Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chỉ Đảng Sâm (Codonopsis sp) bằng kỹ thuật AND mã vạch : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 70

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thanh Nga ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM (Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thanh Nga ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM (Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội – 2012 ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chi Codonopsis 1.1.1 Phân loại học 1.1.2 Sơ lược đặc điểm hình thái phân bố 1.1.3 Thành phần hóa học giá trị sử dụng Codonopsis y học cổ truyền…………… 1.2 Tổng quan mã vạch ADN (DNA barcode) 11 1.3 Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi tình hình nghiên cứu 13 1.3.1 Mã vạch ADN động vật 13 1.3.2 Mã vạch ADN thực vật 14 1.4 Ứng dụng mã vạch ADN thực vật 19 1.4.1 Ứng dụng thực vật nói chung 19 1.4.2 Ứng dụng mã vạch ADN nhận biết dược liệu 24 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu nghiên cứu 32 2.1.1 Vật liệu thực vật 32 2.1.2 Hóa chất 32 2.1.3 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 33 2.1.4 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 33 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 33 2.2.2 Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết 34 2.2.3 Phương pháp nhân gen đích kỹ thuật PCR 35 2.2.4 Tinh sản phẩm PCR giải trình tự 36 2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu 37 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Tách chiết ADN tổng số 38 iii 3.2 Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 39 3.3 Phân tích kết 40 3.3.1 Phân tích đa hình trình tự ADN vùng gen nghiên cứu 41 3.3.2 Xây dựng phát sinh chủng loại 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 iv DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Bảng liệt kê số nghiên cứu sử dụng mã vạch ADN công cụ nhận diện [25] 21 Bảng Một số dự án mã vạch ADN thực vật thực hay giai đoạn dự kiến năm 2011 [30] 23 Bảng Những cặp mồi sử dụng thông dụng việc khuyếch đại giải trình tự mã vạch ADN 26 Bảng Địa điểm thu mẫu thông tin mẫu sử dụng nghiên cứu 32 Bảng Các cặp mồi sử dựng nghiên cứu 33 Bảng Thành phần phản ứng PCR 35 Bảng Chu trình nhiệt cho gen ITS 35 Bảng Chu trình nhiệt cho gen matK 35 Bảng Kết đo OD số mẫu nghiên cứu 39 Bảng 10 Bảng thống kê điểm sai khác trình tự ADN lồi Codonopsis vùng gen ITS 45 Bảng 11 Tỷ lệ % nhận diện gen ITS (nửa đường chéo) số khác biệt (nửa đường chéo) 21 mẫu Codonopsis 50 Bảng 12 Bảng thống kê điểm đa hình trình tự gen matK loài Codonopsis nghiên cứu 53 Bảng 13 Tỷ lệ phần trăm nhận diện gen matK (nửa đường chéo) số khác biệt loài (nửa đường chéo) 16 mẫu Codonopsis 56 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Loài Codonopsis pilosula Hình Hoa lồi C javanica Hình Codonopsis tangsheng Hình Hoa loài (a) C nervosa (b) C.lanceolata (c) C ussuriensis Hình Kết điện di ADN tổng số mẫu Codonopsis gel agarose 1%, marker 1kb … 38 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen ITS mẫu Codonopsis gel agarose 1%, marker 100bp 40 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK mẫu Codonopsis gel agarose 1% 40 Hình Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp MP chạy khung đọc gen ITS, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 58 Hình Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp MP chạy khung đọc gen matK, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 59 Hình 10 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp