Bài viết tiến hành định danh đến loài xạ khuẩn dựa vào đặc điểm hình thái, đặc tính hóa sinh và trình tự gene vùng 16S-rRNA. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 sâu bệnh hại rừng trồng” NXB Nông nghi p, H N i, Nguyễn Viết Tùng, Bảng tra phân loại côn trùng (theo pha trưởng thành), NXB Nông nghi p, H N i Ph m Quang Thu, Danh mục sinh vật gây hại 17 loại lâm nghiệp Việt Nam NXB Nông nghi p H N i, Phản biện: PGS.TS Lê Văn Trịnh ĐỊNH DANH XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM FUSARIUM SOLANI GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ CÂY CĨ MƯI Identification of Actinomycete as Potential Antagonistic Ability Control Yellow Leaf and Root Rot Disease on Citrus Lê Minh Tƣờng, Ngơ Thành Trí Nguyễn Hồng Q Nghiên cứu viên ngành Bảo vệ hực vật, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần hơ Ngày nhận bài: 16.07.2018 Ngày chấp nhận: 08.08.2018 Abstract Three actinomyces isolates that have inhibit growth of Fusarium solani cause yellow leaf and root rot on citrus are collected and isolated from citrus fields in Long My district, Hau Giang province (LM6 and LM25) and Lai Vung district, Dong Thap province (LV74) of the Mekong delta in 2017 (Le Minh Tuong et al., 2018) In this research, the these actinomycete isolates were identified based on morphological characteristics of cultured colony on the ISP mediums and their biochemical characteristics In addition, the these isolates were also identified based on the 16SrRNA gene sequence The results showed that LM6 and LM25 isolates are straight form of spore-bearing mycelium and spore chains; LV isolate’s spore-bearing mycelium belongs to straight form, spore chains with hooks form; surface spores was smooth with three isolates The colors of substrate of the LM6 isolate belongs to red group, LM25 isolate belongs to light yellow group and LV74 isolate be long to white group The LM6 and LM25 isolates can product melanin pigment, the LV isolate can’t product melanin pigment and all isolates have ability to product extracellular enzymes such as protease, lipase, amylase Comparison of the 16S-rDNA gene sequence with existing on Gene bank indicated that LM6 isolate showed 99% similarity with Streptomyces capoamus isolate, LM25 isolate showed 100% similarity with Streptomyces bacillaris isolate and LV74 isolate showed 99% similarity with Streptomyces lavendulae isolate The results of this study will be a basis for further researchs, contributing in applications of actinomycetes as biocontrol to yellow leaf and root rot disease on citrus Key words: Actinomycete, biochemical characteristics, identification, morphological characteristics ĐẶT VẤN ĐỀ Nhằm ph t tri n nông nghi p theo hướng b n vững v khắc phục c i m c a thuốc h a học, nhi u bi n ph p quản lý dịch h i bi n ph p sinh học c s dụng k ch th ch t nh kh ng b nh, s dụng vi sinh v t ối kh ng Hi n nay, vai tr c a x khuẩn vi c ph ng trị b nh tr ng ng y c ng c quan tâm nghiên cứu v ứng dụng nhi u ặc i m tốt ối kh ng với m m b nh thông qua nhi u chế khả tiết enzyme ngo i b o, tiết kh ng sinh, c nh tranh dinh dưỡng,… v k ch th