dịch chiết nấm men, dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha), dịch chiết một số loại rau, quả tươi: khoai tây, chuối, cà rốt cũng được bổ sung nhằm kích thích sự phát triển tốt của mô tế bào thực vật

o Chất làm đông môi trường:

Trong phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vẫn có thể được tiến hành trên môi trường lỏng ở một số bước nhưng phần lớn quá trình để tạo sản phẩm diễn ra trên

o Điều kiện nuôi cấy:

Điều kiện nuôi cấy bao gồm các tính chất và trạng thái về pH, nhiệt độ, ánh sáng hay thành phần kèm với trạng thái môi trường rắn hay lỏng trong điều kiện vô trùng, ánh sáng và chu kỳ chiếu sáng là những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của các mẫu mô trong quá trình nuôi cấy tế bào thực vật

Việc điều chỉnh pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Độ pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động từ 5,50 – 6,00 Nếu pH thấp thì agar sẽ không đông sau khi hấp khử trùng Khi pH < 4 hoặc pH = 7 thì sẽ làm kết tủa một số muối vô

cơ và phân giải một số chất hữu cơ sẽ làm chết cây

Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Các yếu tố như: cường độ chiếu sáng, chu kỳ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng, thường sử dụng là đèn huỳnh quang hoặc đèn led với cường độ ánh sáng khoảng 2000 -

3000 lux, với quang chu kỳ thông thường là 16h chiếu sáng và 8h trong tối Theo kết quả nghiên cứu của Vince-Pure (1994) Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng phù hợp nằm trong khoảng 2000 - 2500 lux Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao hơn để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng, tăng khả năng quang hợp của cây

Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy in vitro được kiểm soát bởi máy điều hòa nhiệt độ

kèm với việc kiểm soát độ ẩm cho môi trường nuôi Nhiệt độ cao cùng với độ ẩm cao kết hợp với hàm lượng cytokinin tương đối cao dễ xuất hiện thủy tinh thể Nhiệt độ thấp vừa phải sẽ giúp cho quá trình tạo rễ được thuận lợi cho mẫu nuôi Để mô cấy phát triển tốt thì phòng nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25 - 280C

Mẫu cấy được nuôi trong môi trường đặc sẽ được bổ sung 8 - 10% agar có nhiệt

độ nóng chảy là 80oC và nhiệt độ đông đặc là 40oC Agar có độ ngậm nước cao, khả

==============================================================

năng di động tốt thuận lợi để làm giá thể cho cây đứng vững, cũng như không quá cứng làm ngăn cản sự phát sinh chồi hay rễ trong quá trình nuôi cấy Mô nuôi trên môi trường lỏng được dùng cho các mục đích nuôi cấy khác nhau, môi trường nhân nhanh, dung dịch nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy protoplast

1.3.5 Vai trò, tác dụng của các chất ĐHTTTV

Các chất ĐHTTV bao gồm: auxin, cytokinin, giberrellin, acid abscisic, ehtylene

có công thức cấu tạo được thể hiện ở Hình 1.3, có vai trò rất quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển cũng như thúc đẩy phát sinh hình thái tế bào, phần lớn sử dụng các hợp chất auxin và cytokinin nhằm thúc đẩy sự phát sinh chồi và rễ cho việc tạo cây hoàn chỉnh Phytohoocmon và những hợp chất kích thích sinh trưởng phần lớn cây có thể tự

tạo ra ở môi trường sinh sống tự nhiên, nhưng đối với nuôi cấy in vitro do kích thước

mô nhỏ bé nên ta cần phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy để thúc đẩy và định hướng cho sự phát triển của mô theo ý muốn Để chúng hoạt động có hiệu quả, cần phải có sự cân bằng về nồng độ trong các mô và tại các vị trí chuyên biệt