Bayesian khung đọc gen ITS, chọn mẫu cách 1000 hệ, phân tích 5x106 hệ……… 60 Hình 11 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp Bayesian khung đọc gen matK, chọn mẫu cách 1000 hệ, phân tích 5x106 hệ…………………………………………………………………………………… 61 vi BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Bp Base pair Cặp bazơ nitơ dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotit triphosphat EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Axit ethylene diamine tetraacetic Acid Kb Kilobase (= 1000 bp) 1000 cặp bazơ MP Maximum Parsimony Thuật toán tiết kiệm tối đa OD Optical density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase Rcf relative centrifugal force Lực ly tâm tương đối mtDNA mitochondrial DNA ADN ty thể IGS intergenic spacer vùng liên gen vii MỞ ĐẦU Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng Theo thống kê sơ bộ, Việt Nam biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 lồi Rêu, 600 lồi Nấm 2000 lồi Tảo Trong có nhiều loài dùng làm thuốc Theo kết điều tra Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), tính đến năm 2005 ghi nhận 3948 loài thực vật nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài động vật 75 loại khống vật có cơng dụng làm thuốc Trong tổng số 3948 loài thuốc, gần 90 % mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu quần xã rừng, có gần 10 % thuốc trồng Bộ Y tế thống kê, năm Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 dược liệu khác để dùng y học cổ truyền làm nguyên liệu cho cơng nghiệp dược xuất Trong số đó, 2/3 khai thác từ nguồn thuốc mọc tự nhiên trồng trọt nước Riêng từ nguồn thuốc tự nhiên cung cấp tới 20.000 năm Khối lượng dược liệu thực tế bao gồm từ 200 loài khai thác đưa vào thương mại có tính phổ biến Bên cạnh đó, cịn nhiều lồi dược liệu khác thu hái, sử dụng chỗ cộng đồng chưa có số thống kê cụ thể Những số liệu cho thấy nguồn dược liệu nước ta phong phú đa dạng, việc sử dụng dược liệu làm thuốc có từ lâu đời phổ biến, có vai trò quan trọng kinh tế - xã hội Vấn đề đặt xác định xác loài thực vật dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với loài khác? Đặc biệt lồi có đặc điểm hình thái tương tự Trên giới, thực vật sử dụng làm thuốc từ thời tiền sử [8], [47], ghi nhận sử dụng điều trị nhiều bệnh khác nhau, phổ biến loài gần gũi với người [58] Trong y học cổ truyền nước, nhìn chung nguồn dược liệu, hợp chất bổ sung loại thuốc thảo dược thường xác định cấp độ loài qua tên khoa học (tên La tinh) chúng, đơn vị cho việc chuẩn bị công thức thảo dược [73] Dược điển quốc gia Trung Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm nhà quản lý bắt đầu mô tả loại thuốc thảo dược cách xác định tên loài thực vật sử dụng Thật không may, dược liệu thay làm giả cố ý (ví dụ lý lợi nhuận) vô ý (chẳng hạn sai sót ghi chép thiếu kiến thức) xuất khơng thực tế gây nguy nghiêm trọng việc sử dụng thuốc thảo mộc để điều trị hỗ trợ điều trị Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu nay, phương pháp dùng chủ yếu dựa phân tích hình thái vĩ mơ (quan sát mắt) vi mô (quan sát tiêu hiển vi) mẫu vật Công việc thường thực chuyên gia hình thái dược liệu Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại sau nguyên liệu thực vật qua xử lý sơ chế Vì vậy, phương pháp bổ sung giúp xác định xác lồi thuốc dựa hệ gen (ADN) đặc thù chúng phát triển vào cuối năm 1990 [62] Công việc nối tiếp thành tựu ứng dụng kỹ thuật phân tích DNA nghiên cứu hệ thống học thực vật bắt đầu khoảng mười năm trước [20] kể từ phát minh phản ứng chuỗi trùng hợp - PCR [13] Phương pháp PCR sau phát