ch sinh trưởng cho tr ng 38 tăng sức kh ng với m m b nh v g p ph n gia tăng suất (Watve et al., 2001) Theo nghiên cứu c a Lê Minh Tường v cs (2018) phân l p c ba ch ng x khuẩn l LM6, LM v LV c khả ối kh ng với nấm F solani gây b nh v ng l thối rễ c m i Bên c nh , ch ng x khuẩn n y c ng c khả tiết enzyme chitinase v β-glucanase cao, m t ặc t nh quan trọng chế ấu tranh sinh học ph ng tr nấm b nh c a x khuẩn g p ph n tăng hi u ối kh ng c a x khuẩn ối với b nh Tuy nhiên chưa c ịnh danh ến lo i c a ba ch ng x khuẩn n y Do , mục tiêu Kết nghiên cứu khoa học c a nghiên cứu n y ịnh danh ến lo i x khuẩn d a v o ặc i m hình th i, ặc t nh h a sinh v trình t gene vùng 6S-rRNA VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Ba mẫu x khuẩn LM6, LM v LV dùng nghiên cứu c cung cấp B môn Bảo v th c v t, Trường Đ i học C n Thơ Ba mẫu x khuẩn n y c thu th p v phân l p t vườn tr ng c m i t i huy n Long Mỹ, t nh H u Giang LM6 v LM v huy n Lai Vung, t nh Đ ng Th p LV 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Quan sát màu sắc hệ sợi khí sinh, hệ sợi chất sắc tố tan Th nghi m c tiến h nh theo phương ph p c a Shirling and Gottlieb (1966) C c ch ng x khuẩn c nuôi cấy môi trường ISP International Streptomyces Project i u ki n nhi t ph ng Ch tiêu ghi nh n l quan s t m u sắc h s i chất, h s i kh sinh v sắc tố tan tiết ngo i môi trường nuôi cấy thời i m , v ng y sau th nghi m Ghi nh n c c m u v ng nâu, v ng nâu nh ỏ da cam, v ng nâu nh xanh da trời t m, v ng nâu lẫn xanh l Shirling v Gottlieb, 66 Quan sát cuống sinh bào tử hình dạng bề mặt bào tử Th nghi m c tiến h nh theo phương ph p c a Tresner et al C c ch ng x khuẩn c nuôi cấy môi trường MS ng y nhân m t số Chuỗi b o t c quan s t k nh hi n vi quang học x c ịnh d ng chuỗi b o t c a x khuẩn sau d ng thẳng, d ng hình m c câu v d ng xoắn ốc Hình d ng b o t c quan s t k nh hi n vi i n t x c ịnh c c d ng b o t sau b o t d ng trơn, b o t d ng gai, b o t d ng khối u, b o t d ng c lơng… 2.2.2 Đặc tính sinh hóa Khả tiết enzym protease chủng xạ khuẩn Th nghi m c th c hi n theo phương ph p c a Mitra and Chakrabartty C c ch ng x khuẩn c nhân nuôi môi trường MS ng y nhân m t số X khuẩn c cấy th nh i m, i m l m t khoanh giấy thấm c ường k nh mm c tẩm huy n phù x khuẩn ĩa petri c chứa môi trường Skim milk agar Sau , tiến h nh o b n k nh v ng BVTV - Sè 4/2018 phân giải protein thời i m , , v ng y sau th nghi m Khả tiết enzym lipase chủng xạ khuẩn Th nghi m c th c hi n theo phương ph p c a Ertuğrul et al., (2007) C c ch ng x khuẩn c nhân nuôi môi trường MS ng y nhân m t số X khuẩn c cấy th nh i m, i m l m t khoanh giấy thấm c ường k nh mm c tẩm huy n phù x khuẩn ĩa petri c chứa môi trường Tween agar Sau , tiến h nh o b n k nh v ng phân giải lipid thời i m 3, v ng y sau th nghi m Khả tiết enzym amylase chủng xạ khuẩn Th nghi m c th c hi n theo phương ph p c a Santos X khuẩn c nhân nuôi môi trường MS ng y nhân m t số X khuẩn c cấy th nh i m, i m l m t khoanh giấy thấm c ường k nh mm c tẩm huy n phù x khuẩn ĩa petri c chứa môi trường tinh b t Sau , tiến h nh o b n k nh v ng phân giải tinh b t thời i m , , 6, ng y sau th nghi m Sự hình