Bài báo này là một số kết quả nghiên cứu về nấm F. fujikuroi gây bệnh vàng lá thối r hại cây ba kích (Morinda officinalis How.) tại Quảng Ninh.
Trang 18 Pissawan Chiemsombat et al., 2014
Occurrence of Telosma mosaic virus causing
passion fruit severe mosaic disease in Thailand and
immunostrip test for rapid virus detection Crop
Protection 63 (2014)
9 Revill, P A., Ha, C V., Lines, R E., Bell, K E.,
Vu, M T., & Dale, J L., 2004 PCR and ELISA-based virus surveys of banana, papaya and cucurbit crops in
Viet Nam Asia Pacific Journal of Molecular Biology & Biotechnology, 12(1 & 2), 27-32.
Phản biện: TS Trịnh Xuân Hoạt
KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM Fusarium fujikuroi
Nirenberg GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ CÂY BA KÍCH
(Morinda officinalis How.) TẠI QUẢNG NINH Identification and Biological Characteristics of Fusarium fujikuroi
Causal Agent of Root Rot Disease of Medicinal Indian Mulberry (Morinda
officinalis How.) in Quang Ninh Province
Ngô Quang Huy 1 , Mai Văn Quân 1 , Lê Quang Mẫn 1 , Lê Xuân Vị 1 , Lê Đức Trung 1
, Dương Thị Nguyên 2 và Trịnh Xuân Hoạt 1
Ngày nhận bài: 05.08.2018 Ngày chấp nhận: 28.09.2018
Abstract
Root rot is the most serious threatening disease affecting Indian mulberry (Morinda officinalis How.) (locally
called as “Ba kich”) in Ba Che district, Quang Ninh province The objective of this study was to identify the
pathogenicity of Fusarium spp isolated from infected-“Ba kich” plants growing in Ba Che A total of 12 isolates
were recovered from “Ba kich” in Ba Che district, Quang Ninh province According to the morphological
characteristics, pathogenicity assays, F fujikuroi was proved to be the causal agent of root rot disease and was
further confirmed by PCR with universal primer pair ITS4/ITS5 and phylogenetic analysis Results on the
biological characteristics of F fujikuroi on different media and temperatures showed differences on mycelium
growth and sporulation The optimal condition were 25oC, pH 5.5, PDA and BD media
Key words: F fujikuroi, root rot, Medicinal Indian Mulberry, Morinda officinalis How
1 ĐẶT VẤN ĐỀ *
Nấm F fujikuroi là một trong những loại nấm
phát triển và gây hại chủ yếu ở các vùng nhiệt
đới, á nhiệt đới và những vùng có nhiệt, ẩm độ
cao Trừ những vùng quá lạnh ra nấm cũng phát
triển ở các vùng ôn đới (Booth, 1971) Trên thế
giới, Nấm gây hại ở rất nhiều loại cây trồng trong
đó chủ yếu là cây trồng thuộc họ hòa thảo Tại
Việt Nam, nấm F fujikuroi đã phát sinh và gây
hại nghiêm trọng tại các vùng trồng cây lương
thực, cây công nghiệp và cây dược liệu Bệnh
1 Viện Bảo vệ thực vật
2 Trường Đại Học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên
gây hại trên các bộ phận của cây như r , gốc, thân và hạt; làm cho các bộ phận này bị thối đen
và biểu hiện triệu chứng vàng lá, cây thấp lùn, phát triển kém, đẻ nhánh kém, bị khô và d bị
rụng Nấm F fujikuroi là một đối tượng gây hại