triển kỹ thuật giải trình tự ADN tự động tạo bước ngoặt có tính cách mạng nghiên cứu ADN Trong thực tế, nhà phân loại học phân tử hình dung danh mục tất loài sinh vật sống trái đất cách sử dụng kỹ thuật gọi mã vạch ADN (DNA barcode) thông qua việc xác định trình tự DNA ngắn đặc trưng chúng dùng chúng “mã vạch” để nhận biết mẫu sinh học kể chúng sơ chế bảo quản lâu dài [29], [66] Theo nguyên lý đó, phương pháp định danh dựa ADN phát triển cho việc nhận dạng loài thuốc ADN nhân lạp thể khuyếch đại (nhân bội) PCR sản phẩm PCR sau phân tích điện di gel, giải trình tự lai với đầu dị (DNA probe) đặc hiệu lồi “Dấu vân tay” (fingerprinting) hệ gen giúp phân biệt cá thể lồi, lồi chí quần thể loài; điều hữu ích cho việc đồng hóa (tiêu chuẩn hóa) dược liệu khả phát giả mẫu (tạp mẫu hay mẫu dễ nhầm lần hình thái/hóa học) [73] Dẫu trình tự đơn gen nhân hay gen lạp thể coi hữu ích cho định lồi, nghiên tiến hóa phân loại lồi thường u cầu phân tích liệu ADN từ nhiều gen số locut gen Việc phát mã vạch ADN lồi thuốc có giá trị bổ sung cho nghiên cứu tiêu chuẩn hóa kiểm định dược liệu nói riêng, đóng góp vào nỗ lực xác định mã vạch cho tất lồi sinh vật trái đất nói chung Từ thực tế trên, tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền số lồi Codonopsis Việt Nam kỹ thuật mã vạch ADN” Đề tài góp phần xác định mã vạch phân biệt loài thuộc chi Codonopsis cách kết hợp phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự ADN gen mã vạch ITS, matK, trnK Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 phân tách tốt gen ITS, có tồn lồi lồi C javanica Vì số lượng gen matK chi Codonopsis công bố GenBank nhiều so với gen ITS, phát sinh chủng loại dựa gen matK không đầy đủ loài với gen ITS, khơng có trình tự lồi C tangshen có trình tự tương đồng 100% gen ITS với mẫu C4 trình tự lồi C javanica tương đồng 100% gen ITS với mẫu nghiên cứu lại Tuy nhiên, mẫu C4 nằm nhóm I, nằm nhánh gần tương ứng giống chủng loại phát sinh chạy gen ITS, cụ thể C4 nhánh với C kawakamii với bootstrap 80% Cây phát sinh chủng loại thu chạy phương pháp Bayesian khung đọc riêng rẽ vùng gen ITS matK Hình 10 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phƣơng pháp Bayesian khung đọc gen ITS, chọn mẫu cách 1000 hệ, phân tích 5x106 hệ 60 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 Hình 11 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phƣơng pháp Bayesian khung đọc gen matK, chọn mẫu cách 1000 hệ, phân tích 5x106 hệ Ở phát sinh chủng loại thu phương pháp Bayesian khung đọc gen ITS, mẫu C clematide C lanceolata không nằm nhánh I nữa, mà chung nhánh phát sinh với nhóm I nhóm II, với số posterior probability (PP) thấp 50% Tuy nhiên, hai nhánh I II, phát sinh chủng loại nhánh tương đồng với phát sinh chủng loại khung đọc gen ITS, mẫu C4 nhánh với mẫu C tangshen với số PP cao 97 %, mẫu lại nhánh với C javanica với PP 87% Điều cho thấy, phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Bayesian khung đọc gen ITS mẫu nghiên cứu có quan hệ gần gũi với loài C tangshen C javanica, nhiên, liệu vùng gen ITS chưa đủ để phương pháp Bayesian phân tách loài C clematide C lanceolata nhánh với số PP tin cậy 61 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 Cây phát sinh thu theo phương pháp Bayesian dựa khung đọc gen matK hoàn toàn tương đồng với phân loại thu dựa theo phương pháp MP Cụ thể, mẫu C4 nhánh với mẫu C kawakamii với PP 100%, mẫu lại nằm nhánh II với số nhánh 100%, nhóm II tồn lồi với số PP cao, là: nhánh C11, C12, C18 99%; C14, C15, C16, C17 74%, nhánh C2, C21 100% Điều khẳng