thành sắc tố melanin chủng xạ khuẩn có triển vọng Th nghi m c th c hi n theo phương ph p c a Shirling and Gottlieb (1966 X khuẩn c nuôi cấy môi trường ISP6 nhi t ph ng Sau , quan s t m u c a môi trường thời i m , ng y sau th nghi m Nếu sinh sắc tố melanin, m u c a môi trường nuôi cấy chuy n t m u v ng sang m u nâu cho ến m u en 2.2.3 Định danh đến loài chủng xạ khuẩn phương pháp sinh học phân t T ch chiết DNA c a ch ng x khuẩn c th c hi n theo phương ph p c a Weisburg et al., (1991) Cặp m i c s dụng khuyếch i o n gen 16S-rRNA c a c c ch ng x khuẩn nghiên cứu l R ’-TACGGTTACCTTGTTACGACT3’ v ’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ (Weisburg et al., 1991) Th nh ph n phản ứng PCR hỗn h p phản ứng PCR c th t ch µl với th nh ph n h a chất g m 3,3 µl nước; , µl buffer; MgCl2 µl; dNTPS µl; DMNSO , µl; , µl Taq polymerase; , µl m i F; , µl m i Rv µl DNA c a x khuẩn Phản ứng PCR với chu kì o nhi t bắt u giai o n biến t nh DNA C ph t, l chu kỳ lặp l i c a giai o o n biến t nh C ph t, giai o n bắt cặp o o C giây v giai o n kéo d i C giây Tiếp theo l giai o n kéo d i o ph t C chắn c c s i DNA 39 Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 c b sung ho n to n dTNPS Sau sản o phẩm PCR c ưa v o bảo quản C Sản phẩm PCR c i n di agarose gel , % Tinh s ch sản phẩm PCR b QIA quick PCR Purification Kit c a QIAGEN Mẫu phân t ch c giải trình t t i ph ng th nghi m B nh cây, Khoa Nông nghi p, trường Đ i học Nông nghi p v Cơng ngh Tokyo, Nh t Bản (Giải trình t h thống m y ABI 3 XL Phân t ch kết ph n m m sequecing analysis v so s nh với kết ngân h ng gen x c ịnh tên c a x khuẩn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Định danh xạ khuẩn dựa vào đặc điểm hình thái đặc điểm sinh hóa Kết v ặc i m ni cấy, ặc i m hình th i v ặc i m sinh lý c a ch ng x khuẩn th nghi m c trình b y bảng 1, hình v hình Ch ng x khuẩn LM6 c chuỗi b o t d ng thẳng R , cuống sinh b o t d ng thẳng RF v b mặt b o t c d ng trơn Ch ng LM6 c hình th nh sắc tố tan c c môi trường nuôi cấy v c khả sinh melanin Bên c nh d av o c c ặc i m chung c a x khuẩn c nghiên cứu trước ây x c ịnh c c ặc i m nh n d ng x khuẩn v x c ịnh c ch ng x khuẩn LM6 thu c Gram dương v c khả tiết c c enzyme ngo i b o protease, amylase v lipase Bảng 2) Bảng Đặc điểm hình thái đặc điểm sinh lý - sinh hóa ba chủng xạ khuẩn thí nghiệm Đặc i m Chu i b o t Cuống sinh b o t B mặt b o t M u sắc Sắc tố tan Sắc tố melanin Tiết enzym Gram Ch ng x khuẩn th nghi m LM6 LM25 LV74 Thẳng R Thẳng R G n s ng F Thẳng RF Thẳng RF Mốc câu RA Trơn Trơn Trơn Đỏ V ng nh t Trắng C Không Không C C Không Proteas, lipase, amylase Proteas, lipase, amylase Proteas, lipase, amylase dương dương dương Ch ng LM c chuỗi b o t d ng thẳng R , cuống sinh b o t thu c d ng thẳng RF , b mặt b o t trơn Ch ng LM c hình th nh sắc tố tan c c môi trường nuôi cấy v c khả sinh melanin Bên c nh d a v o c c ặc i m chung c a x khuẩn c nghiên cứu trước ây x c ịnh c c ặc i m nh n d ng x khuẩn v x c ịnh c ch ng x khuẩn LM25 thu c Gram dương v c khả tiết c c enzyme ngo i b o protease, amylase v lipase Ch ng x khuẩn LV c chuỗi b o t d ng g n s ng (F), cuống sinh b