quan trọng trên các cây trồng, nấm gây thối các
bộ phận của cây làm giảm năng suất, chất lượng (Nguy n Thị Hồng Hạnh, 2012) Tại Trung Quốc, bệnh héo “Ba kích” cũng là một bệnh nguy hiểm gây triệu chứng héo trên cây “Ba kích” và đã
được xác định là do nấm F oxysporum Schlect
gây ra (Shi and Chi 1988; Luo and Chen 1989) Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu về phổ ký chủ, đặc điểm sinh học, quy luật phát sinh
Trang 2gây hại và biện pháp phòng trừ bệnh vàng lá thối
r do nấm F fujikuroi gây ra đã được Viện Bảo
vệ thực vật tiến hành Bài báo này là một số kết
quả nghiên cứu về nấm F fujikuroi gây bệnh
vàng lá thối r hại cây ba kích (Morinda officinalis
How.) tại Quảng Ninh
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu cây Ba kích tím có triệu chứng bệnh
vàng lá thối r được thu thập tại các vùng trồng
ba kích tại huyện Ba Chẽ và Hoành Bồ, tỉnh
Quảng Ninh
- Môi trường phân lập gồm: Môi trường YMA,
Bột Đậu (BĐ), PDA, Cà rốt (CR) và Czapek Dox
Các loại hóa chất phục vụ chiết suất DNA, chạy
PCR và giải trình tự gen
2.2 Phương pháp nghiên cứu
- Điều tra, thu thập và phân lập bệnh vàng lá
thối r trên cây Ba kích tím theo phương pháp
điều tra phát hiện bệnh cây của Viện Bảo vệ thực
vật (1997)
- Định danh nấm gây bệnh: Nấm gây bệnh
vàng lá thối r sau khi được làm thuần bằng đỉnh
sợi nấm Cấy nấm thuần trên môi trường PDA
trong 7 ngày Lấy sợi nấm chiết xuất DNA tổng
số bằng phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl
Ammonium Bromide) theo mô tả của Doyle &
Doyle (1990) Phản ứng PCR được tiến hành với
cặp primer ITS4 (5’-CCT CCG CTT ATT GAT
ATG C-3’) và ITS5 (5’-GAA AGT AAA AGT CGT
AAC AAG G-3’) (White và cs., 1990) khuếch đại
vùng ITS của nấm
Sản phẩm PCR được tinh sạch từ agarose
gel sử dụng QIAquick PCR Purifcation Kit
(Qiagen, Đức) và được giải trình tự gen trực tiếp
cả hai chiều bằng máy ABI3100 tại Hàn Quốc sử
dụng BigDye Terminator 3.1 Kit (Applied
Biotech) Trình tự các mẫu được so sánh với
Ngân hàng Gen bằng phần mềm trực tuyến
(Altschul et al 1990) Cây phả hệ
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi xây dựng
theo phương pháp Neighbor-joining với khoảng
cách di truyền giữa các chuỗi được xác định dựa
trên mô hình thay thế Kimura hai tham số, giá trị
thống kê bootstrap (%) với 1000 lần lặp lại trong phần mềm MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016)
- Lây bệnh nhân tạo bệnh vàng lá thối r theo chu trình Koch Chọn cây ba kích 1 năm tuổi từ vườn ươm sinh trưởng tốt, không bị bệnh Hòa dung dịch bào tử ở nồng độ 5 × 106 bào tử/ml tưới xung quanh gốc cây lây bệnh Cây đối chứng không lây nhi m Theo dõi biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây thí nghiệm
- Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm F
fujikuroi trên các môi trường YMA, Bột Đậu (BĐ), PDA, Cà rốt (CR) và Czapek Dox ở các mức nhiệt độ 25, 30 và 35o
C Các nguồn nấm F fujikuroi trong nghiên cứu được làm thuần bằng đỉnh sinh trưởng của nấm Theo dõi hình thái và màu sắc tản nấm, thời gian hình thành bào tử trên môi trường