định lại lần nữa, gen matK có khả phân tách tốt vùng gen ITS, sử dụng gen để xác định loài 62 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thu được, chúng tơi đưa số kết luận sau: Đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS matK, kết phân tích đa hình vùng gen cho thấy vùng gen ITS kích thước từ 638-650 bp xuất 113 điểm đa hình, chiếm 17,4% tồn trình tự vùng gen, có độ đa hình cao so với gen matK kích thước 871 bp với 61 điểm đa hình xuất hiện, chiếm 7% tồn trình tự Từ kết so sánh phân tích trình tự ADN vùng gen ITS xác định mẫu nghiên cứu C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21 thuộc loài C javanica mẫu C4 thuộc loài C tangshen Với tương đồng 100% trình tự, vùng gen ITS bảo thủ loài C javanica C tangshen, có ý nghĩa kiểm định dược liệu Xây dựng phát sinh chủng loại dựa phương pháp Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony) Bayesian dựa khung đọc riêng rẽ gen ITS matK cho kết tương đồng, cho thấy độ đáng tin cậy thu phương pháp MP Bayesian sử dụng để xây dựng chủng loại phát sinh chi Codonopsis Các phân loại xây dựng cho kết luận xác định mẫu nghiên cứu thuộc hai loài C javanica (đối với mẫu C2 thu ở, C11, C12 thu Kon Tum, mẫu C13, C14, C15, C16, C17, C18 thu Lạc Dương, Lâm Đồng mẫu C20, C21 thu xã Long Hẹ, Sơn La) C tangsheng (đối với mẫu C4 thu Sa Pa, Lào Cai) Kết phân tích trình tự ADN phát sinh chủng loại cho kết luận vùng gen matK có khả phân biệt tốt vùng gen ITS, vùng gen matK sử dụng để phân biệt loài chi Codonopsis Nghiên cứu lần ứng dụng mã vạch ADN phân tích đa dạng di truyền lồi Codonopsis Việt Nam, kết nghiên cứu trước giới khẳng định vùng gen ITS matK giúp nhận diện lồi lồi mã vạch phân tử, đồng thời công nghệ dùng cho nghiên 63 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 cứu tiến hóa học phân tử nghiên cứu bảo tồn nguồn gen loài dược liệu quý Kiến nghị Tiếp tục thu thập thêm mẫu thuộc chi Codonopsis để đánh giá tồn diện tính đa dạng phân bố chi Việt Nam Nghiên cứu ứng dụng mã vạch phân tử cho nguồn dược liệu quý khác Việt Nam 64 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Văn Chi (1999), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học Viện Dược Liệu (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Giáo Dục Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tôn, Cao Xuân Hiếu, Nguyễn Thùy Dương, Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Đặng Văn Hạnh, Lã Đình Mỡi, Lê Trần Bình, Nơng Văn Hải (2003), “Tách dịng xác định trình tự gen 18S rRNA Bình vơi”, Tạp chí Cơng nghệ SInh học, 1, pp 203-209 Đỗ Bích Huy (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thúy Hạnh, Trần Quốc Trọng (2007), “Kết sử dụng số chuỗi gen lục lạp nghiên cứu đa dạng di truyền xuất xứ lâm nghiệp”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5, pp 77-83 Tiếng Anh A., H.R (2005), “Medicinall plants: historical and cross-cultural usage patterns”, AEP, 15, pp 686-699 Albach D C., L.H.Q., Zhao N., Jensen S R (2007), “Molecular systematics and phyotchemistry of Rehmannia (Scrophulariaceae)”, Biochem Syst Ecol, 35, pp 293-300 10 Alvarez I., W.J.F (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, pp 417-434 11 B., H.M (1999), “Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation”, Molecular Ecology, 8, pp 513525 65 Luận văn Thạc sĩ 12 Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 Bailey C D., C.T.G., Harris S A., Hughes C E (2003), “Characterization of angiosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, pp 435-455 13 Bartlett J, S.D (2003), “A short history