o t d ng mốc câu RA v c b mặt b o t trơn Ch ng LV khơng hình th nh sắc tố tan c c môi trường nuôi cấy v không c khả sinh melanin Bên c nh d av o c c ặc i m chung c a x khuẩn c nghiên cứu trước ây x c ịnh c c ặc i m nh n d ng x khuẩn v x c ịnh c ch ng x khuẩn LM25 thu c Gram dương v c khả tiết c c enzyme ngo i b o protease, amylase v lipase Bảng 2) B A Chuỗi bào tử C Chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử Hình Hình dạng chuỗi bào tử dạng thẳng A ; chuỗi b o t d ng g n s ng B ; cuống sinh b o t d ng mốc câu B v b mặt b o t trơn C 40 Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 3.2 Định danh chủng xạ khuẩn phƣơng pháp sinh học phân tử Ba ch ng x khuẩn c ly tr ch DNA v th c hi n phản ứng PCR với cặp m i chung Fv 1492R (Weisburg et al., 1991) Hình Khả tạo sắc tố melanin (A) v không t o sắc tố melanin B môi trường nuôi cấy ISP6 c a x khuẩn NSKC Bảng Khả tiết enzyme amylase, lipase protease chủng xạ khuẩn Nghi m thức LV74 LM6 LM25 Mức ý nghĩa CV (%) B n k nh v ng phân giải chất mm c a ch ng x khuẩn ng y sau th nghi m amylase protease lipase 8,4a 15,6a 15,4a 3,2 c 14,4 b 15,4a 6,6 b 10,4 c 6,6 b * * * 20,85 4,07 21,42 Ghi chú: Các trung bình cột theo sau hay chữ giống khác biệt khơng có ý ngh a thống kê phép th Duncan (*) khác biệt mức ý ngh a Sau tiến h nh so s nh c c ặc i m nuôi cấy, ặc i m hình th i, sinh lý với kh a phân lo i x khuẩn c a International Streptomyce Project Shirling v Gottlieb, ; Pridham et al., ; Waksman, ta c th xếp ch ng x khuẩn LM6, LM v LV v o chi Streptomyces Trong , ch ng LM6 c th l lo i Streptomyces capoamus, ch ng LM c th l lo i Streptomyces bacillaris v ch ng LV c th l lo i Streptomyces lavendulae Đ c th x c ịnh ch nh x c ến tên lo i c a c c ch ng x khuẩn c n phải kết h p c c ặc i m phân lo i theo phương ph p truy n thống với vi c x c ịnh phương ph p sinh học phân t Hình Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại với cặp mồi thuộc vùng 16S-rRNA chủng xạ khuẩn nghiên cứu Sản phẩm PCR thu c c k ch thước khoảng bp Hình , phù h p với trọng lư ng phân t c c ch ng x khuẩn thu c lo i Streptomyces D a v o kết bảng cho thấy c c ch ng x khuẩn th nghi m c mức tương ng t 99 – % so s nh với lo i chuẩn d a v o trình t gen vùng 6S rRNA Cụ th l ch ng LM6 c mức tương ng với lo i Streptomyces capoamus l %; ch ng LM c mức tương ng với lo i Streptomyces bacillaris l %v ch ng LV c mức tương ng với lo i lo i Streptomyces lavendulae l % Theo kết nghiên cứu c a Lê Minh Tường v ctv , (2015) x c ịnh c ch ng x khuẩn c tên khoa học l Streptomyces bacillaris v Streptomyces capoamus l ch ng x khuẩn c khả ph ng trị b nh ch y bìa l l a ng sông C u Long Theo kết nghiên cứu c a Dương Thị Ngọc cho thấy ch ng x khuẩn c khả ph ng trị b nh o ôn h i l a ng sông C u Long c tên khoa học l Streptomyces lavendulae 41 Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 Bảng Kết xác định ba mẫu xạ khuẩn dựa trình tự vùng 16S-rDNA Mẫu x khuẩn k ch thước trình t (bp) Lo i x c ịnh Mức M số c a ch ng tương ng GenBank tương ng % LM6 Streptomyces capoamus 1484 99 NR_040856.1 LM25 Streptomyces bacillaris 1468 100 NR_041146.1 LV74 Streptomyces