Theo Murashige và Skoog (1957), Lê Văn Chi (1992) đưa ra tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) thấp kích thích tạo chồi và ngược lại thì tạo rễ Các chất ĐHTTTV thường được

bổ sung với nồng độ thấp (0,001 – 10,00 µM) đủ gây ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy Ở một số cây hoặc mẫu khác nhau hay tùy vào mục đích nuôi cấy mà có sự kết hợp giữa auxin và cytokinin sẽ cho kết quả tốt hơn khi chỉ dùng một chất đơn lẻ, đôi khi lại nghiêng về một phía auxin để tăng khả năng tạo chồi Điều này cho thấy trong nuôi cấy

in vitro tế bào thực vật không nhất thiết lúc nào cũng phải theo cơ sở lý thuyết sẽ được

kết quả tốt nhất

 Các hợp chất auxin:

Auxin có vai trò kéo dài tế bào, tạo ưu thế đỉnh, hình thành rễ bất định, kích thích

sự phân chia tế bào Khả năng kéo dãn tế bào của auxin được lý giải bởi auxin kích thích bơm proton, làm thay đổi pH nội bào , từ đó ảnh hưởng đến sự hoạt động của các enzyme như pectinase,… gồm các chất như IAA (indolylacetic acid), α-NAA (α-naphthylacetic acid), 2,4 - D (diclorophenoxy acetic acid), IBA (indolyl butyric acid)… Thông thường, khi nồng độ auxin thấp sẽ kích thích sự tạo rễ, nồng độ auxin cao thì dẫn đến sự hình thành callus

==============================================================

Theo Hoàng Minh Tấn và cs (2006), George và cs, (2008) Sự sản sinh ethylene

và polyamin bởi auxin gây ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ Auxin gây ra sự methyl hóa DNA, thúc đẩy sự hình thành mô sẹo Đối với sự hình thành ban đầu của phôi soma cần hàm lượng auxin cao, nhưng phôi sẽ không phát triển nữa cho đến khi lượng auxin giảm, 2,4 - D thường được sử dụng trong quá trình kích thích tạo mô sẹo và phôi soma Hàm lượng auxin có hoạt tính khác nhau ở các loài thực vật khác nhau, các cơ quan, các mô

và tế bào khác nhau bao gồm tuổi của cây và tế bào Việc lựa chọn loại auxin và hàm lượng sử dụng phụ thuộc vào các yếu tố trên và mục đích nghiên cứu của quá trình

 Các hợp chất cytokinin:

Cytokinin là nhóm phytohormone quyết định sự phân chia tế bào, thúc đẩy sự hình thành và phát triển chồi làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn, do đó kích thích chồi nách phát triển, kích thích sự tổng hợp protein và hoạt tính của một số enzyme, có mặt trong tRNA, đồng thời cytokinin cùng với auxin tham gia điều hòa chu kỳ tế bào thực vật,… gồm các chất như kinetin, BAP (5 - benzyl amino purin) và zeatin… Ở nồng độ cao (1

- 10 mg/l), cytokinin kích thích sự hình thành chồi bất định nhưng ức chế sự tạo rễ Các cytokinin là dẫn xuất của adenin, được tổng hợp chủ yếu ở hệ thống rễ và một lượng nhỏ ở các cơ quan non đang sinh trưởng và vận chuyển lên các bộ phận trên mặt đất theo hướng ngược chiều auxin Cytokinin trong cây là chất zeatin có công thức hóa học

6 - (4 - hydroxy - 3 - methylbut - 2enyl) aminopurin Các cytokinin tổng hợp gồm kinetin (6 - (2 – furfuryl) - aminopurin)… Trong đó, hoạt tính của BAP cao hơn kinetin, bền

hơn zeatin về mặt nhiệt độ cao và thường được sử dụng nhiều hơn trong nuôi cấy in

vitro

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, giai đoạn nhân chồi thường tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy, kết hợp với một lượng nhỏ auxin Tuy nhiên, hàm lượng cytokinin cần lượng vừa phải không quá cao hoặc không quá thấp sẽ gây ức chế hoặc giảm khả năng phát sinh chồi của mô cấy Hàm lượng cytokinin thấp được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có thể thúc đẩy tạo mô sẹo, phát sinh phôi Hàm lượng cao cytokinin gây ức chế hoặc cản trở sự hình thành của rễ cũng như sự phát triển của rễ và ảnh hưởng đến sự thúc đẩy phát triển rễ của auxin