of the polymerase chain reaction”, Humana Press Inc., pp 1-6 14 Bruni I., D.M.F., Galimberti A., Galasso G., Banfi E., Et Al (2010), “Identification of poisonous plants by DNA barcoding approach”, International Journal of Legal Medicine 124, pp 595-603 15 Chen F., C.H.Y., Wong K L ,Wang J., Yu M T., but P P H., Shaw P C and (2008), “Authentication of Saussurea lappa, an endangered medicinal material, by ITS DNA and 5S rRNA sequencing.”, Planta Medica, 74, pp 889–892 16 Chen S., Y.H., Han J., Liu C., Song J., Et Al (2010), “Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PLoS ONE 5: e8613 17 Chiou S J., Y.J.H., Fang C L., Chen H L., Lin T Y (2007), “Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers”, Planta Medica, 1421-1426 18 Chun-Feng Qiao, Q.-B.H., Zhi-Li Zhao, Zheng-Tao Wang, Luo-Shan Xu and Hong-Xi Xu (2009), “Sequence Analysis Based on ITS1 Region of Nuclear Ribosomal DNA of Amomum villosum and Ten Species of Alpinia”, Journal of Food and Drug Analysis, 17, pp 142-145 19 Cuenoud P., S.V., Chatrou L W., Et Al (2002), “Molecular phylogenetics of Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL, atpB, and matK DNA sequences”, American Journal of Botany, 89, pp 132-144 20 Dj., C (2000), “Plant macromolecular systematics in the past 50 years: one view”, Taxon, 49, pp 479-501 21 E., E (2006), “Herbal medicines-they are popular, but are they also safe?”, Eur J Clin Pharmacol, 62, pp 1-2 66 Luận văn Thạc sĩ 22 Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 Fay M F., S.S.M., Chase M W (1997), “Taxonomic affinities of Medusagyne oppositifolia (Medusagynaceae)”, Kew Bulletin, 52, pp 111-120 23 Fazekas A J., S.R., Newmaster S G., Hollingsworth P M (2010), “Stopping the stutter: Improvements in sequence quality from regions with mononucleotide repeats can increase the usefulness of non-coding regions for DNA barcoding”, Taãon, 59, pp 694-697 24 Gao T., S.Z., Yao H., Song J., Zhu Y., Et Al (2011), “ Identification of Fabaceae plants using the DNA barcode matK”, Planta Medica, 77, pp 92-94 25 Gao T., Y.H., Song J., Liu C., Zhu Y., Et Al (2010), “ Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2”, Journal of Ethnopharmacology, 130, pp 116-121 26 Ge Y F., H.Y.Y., Xia B., Wei Y L (2007), “Sequencing of trnL-F and analysis of interspecific genetic relationship of five medicinal species in Atractylodes DC.”, Journal of Plant Resources and Environment, 16, pp 12-16 27 Gonzalez M A., B.C., Engel J., Mori S A., Pe ´Tronelli P., Et Al (2009), “Identification of Amazonian trees with DNA barcodes”, PLoS ONE, 4: e7483 28 Group, C.P.W (2009), “A DNA barcode for land plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 106, pp 2794-12797 29 Hebert P D N , C.A., Ball S L , De Waard J R (2003), “Biological indentification through DNA barcodes”, Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270, pp 313-321 30 Hilu K W., L.H (1997), “The matK gene: sequence variation and application in plant systematics”, American Journal of Botany, 84, pp 830-839 31 Hollingsworth Pm, G.S., Little Dp (2011), “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PLoS ONE, 6(5) 32 Hu Y, Z.Q., Xin H, Qin Lp, Lu Br, Rahman K Et Al (2007), “Associtation between chemical and genetic variation of Vitex rotundifolia populations from different locations in China: ITS implication for quality control of medicinal plants”, Biomed Chromatogr, 21, pp 967-975 67 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 33 Huson, D (2007), Algorithms in Bioinformatics I, ZBIT pp.175-182 34 