lavendulae 1515 99 DQ645958.1 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ R G (1970) A guide for the classification of - Ba ch ng x khuẩn nghiên cứu thu c lo i Streptomyces capoamus, lo i Streptomyces bacillaris, v lo i Streptomyces lavendulae - Đ nghị nh gi khả ph ng trị b nh v ng l thối rễ c m i c a ch ng x khuẩn i u ki n ngo i ng x khuẩn c tri n vọng quản lý m t số b nh h i l a Lu n văn tốt nghi p th c sĩ ng nh Bảo v Th c v t Trường Đại học Cần hơ Erturul, S , G Dửnmez and S Takaỗ Isolation of lipase producing Bacillus sp from olive mill wastewater and improving its enzyme activity Journal of Hazardous Materials, 149(3): 720-724 Lê Minh Tường, Lý Văn Giang, Ph m Tuấn khuẩn c tri n vọng ph ng trị b nh ch y bìa l h i l a T p ch Khoa học Trường Đ i học C n Thơ Tr 46-52 Lê Minh Tường, Nguyễn Ngọc Sơn, Lê Thị Ngọc Xuân v Nguyễn Trường Sơn ối kh ng c a c c ch ng x khuẩn Khả ối với nấm Fusarium solani gây b nh v ng l thối rễ c m i T p ch Bảo v th c v t, tr 6-32 Mitra, P., and P Chakrabartty (2005) An extracellular protease with depilation activity from Streptomyces nogalator Journal of Scientific and Industrial Research, 64(12): 978 Pridham, T G., Hesseltin, C W., and Benedict, 42 to selected groups Placement of strains in morphological sections App Microbiol 6: 52 Santos, É R D , Z N S Teles, N M Campos, D.A.J.D Souza, A.S.D.R Nascimento, Bispo and R.P.D Production of α-amylase from Streptomyces sp SLBA-08 strain using agro-industrial Archives of Biology and Technology, 55(5): 793-800 Dương Thị Ngọc, 2014 Định danh c c ch ng 2015 Định danh x according by-products Brazilian TÀI LIỆU THAM KHẢO V streptomycetes Shirling, E.T and D Gottlieb (1966) Methods for characterization of Streptomyces species International journal of systematic bacteriology, 16(3): 313-340 Shirling, Cooperative E.T and description Gottlieb, of type D., 1972 strains of Streptomyces V Additional descriptions International Journal of Systematic Bacteriology, 22(4): 265-394 10 Waksman, S.A, 1961 The Actinomycetes: Classification, identification and descriptions of genera and species The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 2, USA 11 Watve, M.G., R Tickoo, M.M Jog and B.D Bhole, 2001 How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces? Archives of microbiology, 176(5): 386-390 12 Weisburg, W.G., S.M Barns, D.A Pelletier, and D.J amplification Lane, for 1991 16S phylogenetic ribosomal DNA study Journal of bacteriology,173(2),697-703 Phản biện: TS Nguyễn Đức Huy ... Sơn, Lê Thị Ngọc Xuân v Nguyễn Trường Sơn ối kh ng c a c c ch ng x khuẩn Khả ối với nấm Fusarium solani gây b nh v ng l thối rễ c m i T p ch Bảo v th c v t, tr 6-32 Mitra, P., and P Chakrabartty... cấy ISP6 c a x khuẩn NSKC Bảng Khả tiết enzyme amylase, lipase protease chủng xạ khuẩn Nghi m thức LV74 LM6 LM25 Mức ý nghĩa CV (%) B n k nh v ng phân giải chất mm c a ch ng x khuẩn ng y sau... ịnh tên c a x khuẩn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Định danh xạ khuẩn dựa vào đặc điểm hình thái đặc điểm sinh hóa Kết v ặc i m ni cấy, ặc i m hình th i v ặc i m sinh lý c a ch ng x khuẩn th nghi m