thiết kế mồi một đoạn gen chưa biết

Bạch cầu vốn đảm nhiệm nhiệm vụ bảo vệ cơ thể nên khi tăng số lượng một cách đột biến như vậy, nó sẽ bị thiếu thức ăn cũng như nguồn cấp dinh dưỡng, vì thế bạch cầu sau đó thường ăn chín

Trang 1

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH: THIẾT KẾ MỒI MỘT ĐOẠN GEN

CHƯA BIẾT

Nhóm sinh viên thực hiện: MSSV Cao Hoàng Minh Hiếu 20174683

Trang 2

I TỔNG QUAN ĐỀ TÀI

- Tính trạng quan tâm : ung thư máu

- Lý do chọn tính trạng : Nhóm em cảm thấy hứng thú khi tìm hiểu về căn bệnh này bởi đây là căn bệnh ung thư duy nhất mà không tạo ra khối u Ung thư máu hay còn gọi là bệnh máu trắng, đây là loại ung thư ác tính, xuất hiện khi cơ thể bắt đầu có hiện tượng bạch cầu gia tăng đột biến Bạch cầu vốn đảm nhiệm nhiệm

vụ bảo vệ cơ thể nên khi tăng số lượng một cách đột biến như vậy, nó sẽ bị thiếu thức ăn cũng như nguồn cấp dinh dưỡng, vì thế bạch cầu sau đó thường ăn chính hồng cầu - thành phần quan trọng của máu

- Gene quyết định tính trạng : FLT3

- Quá trình tìm hiểu về gene quy định tính trạng: vào www.google.com.vn, tra tính trạng ung thư máu ở người thì tìm ra gene quy định là FLT3

II QUÁ TRÌNH TÌM VÙNG BẢO THỦ CỦA GENE

- Vào trang https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, gõ tìm gene “FLT3” ở trong mục Nucleotide, tìm được ở người chứa vùng gene

- Trình tự nucleotide ở FASTA của 3 dữ liệu lần lượt là:

>MT001898.1 Homo sapiens isolate AML_33F/40F/47F FLT3 (FLT3) gene, partial cds

CAATTTAGGTATGAAAGCCAGCTACAGATGGTACAGGTGACCGGCTCCTCAGAATAATGAGTACTTCTAC GTTGATTTCAGAGAATATGAATATGATCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTG

>MT001897.1 Homo sapiens isolate AML_34F FLT3 (FLT3) gene, partial cds CAATTTAGGTATGAAAGCCAGCTACAGATGGACAGGTGACCGGCTCCTCAGATAATGAGTACTTCTACGT TGATTTCAGAGAATATGAATATGATCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTGGTAAGAAT GGAATGTGCCAAATGTTTCTGCAGCATTTCTTTTCCATTGGAAAATCTTTAAAATGCACGTACTCACCAT TTGTCTTTGCAGGGAAGGTACTAGGATCAGGTGCTTTTGGAAAAGTGATGAACGCAACAGCTTATGGAAT TAGCAAAACAGGAGTCTCAATCCAGGTTGCCGTCAAAATGCTGAAAG

>MT001896.1 Homo sapiens isolate AML_21F FLT3 (FLT3) gene, partial cds CAATTTAGGTATGAAAGCCAGCTACAGATGGTACAGGTGGACCGGCTCCTCAGATAATGAGTACTTCTAC GTTGATTTCAGAGAATATGAATATGATCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTGGTAAGA ATGGAATGTGCCAAATGTTTCTGCAGCATTTCTTTTCCATTGGAAAATCTTTAAAATGCACGTACTCACC ATTTGTCTTTGCAGGGAAGGTACTAGGATCAGGTGCTTTTGGAAAAGTGATGAACGCAACAGCTTATGGA ATTAGCAAAACAGGAGTCTCAATCCAGGTTGCCGTCAAAATGCTGAAAG

- Vào trang http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl, copy 3 vùng gene mà mình đã chọn vào và để chương trình chạy, tìm ra được các Nu tương đồng giữa 3 vùng gene, sau đó chọn vùng bảo thủ là vùng có khoảng 18 – 24 bp hoặc dài hơn:

“TAATG AGTACTTCTA CGTTGATTTC AGAGAATATG AATATGATCT

CAAATGGGAG TTTCCAAGAG AAAATTTAGA”

