Kết quả giám định và một số đặc điểm của nấm Fusarium fujikuroi Nirenberg gây bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích (Morinda officinalis How.) tại Quảng Ninh

Bài báo này là một số kết quả nghiên cứu về nấm F. fujikuroi gây bệnh vàng lá thối r hại cây ba kích (Morinda officinalis How.) tại Quảng Ninh.

BVTV - Sè 5/2018 Kết nghiên cứu khoa học Pissawan Chiemsombat et al., 2014 Occurrence of Telosma mosaic virus causing passion fruit severe mosaic disease in Thailand and immunostrip test for rapid virus detection Crop Protection 63 (2014) Revill, P A., Ha, C V., Lines, R E., Bell, K E., Vu, M T., & Dale, J L., 2004 PCR and ELISA-based virus surveys of banana, papaya and cucurbit crops in Viet Nam Asia Pacific Journal of Molecular Biology & Biotechnology, 12(1 & 2), 27-32 Phản biện: TS Trịnh Xuân Hoạt KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM Fusarium fujikuroi Nirenberg GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ CÂY BA KÍCH (Morinda officinalis How.) TẠI QUẢNG NINH Identification and Biological Characteristics of Fusarium fujikuroi Causal Agent of Root Rot Disease of Medicinal Indian Mulberry (Morinda officinalis How.) in Quang Ninh Province 1 1 Ngô Quang Huy , Mai Văn Quân , Lê Quang Mẫn , Lê Xuân Vị , Lê Đức Trung , Dƣơng Thị Nguyên Trịnh Xuân Hoạt Ngày nhận bài: 05.08.2018 Ngày chấp nhận: 28.09.2018 Abstract Root rot is the most serious threatening disease affecting Indian mulberry (Morinda officinalis How.) (locally called as “Ba kich”) in Ba Che district, Quang Ninh province The objective of this study was to identify the pathogenicity of Fusarium spp isolated from infected-“Ba kich” plants growing in Ba Che A total of 12 isolates were recovered from “Ba kich” in Ba Che district, Quang Ninh province According to the morphological characteristics, pathogenicity assays, F fujikuroi was proved to be the causal agent of root rot disease and was further confirmed by PCR with universal primer pair ITS4/ITS5 and phylogenetic analysis Results on the biological characteristics of F fujikuroi on different media and temperatures showed differences on mycelium o growth and sporulation The optimal condition were 25 C, pH 5.5, PDA and BD media Key words: F fujikuroi, root rot, Medicinal Indian Mulberry, Morinda officinalis How ĐẶT VẤN ĐỀ * Nấm F fujikuroi loại nấm phát triển gây hại chủ yếu vùng nhiệt đới, nhiệt đới vùng có nhiệt, ẩm độ cao Trừ vùng lạnh nấm phát triển vùng ôn đới (Booth, 1971) Trên giới, Nấm gây hại nhiều loại trồng chủ yếu trồng thuộc họ hòa thảo Tại Việt Nam, nấm F fujikuroi phát sinh gây hại nghiêm trọng vùng trồng lương thực, công nghiệp dược liệu Bệnh Viện Bảo vệ thực vật Trường Đại Học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên 68 gây hại phận r , gốc, thân hạt; làm cho phận bị thối đen biểu triệu chứng vàng lá, thấp lùn, phát triển kém, đẻ nhánh kém, bị khô d bị rụng Nấm F fujikuroi đối tượng gây hại quan trọng trồng, nấm gây thối phận làm giảm suất, chất lượng (Nguy n Thị Hồng Hạnh, 2012) Tại Trung Quốc, bệnh héo “Ba kích” bệnh nguy hiểm gây