J., S (2001), “Biogcographic patterns and cryptic speciation in bryophytes”, Journal of Biogcography, 28, pp 253-261 35 Jaakola L., S.M., Haggman H (2010), “Novel approaches based on DNA barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses of berry species”, Food Chemistry, 123, pp 494-500 36 Jarman, S.N., Elliott, N G (2000), “DNA evidence for morphological àn cryptic Cenozoic speciations in the Anaspididae, "living fossils" from the Triassic”, J Evol Biol., 13, pp 624-633 37 Jhi., C (2002), “Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry”, J Nat Prod, 65, pp 1073-1084 38 Jones W P., C.Y.-W., Kinghorn A D (2006), “The role of pharmacognosy in modern medicine and pharmacy”, Current Drug Targets, 7, pp 247-264 39 Karehed J., G.I., Dessein S., Motley T J., Bremer B (2008), “The phylogenetic utility of chloroplast and nuclear DNA markers and the phylogeny of the Rubiaceae tribe Spermacoceae”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 49, pp 843-866 40 Kesanakurthi R P., F.a.J., Burgess K S., Percy D M., Newmaster S G., Et Al (2011), “ Spatial patterns of plant diversity below ground as revealed by DNA barcoding”, Molecular Ecology, 20, pp 1289-1302 41 Koehn Fe, C.G (2005), “The evolving role of natural products in drug discovery”, Nat Rev Drug Discov, 4, pp 206-220 42 Kojoma M., K.K., Yamada K., Sekita S., Satake M., Iida O (2002), “Genetic identification of cinnamon (Cinnamomum spp.) based on the trnL–trnF chloroplast DNA”, Planta Medica, 68, pp 94-96 43 Kress J., E.D.L (2007), “A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region”, PLoS One, 6, pp 1-10 68 Luận văn Thạc sĩ 44 Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 Kress, J.W., Wurdack, K J ,Zimmer, E A ,Weigt, L A & Janzen, D H (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp 8369-8374 45 Kress W J., E.D.L (2007), “A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the noncoding trnH–psbA spacer region”, PLoS One, 2: e508 46 L., H Rare flowers and common herbal supplements get unmasked with plant DNA barcoding (reporting unpublished data of Damon Little and David Baker) 2010 [cited; http://www.scientificamerican.com/blog/post.cfm?id Available = from: rare-flowers-and- common-herbal-supp-2010-04-18 47 L., H.B (2005), “The evolution of herbal medicine: behavioral perspectives”, Anim Behav, 70, pp 975-989 48 Lahaye R., V.D.B.M., Bogarin D., Warner J., Pupulin F., Et Al (2008), “DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots”, Proceedings of the National Academy of Sciences 105, pp 2923–2928 49 Lau D T., S.P.C., Wang J., but P P H (2001), “Authentication of medicinal Dendrobium species by the internal transcribed spacer of ribosomal DNA”, Planta Medica, 67, pp 456-460 50 Le, M., W.P Mccord, and J.B Iverson (2007), “On the paraphyly of the genus Kachuga (Testudines: Geoemydidae)”, Mol Phylogenet Evolution, 45(1), pp 398-404 51 Le, M., C.J Raxworthy, W.P Mccord, and L Mertz (2006), “A molecular phylogeny of tortoises (Testudines: Testudinidae) based on mitochondrial and nuclear genes”, Mol Phylogenet Evolution, 40(2), pp 517-531 52 Li, M., H Cao, P.P.-H But, and P.