2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Chẩn đoán, Giám định dịch hại và thiên địch, Viện Bảo vệ thực vật
năm 2017
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Triệu chứng bệnh vàng lá thối rễ hại cây Ba kích tím
Triệu chứng điển hình ban đầu của cây bị bệnh lá ở phần gốc bị vàng, sau đó lan dần lên các lá phía trên, toàn bộ lá bị khô và rụng xuống, thân cây có màu đen và cây bị chết khô Cây bị bệnh củ kém phát triển, r và thịt củ có màu nâu đen (hình 1A và 1B)
Bào tử phân sinh có hai dạng: bào tử nhỏ và bào tử lớn Bào tử nhỏ đơn bào thuôn dài hình elip, không màu, kích thước bào tử nhỏ 4,72×1,31µm Bào tử lớn dài, hơi cong hình lưỡi liềm, đa bào kích thước bào tử lớn 10,56×1,58
µm hình 1C)
Phân lập, làm thuần nấm và lây nhi m nhân tạo trên cây ba kích 1 năm tuổi, sau 45 ngày triệu chứng bệnh vàng lá bắt đầu xuất hiện và sau 60 ngày cây ba kích nhi m bệnh đã bị chết hoàn toàn tương tự như triệu chứng đã quan sát thấy trong tự nhiên (hình 1D)
Trang 3Hình 1 Triệu bệnh vàng lá thối rễ hại cây Ba kích tím tại huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh 2017
(A) Triệu chứng bệnh trên cây, (B) Triệu chứng bệnh trên củ và r cây, (C) Cành bào tử và bảo tử
nấm F fujikuroi trên môi trường PDA, (D) cây biểu hiện bệnh sau lây nhi m 45 ngày
3.2 Giám định nấm F fujikuroi gây bệnh
vàng lá thối rễ hại cây Ba kích tím bằng kỹ
thuật PCR và phân tích cây phả hệ
Nấm gây bệnh vàng lá thối r được phân lập,
làm thuần Bào tử nấm được chiết suất DNA tổng
số làm mạch khuôn cho phản ứng PCR sử dụng
cặp mồi chung ITS4/ITS5 để khuếch đại vùng ITS
Sản phẩm PCR tất cả các mẫu nấm có kích thước
khoảng 570 bp Giải trình tự hai chiều toàn bộ số
mẫu thu được kết quả đồng nhất Trình tự gen
chủng nấm BKQN.2017 được chọn làm đại diện để
BLAST so sánh trên Ngân hàng gen NCBI
Kết quả phân tích trình tự gen và xây dựng cây phả hệ đã ghi nhận chủng nấm được phân lập từ các bộ phận của cây Ba kích tím có triệu chứng bệnh vàng lá thối r tại Quảng Ninh (kí
hiệu BKQN.2017) đã cùng với một đại diện của loài nấm Fusarium fujikuroi có mã số Ngân hàng
Gen KT192406.1 tạo thành một nhánh riêng biệt
so với các loài Fusarium khác trên cây phả hệ
Tổng hợp kết quả quan sát hình thái và phân tích trình tự gen cho thấy chủng nấm gây bệnh vàng
lá thối r cây Ba kích tím tại huyện Ba Chẽ tỉnh
Quảng Ninh là Fusarium fujikuroi (hình 2)
Hình 2 Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining (Viện Bảo vệ thực vật, 2017) Trình tự gen của nấm gây bệnh vàng lá thối rễ Ba kích tím
được ký hiệu BKQN.2017 Các mã số Ngân hàng gen được ghi trong ngoặc đơn
Fusarium proliferatum (KJ767073.1) Fusarium oxysporum f sp (KF534747.1).
Fusarium oxysporum f sp (KU097320.1)
Fusarium equisetai (KY365254.1) Fusarium globosum (LT746278.1)
Fusarium proliferatum (HQ332533.1) Gibberella moniliformis (EU364843.1) Fusarium sp (KX611638.1).