triệu chứng héo “Ba kích” xác định nấm F oxysporum Schlect gây (Shi and Chi 1988; Luo and Chen 1989) Trong thời gian gần đây, nghiên cứu phổ ký chủ, đặc điểm sinh học, quy luật phát sinh Kết nghiên cứu khoa học gây hại biện pháp phòng trừ bệnh vàng thối r nấm F fujikuroi gây Viện Bảo vệ thực vật tiến hành Bài báo số kết nghiên cứu nấm F fujikuroi gây bệnh vàng thối r hại ba kích (Morinda officinalis How.) Quảng Ninh VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu Ba kích tím có triệu chứng bệnh vàng thối r thu thập vùng trồng ba kích huyện Ba Chẽ Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh - Môi trường phân lập gồm: Môi trường YMA, Bột Đậu (BĐ), PDA, Cà rốt (CR) Czapek Dox Các loại hóa chất phục vụ chiết suất DNA, chạy PCR giải trình tự gen 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu - Điều tra, thu thập phân lập bệnh vàng thối r Ba kích tím theo phương pháp điều tra phát bệnh Viện Bảo vệ thực vật (1997) - Định danh nấm gây bệnh: Nấm gây bệnh vàng thối r sau làm đỉnh sợi nấm Cấy nấm môi trường PDA ngày Lấy sợi nấm chiết xuất DNA tổng số phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) theo mô tả Doyle & Doyle (1990) Phản ứng PCR tiến hành với cặp primer ITS4 (5’-CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3’) ITS5 (5’-GAA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’) (White cs., 1990) khuếch đại vùng ITS nấm Sản phẩm PCR tinh từ agarose gel sử dụng QIAquick PCR Purifcation Kit (Qiagen, Đức) giải trình tự gen trực tiếp hai chiều máy ABI3100 Hàn Quốc sử dụng BigDye Terminator 3.1 Kit (Applied Biotech) Trình tự mẫu so sánh với Ngân hàng Gen phần mềm trực tuyến (Altschul et al 1990) Cây phả hệ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining với khoảng cách di truyền chuỗi xác định dựa mơ hình thay Kimura hai tham số, giá trị BVTV - Sè 5/2018 thống kê bootstrap (%) với 1000 lần lặp lại phần mềm MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016) - Lây bệnh nhân tạo bệnh vàng thối r theo chu trình Koch Chọn ba kích năm tuổi từ vườn ươm sinh trưởng tốt, khơng bị bệnh Hòa dung dịch bào tử nồng độ × 10 bào tử/ml tưới xung quanh gốc lây bệnh Cây đối chứng không lây nhi m Theo dõi biểu triệu chứng bệnh thí nghiệm - Nghiên cứu khả phát triển nấm F fujikuroi môi trường YMA, Bột Đậu (BĐ), PDA, Cà rốt (CR) Czapek Dox mức o nhiệt độ 25, 30 35 C Các nguồn nấm F fujikuroi nghiên cứu làm đỉnh sinh trưởng nấm Theo dõi hình thái màu sắc tản nấm, thời gian hình thành bào tử môi trường 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm tiến hành phòng thí nghiệm Bộ mơn Chẩn đốn, Giám định dịch hại thiên địch, Viện Bảo vệ thực vật năm 2017 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Triệu chứng bệnh vàng thối rễ hại Ba kích tím Triệu chứng điển hình ban đầu bị bệnh phần gốc bị vàng, sau lan dần lên phía trên, tồn bị khơ rụng xuống, thân có màu đen bị chết khô Cây bị bệnh củ phát triển, r thịt củ có màu nâu đen (hình 1A 1B) Bào tử phân sinh có hai dạng: bào tử nhỏ bào tử lớn Bào tử nhỏ đơn bào thn dài hình elip, khơng màu, kích thước bào tử nh 4,72ì1,31àm