 Các hợp chất Gibberellin

==============================================================

Trong đời sống thực vật Giberrellin (GA) đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: ngủ nghỉ của hạt và chồi, sự phát triển hoa và chiều dài của cây Giberrellin (GA) là một họ của hormones thực vật điều khiển nhiều quá trình trong

sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nó còn có nhiều chức năng như: kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ức chế sự hình thành rễ bất định, có thể làm chậm quá trình hóa già của lá và cây, kích thích cho việc tạo quả không hạt…

 Axit absisic ( ABA )

Trong nuôi cấy in vitro, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự chín của

phôi, sự phát sinh chồi ở nhiều loại thực vật ABA có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của mô sẹo và phát sinh cơ quan (chồi, rễ, phôi), có thể có lợi với hàm lượng thấp và có hại với hàm lượng cao Một số ABA cần thiết cho sự trưởng thành và phát triển bình thường của phôi soma ABA thúc đẩy phát sinh phôi vô tính và tăng cường chất lượng của phôi vô tính bằng cách tăng khả năng chống chịu khô hạn và ngăn chặn sự nảy mầm sớm ABA cũng có thể điều chỉnh hoạt tính và sự sinh tổng hợp cytokinin, do ABA tăng cường sự oxy hóa IAA

 Ethylen

Ethylene là hormone thực vật dạng khí ức chế sinh trưởng gây sự già hoá, kích thích sự rụng lá và quả, làm chín quả Quá trình sinh tổng hợp ethylen được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng hoặc lão hóa, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh Đồng thời, ethylene còn có tác dụng điều khiển sự chín của một số loại quả, kiềm hãm

sự ra hoa của cây, kích thích sự ra hoa và sự lão hóa cũng như việc rụng lá ở cây Ethylene có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của mô sẹo và quá trình nuôi cấy huyền phù

tế bào, sự kéo dài chồi, rễ, sự hình thành chồi bất định, sự ra rễ và phát sinh phôi Ethylene có thể tương tác với các chất khí khác trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật như CO2 và O2 Hàm lượng thấp O2 kích thích tổng hợp tiền chất ethylene là 1 – aminocyclopropane – 1 - carboxylic acid (ACC), nhưng ức chế chuyển hóa ACC thành ethylene Hàm lượng O2 cao kích thích chuyển hóa ACC thành ethylene

==============================================================

Hình 1.3 Công thức hóa học của một số chất ĐHTTTV

speciosa) trong và ngoài nước

Hoa chuông (Singningia speciosa) là loại hoa nhỏ nhắn và khá dễ tính trong môi trường tự nhiên, đồng thời có khả năng phản ứng nhanh trong điều kiện nuôi cấy in vitro

Do đó, đã có khá nhiều nghiên cứu trên cá thể thực vật này được thực hiện từ khá sớm với các mục đích và ý nghĩa khác nhau

 Trên thế giới

Nghiên cứu về nhân giống in vitro cây hoa chuông (Singningia speciosa) được

thực hiện cách đây khoảng 20 năm trở lại đây với bài báo bằng tiếng Hàn năm 1988 của Paek và Han trên trang web của FAO Mẫu cấy được sử dụng là lá mầm và trục mầm ( cotyledon and hypocoty ) được cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm 10,00 mg/l kinetin, 0,10 mg/l IAA, 50 – 100 mg/l NaH2PO4.H2O và 40 mg/l adenine SO4 Nhưng

do không được tìm thấy trong một tạp chí chuyên ngành nào nên độ tin cậy từ bài báo này không được cao