Trang 3

III YÊU CẦU ĐỐI VỚI CẶP MỒI DÙNG TRONG PHẢN ỨNG PCR

- Vào trang: http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl copy 3 gen và để chương trình chạy , copy tất cả phần consensus cho vào link

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ điền vào

 Forward primer from 56 to 135

 Reverse primer from 192 to 327

 PCR produce size min 70 max 1000

 Primer melting temperatures ( TM ) min 57,0 opt 60,0 max 63,0 max Tm difference 3

 Cho chạy chương trình và tìm được đoạn mồi đáp ứng đủ yêu cầu sau:

 Độ dài từ 18 – 24 bp

 Nhiệt độ bắt mồi của 2 mồi là 4oC (thỏa mãn không chênh lệch quá 5oC)

 Tỉ lệ GC 40 -60 %

 5 nu cuối đầu 3’ có 2 GC Primer pair 1

Sequence (5'->3') Template

strand Length Start Stop Tm GC%

Self complementarity

Self 3' complementarity Forward

primer TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGA Plus 24 95 118 59.65 41.67 4.00 2.00

Reverse

primer CCCTGCAAAGACAAATGGTGA Minus 19 224 204 59.04 47.62 4.00 1.00

Product

length 130

Primer pair 2

Reverse

primer TCCCTGCAAAGACAAATGGTG Minus 21 225 205 59.04 47.62 4.00 1.00

Product

length 131

Trang 4

Primer pair 3

Reverse

primer CCTTCCCTGCAAAGACAAATGG Minus 22 228 207 60.03 50 4.00 1.00

Product

length 134

Primer pair 4

Reverse

primer CCCTGCAAAGACAAATGGTGAG Minus 22 224 203 60.03 50.00 4.00 0.00

Product

length 130

Primer pair 5

primer CTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGA Plus 23 96 118 58.34 43.48 4.00 2.00

Reverse

Product

length 129

Trang 5

Primer pair 6

Reverse

Product

length 130

Primer pair 7

primer TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAG Plus 23 95 117 58.34 43.48 4.00 0.00

Reverse

Product

length 130

Primer pair 8

Reverse

Product

length 131

Trang 6

Primer pair 9

Reverse

primer CCTTCCCTGCAAAGACAAATGG Minus 22 228 207 60.03 50.00 4.00 1.00

Product

length 133

Primer pair 10

Reverse

primer CCTTCCCTGCAAAGACAAATGG Minus 22 228 207 60.03 50.00 4.00 1.00

Product

length 134

Trang 7

Chọn đoạn mồi số 1, vào trang

https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.html để tiến hành chạy PCR:

Kết quả chạy PCR:

>130 bp product from linear template MT001897.1 Homo sapiens isolate

AML_34F FLT3 (FLT3) gene, partial cds, base 95 to base 224 (T7 - T3)

TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTGGTAAGAATGGAATGTGCCAAAT

GTTTCTGCAGCATTTCTTTTCCATTGGAAAATCTTTAAAATGCACGTACTCACCATTTGT

CTTTGCAGGG

Trang 8

IV THÔNG TIN VỀ PROTEIN

1 Trình tự protein mà gene được tách dòng mã hóa

Vào trang expasy.org, tìm https://web.expasy.org/translate/, copy phần chạy PCR test

và cho chạy chương trình, ta được:

5'3' Frame 1

SQMGVSKRKFRVW-EWNVPNVSAAFLFHWKIFKMHVLTICLCR

5'3' Frame 2

LKWEFPRENLEFGKNGMCQMFLQHFFSIGKSLKCTYSPFVFAG

5'3' Frame 3

SNGSFQEKI-SLVRMECAKCFCSISFPLENL-NARTHHLSLQ

3'5' Frame 1

PCKDKW-VRAF-RFSNGKEMLQKHLAHSILTKL-IFSWKLPFE

3'5' Frame 2

PAKTNGEYVHFKDFPMEKKCCRNIWHIPFLPNSKFSLGNSHLR

3'5' Frame 3

LQRQMVSTCILKIFQWKRNAAETFGTFHSYQTLNFLLETPI-

2 Khối lượng phân tử, điểm đẳng điện

Mở https://web.expasy.org/, vào phần proteomics, rồi vào phần Compute pI/MW ,

copy phần

5'3' Frame 1

SQMGVSKRKFRVW-EWNVPNVSAAFLFHWKIFKMHVLTICLCR

Trang 9

Vào và cho chạy chương trình, ta ra kết quả:

- Điểm đẳng điện: 10.45

- Khối lượng phân tử: 5729.90

3 Vị trí của protein trong tế bào

- Vào trang https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Chọn “ Nucleotide BLAST”

Copy kết quả PCR test cho chạy chương trình:

Trang 10

Ra được kết quả:

Ta thấy có 3 loài có mức độ tương đồng 100% với FLT3, ta chọn MT001896.1, click vào, chọn FASTA, ta có trình tự protein:

Homo sapiens isolate AML_21F FLT3 (FLT3) gene, partial cds

GenBank: MT001896.1

GenPeptIdentical ProteinsGraphics

Trang 11

- Vào http://phobius.sbc.su.se/, copy trình protein ở trên vào và chạy chương trình, ta được kết quả:

Nhận xét:

- Từ ảnh, ta thấy đường màu xanh dương biểu diễn nằm ngoài tế bào chất, đường xanh

lá câu biểu diễn nằm trong tế bào chất, đường màu xám biểu diễn xuyên màng

- Ta thấy, tỉ lệ aa nằm ngoài tế bào chất chiếm khoảng 87%, trong khi tỉ lệ aa nằm trong tế bào chất khoảng 17%, còn tỉ lệ aa xuyên màng hầu như k có

=> Có thể kết luận protein đang xét nằm ngoài Tế bào chất

4 Dự đoán chức năng protein

- Vào https://www.expasy.org/, chọn proteomics, chọn protein modifications, chọn UniProtKB/Swiss-Prot, vào BLAST, copy trình tự protein

Trang 12

- Vào và chạy chương trình, cho ra kết quả:

- Ta chọn protein có tỉ lệ cao nhất là 95.8% và thu được phần dự đoán chức năng:

- Vào trang

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAST_TYPE=Ba

stSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttad&LAST_PAGE=tblastn copy

đoạn protein vào mục: “ Enter accession number(s), gi(s), or FASTA

sequence(s)”

Trang 13

- Chọn dạng Database là Protein Data Bank protein(pdb) => ấn BLAST

- Kết quả:

 Chọn kết quả có sự tương đồng cao nhất => Ấn vào đường link ở mục Accession

Trang 14

 Vào mục Protein 3D Structure Hoặc vào trang:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ => chọn hộp thư Structure => Copy mã

1RJB vào và chạy

- Kết quả:

 Ấn Dowload về máy => Sử dụng phần mềm Cn3D 4.3.1 => mở file vừa tải về để xem cấu trúc 3D của nó

Trang 15

 Vào mục Style => Coloring Shortcuts: Chọn màu để thể hiện các cấu trúc 3D

 Ngoài ra, các vùng khác sẽ được xác định ở trang cấu trúc 3D khi

download cấu trúc về

Trang 16

 Hoặc ấn vào full-featured 3D viewer

 Sử dụng các công cụ như trong phần mềm Cn3D:

Trang 17

- Xác định các tính trạng, cấu trúc

 Chuỗi α và β: Style => Coloring Shortcuts => Secondary Structure

 Vùng: Style => Coloring Shortcuts => Domain

Trang 18

 Vùng kỵ nước: Style => Coloring Shortcuts => Hydrophobicity

 Các phân tử: Style => Coloring Shortcuts => Molecule

Trang 19

 Vùng bảo thủ: Style => Coloring Shortcuts => Sequence Conservation

 Nhiệt độ: Style => Coloring Shortcuts => Temperature

Trang 20

VI NHẬN XÉT

- Sản phẩm sau khi thu được có khả năng sẽ biểu hiện được tính trang do ta thấy

có khá nhiều gene có độ tương đồng từ 90 – 100%

- Kết quả ta thu được cũng chỉ mang tính chất tham khảo nên nếu muốn có được kết quả chính xác nhất ta cần nghiên cứu kết hợp với thực tế để thu được mẫu rồi thử xem có thể biểu hiện được tính trạng mà chúng ta cần hay không

Tiêu đề	Thiết kế mồi một đoạn gen chưa biết
Tác giả	Cao Hoàng Minh Hiếu, Đỗ Thị Quỳnh Mai, Phùng Tuấn Minh
Chuyên ngành	Sinh học
Thể loại	Báo cáo thí nghiệm

Định dạng
Số trang	20
Dung lượng	2,69 MB