Fusarium verticillioides ((KM434131.1) Fusarium fujikuroi (KT192406.1)
BKQN.2017
0.001
Trang 43.3 Sự phát triển của nấm F fujikuroi trên
các loại môi trường và nhiệt độ khác nhau
3.3.1 Sự phát triển của nấm F fujikuroi trên
các môi trường dinh dưỡng ở nhiệt độ 25 o
C
Ở điều kiện nhiệt độ 25oC, nấm F fujikuroi
sinh trưởng và phát triển khác nhau trên các loại
môi trường dinh dưỡng khác nhau Sau 7 ngày
nuôi cấy nấm phát triển tốt nhất trên các môi
trường PDA, Cà rốt, Czapek Dox và YMA, kích
thước tản nấm trung bình đạt 8,5±0,00 cm Nấm
sinh trưởng và phát triển kém trên môi trường
bột đậu, sau 7 ngày kích thước tản nấm chỉ đạt
6,28±0,42 cm Tuy nhiên, nấm lại có thời gian
hình thành bào tử sớm nhất trên môi trường Bột
đậu, PDA sau 1 ngày nuôi cấy Trên môi trường
Czapek Dox, YMA, Cà rốt nấm hình thành bào tử
sau 3-4 ngày nuôi cấy Đồng thời màu sắc của tản nấm cúng thay đổi tùy thuốc vào môi trường nuôi cấy, trên môi trường PDA, Bột đậu, Czapek Dox tản nấm có màu trắng, trên môi trường Cà rốt, YMA tản nấm có màu trắng hồng
Trên môi trường khác nhau kích thước bào tử cũng khác nhau Kích thước bào tử lớn thay đổi
từ 8,96×1,50-12,18×1,70 µm Sau 7 ngày nuôi cấy kích thước bào tử lớn lớn nhất trên môi trường YMA (12,18×1,70 µm), kích thước bào tử lớn nhỏ nhất trên môi trường Bột đậu (8,96×1,50 µm) Kích thước bào tử nhỏ không có sự khác biệt lớn trên các loại môi trường dinh dưỡng, kích thước bào tủ nhỏ đạt trung bình từ 4,04×1,41-4,92×1,33 µm sau 7 ngày nuôi cấy (bảng 1)
Bảng 1 Sự phát triển của nấm F fujikuroi trên các loại môi trường
khác nhau ở nhiệt độ 25 o C (Viện Bảo vệ thực vật, 2017)
Môi trường 7 ngày (cm) KTTN sau màu sắc tản nấm TGHT bào tử (ngày) Kích thước bào tử (µm)
Bào tử lớn Bào tử nhỏ
Ghi chú: KTTN = kích thước tản nấm, TGHT = Thời gian hình thành
3.3.2 Sự phát triển của nấm F fujikuroi trên
các môi trường dinh dưỡng ở nhiệt độ 30 o
C
Ở nhiệt độ 30oC, nấm phát triển kém hơn trên
các môi trường, kích thước tản nấm sau 7 ngày
đạt từ 2,42-5,82 cm Nấm nuôi cấy trên môi
trường Bột dậu sau 1 ngày hình thành bào tử,
nấm nuôi cấy trên các môi trường PDA, Czapek
Dox, YMA hình thành bao tử sau 3 ngày nuôi
cấy, nguồn nấm nuôi cấy trên môi trường Cà rốt
hình thành bào tử chậm nhất sau 4 ngày
Ở điều kiện 30oC, màu sắc tản nấm trên Cà rốt, YMA thay đổi so với ở điều kiện 25oC từ màu trắng hồng sang màu trắng xám Trên môi trường PDA, Bột đậu, Czapek Dox nấm giữ màu trắng Bào tử lớn của nấm nuôi cây trên môi trường Bọt đậu có kích thước lớn nhất là 12,1×1,65 µm nhưng lại có kích thước bào tử nhỏ nhỏ nhất (3,78×1,14 µm) Kích thước bào tử lớn của nấm trên các môi trường nuôi cấy có kích thước trùng bình từ 9,99×1,33-10,73×1,57
Bảng 2 Sự phát triển của nấm F fujikuroi trên các loại môi trường khác nhau ở 30o
C
(Viện Bảo vệ thực vật, 2017)
Môi trường KTTN sau
7 ngày (cm)
màu sắc tản nấm
TGHT bào tử (ngày)
Kích thước bào tử (µm) Bào tử lớn Bào tử nhỏ
Cà rốt 3,32±0,35 Trắng xám 4 10,73×1,57 4,16×1,25