Scaramuzzi và cs (1999) đã thành công trong việc nhân giống cây hoa chuông

(Sinningia speciosa) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro từ phiến lá và chồi Với môi trường

nuôi cấy MS có bổ sung IAA và kinetin tỷ lệ mẫu sống là 80% và đạt 25 - 30 chồi/mẫu cấy Với môi trường nuôi cấy MS có bổ sung IAA và BA tỷ lệ mẫu sống là 80% và đạt

40 - 50 chồi/mẫu cấy

==============================================================

Naz và cs (2001) đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa chuông

từ lá và sử dụng môi trường MS có bổ sung auxin và cytokinin với các nồng độ khác nhau Quá trình tạo chồi sử dụng môi trường MS có bổ sung 3 mg BAP/l Quá trình tạo

rễ sử dụng các chồi có chiều cao 2,00 – 2,50 cm và nuôi trong môi trường MS có bổ sung NAA và IBA trong thời gian 4 - 5 tuần và đưa ra trồng trong vườn ươm trên giá thể đất cát trong thời gian 20 ngày Jie (2004) nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy

mô cây hoa chuông từ lá dùng môi trường MS có bổ sung 1 mg BA /l và 0,20 mg NAA/l

để tạo callus Và tạo cây trên môi trường MS có bổ sung 3 mg BA/l và 0,20 mg NAA/l

và quá trình tạo rễ sử dụng môi trường 1/2 MS có bổ sung 0,20 mg NAA/l Đồng thời nghiên cứu của Ioja-Boldura và Ciulca (2013) cho thấy, việc phối hợp 4 mg/l và 0,10

mg NAA/L là sự hình thành chồi tốt nhất cho mẫu cấy

Nghiên cứu của Sharma (2013) nâng cao khả năng tạo chồi của cây hoa chuông từ

lá Mẫu lá được khử trùng bề mặt bằng dung dịch HgCl2 0,10 % và Bavistin 2% Môi trường nuôi cấy tạo chồi là môi trường MS bổ sung 2 mg BAP/l và 0,50 mg NAA/l trong thời gian 2 tuần số lượng trung bình chồi là 7,30 chồi/mẫu cấy Chồi sau đó được nuôi

cấy trong môi trường tạo rễ MS có bổ sung NAA và IBA Cây hoa chuông in vitro được

chuyển ra vườn ươm trên giá thể gồm đất sạch và cát với tỷ lệ 1:1

 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam báo cáo đầu tiên về vi nhân giống cây hoa chuông là của Nguyễn Quang Thạch và cs (2004) sử dụng HgCl2 0,10% để khử trùng mẫu cây hoa chuông trong thời gian 10 phút cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ mẫu sạch đạt 55% Môi trường tối ưu cho hệ số nhân: MS + 0,50 mg BA/l + 0,20 mg α - NAA/l, hệ số nhân đạt 6,02 chồi sau

6 tuần nuôi cấy Môi trường MS1B có lượng khoáng đa lượng giảm đi một nửa cho khả năng tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất Sau 3 tuần nuôi cấy 100% cây có rễ đầy đủ, cây sinh trưởng mạnh Giá thể tốt nhất để trồng cây con tách từ lá giâm là giá thể trấu hun

Lê Hữu Cần và Nguyễn Thị Hồng Minh (2005) nghiên cứu ứng dụng công nghệ

in vitro trong nhân nhanh cây hoa chuông màu đỏ cánh đơn ở Thanh Hóa Kết quả

nghiên cứu cho thấy: sử dụng HgCl2 0,10% trong 15 phút hoặc Ca(OCl)2 15% trong 10 phút cho kết qủa khử trùng tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 58% Môi trường nhân nhanh