-C Shaw (2011), “Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes”, Journal of Systematics and Evolution, 49(3), pp 271-283 69 Luận văn Thạc sĩ 53 Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 Li M., J.R.W., Hon P M., Cheng L., Li L L., Zhou J R., Shaw P C., but P P H (2010), “ Authentication of the anti-tumor herb Baihuasheshecao with bioactivemarker compounds andmolecular sequences”, Food Chemistry, 119, pp 1239-1245 54 Li M., L.K.H., Lam H., Shaw P C., Cheng L., Techen N., Khan I A., Chang Y S., but P P H (2010), “Cardiocrinum seedsasa replacement forAristolochia fruITS in treating cough”, Journal of Ethnopharmacology, 130, pp 429-432 55 Li P., C.Z.H., Xing J B (2001), “Preliminary attempt to identify geoherbalism of Flos Lonicerae by sequence divergence of 5S-rRNA gene spacer region”, ChineseTraditional and Herbal Drugs 322, pp 834-837 56 Liu Jie, M.M., Gao L-M, Zhang D-Q, Li D-Z (2010), “DNA barcoding for the discrimination of Eurasian yews (Taxus L., Taxaceae) and the discovery of cryptic species”, Molecular Ecology Resources, 11, pp 89–100 57 M Sanderson, B.B., G Bharathan, C Campbell, D Ferguson, J M Porter, C V Dohlen, M.Wojciechowski, and M Donoghue (1993), “The growth of phylogenetic information and the need for a phylogenetic database.”, Syst Biol., 42, pp 562-568 58 Ma., H (2001), “Self-medicative behavior in the African great apes: an evolutionary perspective into the origins of human traditional medicine”, Bioscience, 51, pp 651-661 59 Mark Y S., H.P.D.N (2008), “Barcode of life”, Scientific American, pp 82-88 60 Miwa H, O.I., Matsui a, Hascgawa M, Akiyama H, Et Al (2009), “Adaptive evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes).”, Gene, 441, pp 169-175 61 Miwa H., O.I.J., Matsui A., Hasegawa M., Akiyama H., Et Al (2009), “Adaptive evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes)”, Gene, 441(169-175) 62 Mizukami H., O.K., Kitamura Y., Ikenaga T (1993), “Restriction fragment length polymorphism (RFLPs) of medicinal plants and crude drugs.l.RFLP 70 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 probes allow clear identification of Duboisia interspecific hybrid genotypes in both fresh and dried tissues”, Biol Pharm Bull, 16, pp 388-390 63 Newman D J., C.G.M., Snader K M (2000), “The influence of natural products upon drug discovery”, Nat Prod Rep, 17, pp 215-234 64 Ogden R., M.H.N., Cowan R S., Chua L., Groves M., Et Al (2008), “SNPbased method for the genetic identification of ramin Gonystylus spp timber and products: applied research meeting CITES enforcement needs”, Endangered Species Research, 9, pp 255-261 65 Organization, W.H Traditional Medicine 2008 [cited; Fact Sheet N134] Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/ 66 Ratnasingham S., H.P.D.N (2007), “BOLD: the barcode of life data system”, Mol Ecol Notes, 7, pp 355-364 67 Ren B Q., X.X.G., Chen Z D (2010), “Species identification of Alnus (Betulaceae) using nrDNA and cpDNA genetic markers”, Molecular Ecology Resources, 10, pp 594-605 68 Saunders, G.W (2005), “Applying DNA barcoding to red macroalgae: a preliminary appraisal holds promise for future applications”, Phil Trans R Soc B, 360, pp 1879-1888 69 Shaw J., L.E.B., Schilling E E., Small R L (2007), “Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III”, American Journal of Botany 94, pp 275-288 70 Song J., Y.H., Li Y., Li X., Lin Y., Et Al (2009), “Authentication of the family Polygonaceae in Chinese pharmacopoeia by DNA barcoding technique”, Journal of Ethnopharmacology, 124, pp 434-439 71 Srirama R., S.U., Sreejayan N., Ravikanth G., Gurumurthy Br., Et Al (2010), “Assessing species admixtures in raw drug trade of Phyllanthus, a hepatoprotective plant using molecular tools”, Journal of Ethnopharmacology, 130, pp 208-215 71 Luận văn Thạc sĩ 72 Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 Stech M., K.E., Loonen Mjje, Vrieling K., Kruijer J D (2011), “ Bryophyte DNA sequences from faeces of an arctic herbivore, barnacle goose (Branta leucopsis)”, Molecular Ecology Resources, 11, pp 404-408 73 Sucher, N.J and M.C Carles (2008), “Genome-based approaches to the authentication of medicinal plants”, Planta Med, 74(6), pp 603-623 74 Tautz, D., Arctander, P., Minelli, A., Thomas, R H & Vogler, A P (2003), “A plea for DNA taxanomy”, Trends Ecol Evol., 18, pp 70-74 75 Tzu-Chao Lin, C.