Czapek Dox 5,82±0,09 Trắng 3 9,99×1,33 4,04×1,29 YMA 5,12±0,03 Trắng xám 3 10,65×1,57 4,76×1,50
Ghi chú: KTTN = kích thước tản nấm, TGHT = Thời gian hình thành
Trang 53.3.3 Sự phát triển của nấm F fujikuroi trên
các môi trường dinh dưỡng ở nhiệt độ 35 o
C
Ở nhiệt độ 30oC, nấm phát triển kém trên các
môi trường, kích tước thản nấm chỉ đạt từ 1,1-
1,5 cm Màu sắc của tản nấm có màu trắng trên
môi trường PDA, Bột đậu, Czapek Dox và YMA,
trên môi trường Cà rốt tản nấm có màu trắng vàng Thời gian hình thành bào tử rút ngắn xuống chỉ còn 1 ngày trên môi trường Cà rốt, Bột đậu, Czapek Dox Trên môi trường PDA và YMA kéo dài thời gian hình thành bào tử so với cùng điều kiện môi trường là 5 ngày (bảng 3, hình 3)
Bảng 3 Sự phát triển của nấm F fujikuroi trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau ở 35o
C
(Viện Bảo vệ thực vật, 2017)
Môi trường KTTN sau
7 ngày (cm)
màu sắc tản nấm
TGHT bào tử (ngày)
Kích thước bào tử (µm) Bào tử lớn Bào tử nhỏ
Cà rốt 1,30±0,02 Trắng vàng 1 7,18×1,82 3,71×1,38
Czapek Dox 1,10±0,09 Trắng 1 12,34×2,06 4,52×1,38
Ghi chú: KTTN = kích thước tản nấm, TGHT = Thời gian hình thành
Kích thước bào tử lớn và bào tử nhỏ cúng có
sự chênh lệch đáng kể, kich thước bào tử lớn từ
7,18×1,82- 18,32×3,79 µm, kích thước bào tử
nhỏ từ 3,71×1,38-5,32×2,26 Kích thước của bào
lớn và bào tử nhỏ đạt lớn nhất trên môi trường Bột đậu với kích thước lần lượt là 18,32×3,79 µm
và 5,32×2,26 µm
Hình 3 Sự phát triển của nấm F fujikuroi trên các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau ở các
điều kiện nhiệt độ khác nhau: (1) Ở nhiệt độ 25 o C, (2) ở nhiệt độ 30 o C và (3) ở nhiệt độ 35 o
C
4 KẾT LUẬN
- Nấm Fusarium fujikuroi là tác nhân gây bệnh
vàng lá thối r trên cây Ba kích tím tại Quảng Ninh
- Ở điều kiện nhiệt độ 25oC nấm F fujikuroi
phát triển tốt nhất trên các loại môi trường, nấm
phát triển mạnh nhất trên môi trường PDA Thời
gian hình thành bào tử trên môi trường PDA và
bột đậu là sớm nhất sau 1 ngày nuôi cấy
- Ở điều kiện từ 30oC trở lên nấm có tốc độ phát
triển kém hơn trên cấc môi trường, nhưng lại có
thời gia hình thành bào tử sớm nhất sau 1 ngày
nuôi cấy trên môi trường Cà rốt, Bột đậu, Czapek
Dox Ở nhiệt độ 35oC, bào tử lớn và bào tử nhỏ có
kích thước lớn nhất trên môi trường Bột đậu
Lời cảm ơn
Công trình này là một phần kết quả của đề tài
cấp tỉnh Quảng Ninh Nghiên cứu các giải pháp khoa học và công nghệ quản lý tổng hợp sâu, bệnh hại chính trên cây Ba kích tím và Giảo cổ lam tại tỉnh Quảng Ninh do TS Trịnh Xuân Hoạt
(Viện Bảo vệ thực vật) làm chủ trì
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguy n Thị Hồng Hạnh, 2012 “Nghiên cứu nấm
Fusarium fujikuroi trên hạt lúa” Luận văn thạc sĩ Nông
nghiệp Học Viện Nông nghiệp Việt Nam
2 Viện Bảo vệ thực vât, 1997 Phương pháp
Trang 6nghiên cứu bảo vệ thực vật tập 1 Nxb Nông nghiệp
Hà Nội tr 46-57
3 Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W.,
Lipman D.J., 1990 Basic local alignment search tool J