đốt thân thứ 2 tính từ ngọn của cây hoa chuông cho sự tái sinh chồi nhiều nhất trên môi

trường MS có bổ sung 1,00 mg BA/l Các chồi in vitro có thể xử lý bằng 1,00 mg IBA

/l hoặc 0,20 mg α-NAA /l đều cho tỷ lệ ra rễ 100% sau 2 - 4 tuần ươm

Dương Tấn Nhựt và cs (2005) đã thực hiện đề tài nghiên cứu cơ sở “Thiết kế hệ thống nuôi cấy bằng màng nylon dạng ống trong sự tái sinh chồi ở mẫu cấy lá của

Sinningia spp” Cùng thời gian này, đề tài về “Công nghệ tiên tiến trong vi nhân giống

một số cây quan trọng” trong đó Sinningia sp là một trong những đối tượng được nghiên

cứu

Gần đây, trong luận án tiến sĩ của Lã Thị Thu Hằng (2012) đã nghiên cứu về kỹ

thuật nhân giống in vitro và trồng cây hoa chuông (Singningia speciosa) tại tỉnh thừa

thiên Huế với việc sử dụng đoạn thân mang mắt ngủ cho việc tạo chồi trên môi trường

MS có bổ sung 1mg BAP/L + 0,02 mg α- NAA/L trong thời gian 8 tuần kết quả đạt từ 46,67 % - 60% và nhân chồi trên môi trường MS có bổ sung 0,50 mg BAP/L trong thời

gian 8 tuần có hệ số nhân chồi 5,10 – 7,83 lần cuối cùng là tạo cây hoàn chỉnh trên môi

trường MS + 0,30 mg α- NAA/L trong 4 tuần kết quả ra rễ hoàn toàn đạt tỉ lệ 100% cây

giống khỏe mạnh đạt chất lượng tốt

Nhận xét: Hầu hết các nghiên cứu sử dụng auxin và cytokinin với các nồng độ khác nhau và cho kết quả khác nhau Tuy nhiên, việc đưa ra được chất lượng sản phẩm tốt nhất cũng như giảm giá thành còn phụ thuộc vào nhiều các yếu tố khác Vì vậy, việc

ứng dụng kỹ thuật nuôi cây mô tế bào thực vật để nhân giống vô tính in vitro cây hoa

chuông, đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới

và trong nước Một trong những ưu điểm mang tính sáng tạo của kỹ thuật nuôi cấy mô

tế bào thực vật là: luôn được hoàn thiện để nâng cao chất lượng cây giống và giảm giá thành sản phẩm Vì vậy, từ những kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở khoa học và thực tiễn giúp thực hiện nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân

giống vô tính in vitro cây hoa chuông phù hợp với điều kiện sinh thái tỉnh Khánh Hòa

nói chung và của trường Đại Học Nha Trang nói riêng

==============================================================

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu cây hoa chuông (Singningia speciosa) được nhập từ Trung tâm công nghệ

sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh

Nội dung 1: Khảo sát qui trình nhân giống in vitro cây hoa chuông

 Khảo sát thời gian khử trùng trên các bộ phận khác nhau

 Khảo sát ảnh hưởng của các chất ĐHTTTV lên sự phát sinh chồi bất định

từ các bộ phận khác nhau

 Khảo sát môi trường khoáng lên sự phát triển của chồi

 Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính và các chất ĐHTTTV lên sự phát sinh rễ

Nội dung 2: Chăm sóc cây con ngoài vườn ươm

 Khảo sát các loại giá thể và cách phối trộn lên tỷ lệ sống của cây con ngoài vườn ươm

2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát qui trình nhân giống in vitro cây hoa chuông

 Các công thức thí nghiệm:

 Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng trên các bộ phận khác nhau

Mục đích: Xác định được thời gian và cơ quan đưa vào nuôi cấy có hiệu quả nhất

để tạo nguồn vật liệu khởi đầu trong nhân giống in vitro cây hoa chuông

Nguồn mẫu: Mẫu cây hoa chuông được nhập từ Trung tâm công nghệ sinh học

Thành Phố Hồ Chí Minh (Hình 2.1)