-C.H., Dinesh Chandra Agrawal, Chao-Lin Kuo, Fu-Shin Chueh, Hsin-Sheng Tsay (2007), “ITS Sequence Based Phylogenetic Relationship of Dangshen Radix”, Journal of Food and Drug Analysis, 15, pp 428-432 76 Von Crautlein M., K.H., Pietilainen M., Rikkinen J (2011), “DNA barcoding: a tool for improved taxon identification and detection of species diversity”, Biodiversity and Conservation, 20, pp 373-389 77 Wang X., T.Y., Yoshimaru H., Nagasaka K., Szmidt A E (1999), “Phylogenetic relationships of Eurasian pines (Pinus, Pinaceae) based on chloroplast rbcL, matK, rpl20-rps18 spacer, and trnV intron sequences”, American Journal of Botany 86, pp 1742-1753 78 Wilson, K.H (1995), “Molecular biology as a tool for taxonomy”, Clin Infect Dí , 20, pp 192-208 79 Yamaji H., F.T., Yokoyama J., Pak J-H., Zhou C., Yang C Et Al (2007), “Reticulate evolution and phylogeography in Asarum sect asiasarum (Aristolochiaceae) documented in internal transcribed spacer sequences (ITS) of nuclear ribosomal DNA”, Mol Phylogenet Evol, 44, pp 863-884 80 Yan P., P.Q.H., Jiao X W., Zhao X., Shen Y J., Zhao S J (2008), “Genetic variation and identification of cultivated Fallopia multiflora and ITS wild relatives by using chloroplast matK and 18S rRNA gene sequences”, Planta Medica, 74(1504-1509) 72 Luận văn Thạc sĩ 81 Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 Yang D Y., F.H., Cai S Q., Komatsu K (2004), “Molecular analysis of Rheum species used as Rhei Rhizoma based on the chloroplast matK gene sequence and ITS application for identification”, Biological & Pharmaceutical Bulletin, 27, pp 375-383 82 Yang Z Y., C.Z., Huo K K., Xie H., Tian Z P., Pan S L (2007), “ITS sequence analysis used for molecular identification of the Bupleurum species from northwestern China”, Phytomedicine, 14, pp 416-423 83 Yao H., S.J.Y., Ma X Y., Liu C., Li Y., Xu H X., Han J P., Duan L S., Chen S L (2009), “Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence: the chloroplast psbA–trnH intergenic region”, Planta Medica, 75, pp 667-669 84 Zhang Y., Z.J.C., Huang M H., Yang M S., Cao H (2006), “Detection of genetic homogeneity of Panax notoginseng cultivars by sequencing nuclear 18S rRNA and plastid matK genes”, Planta Medica, 72, pp 860-862 85 Zhao Z L., L.C.H., Wang Z T (2007), “Identification of Dryopteris crassirhizoma and the adulterant species based on cpDNA rbcL and translated amino acid sequences”, Planta Medica, 73, pp 1230-1233 73 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19 PHỤ LỤC Phụ lục Thông tin mã số trình tự GenBank sử dụng nghiên cứu Gen ITS matK Tên loài Mã số GenBank Campanula peregrina EU177772 Cyananthus lobatus JF976203 C clematidea HQ010404 C kawakamii DQ810274 C lanceolata AY548195 C modesta AF134859 C nervosa AF136237 C pilosula EF190460 C pilosula var Modesta EF190461 C pilosula FJ572048 C tangshens EF190462.1 C javanica subsp japonica DQ889459 Campanula peregrina EU713320 Cyananthus lobatus JF953621 C kawakamii EU713253 C lanceolata EU713248 C nervosa JN851164 C pilosula JN851165 C viridis EU713249 Phụ lục Kết giải trình tự vùng gen ITS matK số mẫu nghiên cứu b