Mol Biol 215:403-410
4 Booth C., 1971 The Genus Fusarium
Commonwealth Mycological Institute, Eastern Press
Limited, Kew Surrey
5 Doyle J.J and Doyle J.L.,1990 Isolation of
plant DNA from fresh tissue Focus 12:13-15
6 Kumar S., Stecher G., Tamura K., 2016
MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis
Version 7.0 for Bigger Datasets Mol Biol Evol
33(7):1870-1874
7 Luo S., Chen Z., 1989 Study on the Fusarium wilt disease of medicinal Indian mulberry Journal of
Fujian Agricultural College 18(4):526-531
8 Shi X and Chi P., 1988 Identification of the pathogen causing wilt disease of the medicinal herb
Indian mulberry (Morinda officinalis How.) Acta
Phytopathologica Sinica 18(3):137-142
9 White T.J., Burns T., Lee S and Taylor J.W.,
1990 Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA genes for phylogenetics In: Innis MA,
Gelfald DH, Sninsky JJ and White TJ (eds) PCR Protocol: A Guide to Methods and Applications (pp
315-322) Academic press, New York, USA
Phản biện: TS Hà Minh Thanh
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM Botrytis cinerea Pers
GÂY BỆNH THỐI XÁM TRÊN THƯỢC DƯƠC, CÀ CHUA VÀ LẠC
TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG
Study on Biological Characteristics of Botrytis cinerea Pers Causing Gray
Mold Disease on Dahlia, Tomato and Groundnut in Red River Delta
Mai Văn Quân 1
, Trịnh Xuân Hoạt 1
, Đặng Vũ Thị Thanh 2
, Lê Quang Mẫn 1
, Ngô Quang Huy 1
Ngày nhận bài: 08.08.2018 Ngày chấp nhận: 27.08.2018
Abstract
Botrytis cinerea is an important pathogen that causes gray mold disease in different crop in Viet Nam In
present study, a total of 15 isolates were isolated from tomato (Solanum lycopersicum L.), dahlia (Dahia
pinnata Cav.), groundnut (Arachis hypogae L.) in the Red River delta The morphological characteristics
were based on characters such as conidiophore and conidial length; and the results indicated that all
isolates belonged to Botrytis cinerea PCR with universal primer pair ITS4/ITS5 amplified DNA fragments of
about 700 bp from all isolates The DNA sequencing and phylogenetic analysis based on ITS confirmed that
B cinerea is the causal agent of gray mold disease on crop The effect of various culture conditions on
mycelium growth, sporulation, sclerotia formation of B cinerea was performed CR is an oftimal medium for
production of mycelium, spores and sclerotia The growth of mycelium cultured on CR as the fastest with the
production of mycelium, fungal spores and sclerotia The optimal conditions for mycelium growth and
sporulation of B cinerea isolated from dahlia was 15-20oC on PDA medium The optimal conditions for
mycelium growth was the 12:12 (CL:D) cycles of 12 hours light and 12 hours darkness; and the continous
darkness was optimum condition for sporulation
Keywords: B cinerea, gray mould disease,
biological characteristic and molecular identification
1 Viện Bảo vệ thực vật,
2 Hội KHKT Bảo vệ thực vật Việt Nam