==============================================================

Hình 2.1 Nguyên liệu vào mẫu

Thí nghiệm gồm 12 công thức, tương ứng với 4 mốc thời gian khác nhau và 3 cơ quan khác nhau Hóa chất khử trùng sử dụng là cồn 70% (2 phút), NaOCl 2% (5 – 20 phút) Các công thức thí nghiệm được trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng và cơ quan nuôi cấy đến sự tạo

nguồn vật liệu khởi đầu trong nuôi cấy in vitro cây hoa chuông

Công thức I

5

Đoạn thân mang mắt ngủ

Công thức IV

10

Đoạn thân mang mắt ngủ

Công thức VII

15

Đoạn thân mang mắt ngủ

Công thức X

20

Đoạn thân mang mắt ngủ

* Phương pháp đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro

Mẫu cây trước khi được đưa vào nuôi cấy in vitro phải được xử lý và chăm sóc kỹ

lưỡng, tránh xa môi trường ô nhiễm và các mầm bệnh gây hại cây Đồng thời sử dụng

các loại thuốc phòng trừ nấm bệnh cho cây như: Zineb, Manzate… Nhằm đảm bảo cho cây có chất lượng tốt nhất không mang các nấm bệnh

Mẫu đưa vào nuôi cấy: Đoạn thân mang mắt ngủ, lá non, chồi đỉnh của giống hoa chuông màu đỏ cánh kép

- Đoạn thân mang mắt ngủ: Chọn những cây khỏe đang trong thời kỳ sinh trưởng

sinh dưỡng, có kích từ 4,00 – 5,00 cm, cắt bỏ lá, rửa dưới vòi nước chảy, rửa bằng xà phòng, rửa lại bằng nước cất vô trùng, xử lý bằng cồn 70%(2 phút), NaOCl 2% (5 – 20 phút) cắt từng đoạn có chứa mắt ngủ, kích thước từ 1,00 – 1,50 cm, cấy vào môi trường nền

- Lá non: Chọn những lá non của những cây khỏe, đang trong thời kỳ sinh trưởng

sinh dưỡng, rửa dưới vòi nước chảy, rửa bằng xà phòng, rửa bằng nước cất vô trùng, xử

lý hóa chất khử trùng Cắt thành từng mảnh có kích thước khoảng 1 x 1 cm, cấy vào môi trường nền

- Chồi đỉnh: Chọn chồi của cây to khỏe, rửa dưới vòi nước chảy, rửa bằng xà

phòng, rửa bằng nước cất vô trùng, xử lý hóa chất khử trùng sau đó cấy vào môi trường nền

 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHTTTV (BAP, NAA, IAA) lên

sự phát sinh chồi bất định từ các bộ phận khác nhau của cây

o Thí nghiệm 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của BAP lên sự phát sinh chồi bất

định từ các bộ phận khác nhau

Mục đích: Xác định được nồng độ thích hợp của chất ĐHTTTV BAP đến khả

năng phát sinh chồi bất định từ các bộ phận khác nhau

==============================================================

Nguồn mẫu: Là các bộ phận khác nhau (lá, thân, chồi đỉnh) kế thừa từ thí nghiệm

1 được tách riêng để quan sát Mẫu cây sau khi tái sinh được thể hiện ở Hình 2.2

Hình 2.2 Mẫu cây được tái sinh từ thí nghiệm 1

Thí nghiệm gồm 7 công thức khác nhau được áp dụng trên 3 bộ phận (lá, thân, chồi đỉnh) tương ứng với các nồng độ khác nhau Các công thức trong thí nghiệm được trình bày trong Bảng 2.2

Kết quả thí nghiệm được ghi nhận sau 8 tuần và số liệu được theo dõi 7 ngày/lần

Bảng 2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi bất định từ các