Bo t ln di, hi cong hỡnh li lim, a bo kớch thc bo t ln 10,56ì1,58 àm hình 1C) Phân lập, làm nấm lây nhi m nhân tạo ba kích năm tuổi, sau 45 ngày triệu chứng bệnh vàng bắt đầu xuất sau 60 ngày ba kích nhi m bệnh bị chết hoàn toàn tương tự triệu chứng quan sát thấy tự nhiên (hình 1D) 69 BVTV - Sè 5/2018 Kết nghiên cứu khoa học Hình Triệu bệnh vàng thối rễ hại Ba kích tím huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh 2017 (A) Triệu chứng bệnh cây, (B) Triệu chứng bệnh củ r cây, (C) Cành bào tử bảo tử nấm F fujikuroi môi trường PDA, (D) biểu bệnh sau lây nhi m 45 ngày 3.2 Giám định nấm F fujikuroi gây bệnh vàng thối rễ hại Ba kích tím kỹ thuật PCR phân tích phả hệ Nấm gây bệnh vàng thối r phân lập, làm Bào tử nấm chiết suất DNA tổng số làm mạch khuôn cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chung ITS4/ITS5 để khuếch đại vùng ITS Sản phẩm PCR tất mẫu nấm có kích thước khoảng 570 bp Giải trình tự hai chiều tồn số mẫu thu kết đồng Trình tự gen chủng nấm BKQN.2017 chọn làm đại diện để BLAST so sánh Ngân hàng gen NCBI Kết phân tích trình tự gen xây dựng phả hệ ghi nhận chủng nấm phân lập từ phận Ba kích tím có triệu chứng bệnh vàng thối r Quảng Ninh (kí hiệu BKQN.2017) với đại diện loài nấm Fusarium fujikuroi có mã số Ngân hàng Gen KT192406.1 tạo thành nhánh riêng biệt so với loài Fusarium khác phả hệ Tổng hợp kết quan sát hình thái phân tích trình tự gen cho thấy chủng nấm gây bệnh vàng thối r Ba kích tím huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh Fusarium fujikuroi (hình 2) Fusarium proliferatum (KJ767073.1) Fusarium oxysporum f sp (KF534747.1) Fusarium oxysporum f sp (KU097320.1) Fusarium equisetai (KY365254.1) Fusarium globosum (LT746278.1) Fusarium proliferatum (HQ332533.1) Gibberella moniliformis (EU364843.1) Fusarium sp (KX611638.1) Fusarium verticillioides ((KM434131.1) Fusarium fujikuroi (KT192406.1) BKQN.2017 0.001 Hình Cây phả hệ đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor-Joining (Viện Bảo vệ thực vật, 2017) Trình tự gen nấm gây bệnh vàng thối rễ Ba kích tím đƣợc ký hiệu BKQN.2017 Các mã số Ngân hàng gen đƣợc ghi ngoặc đơn 70 Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 3.3 Sự phát triển nấm F fujikuroi loại môi trƣờng nhiệt độ khác 3.3.1 Sự phát triển nấm F fujikuroi o môi trường dinh dưỡng nhiệt độ 25 C o Ở điều kiện nhiệt độ 25 C, nấm F fujikuroi sinh trưởng phát triển khác loại môi trường dinh dưỡng khác Sau ngày nuôi cấy nấm phát triển tốt môi trường PDA, Cà rốt, Czapek Dox YMA, kích thước tản nấm trung bình đạt 8,5±0,00 cm Nấm sinh trưởng phát triển môi trường bột đậu, sau ngày kích thước tản nấm đạt 6,28±0,42 cm Tuy nhiên, nấm lại có thời gian hình thành bào tử sớm môi trường Bột đậu, PDA sau ngày nuôi cấy Trên môi trường Czapek Dox, YMA, Cà rốt nấm hình thành bào tử sau 3-4 ngày ni cấy Đồng thời màu sắc tản nấm cúng thay đổi tùy thuốc vào môi trường nuôi cấy, môi trường PDA, Bột đậu, Czapek Dox tản nấm có màu trắng, mơi trường Cà rốt, YMA tản nấm có màu trắng hồng Trên mơi trường khác kích thước bào tử khác Kích thước bào tử lớn thay i t 8,96ì1,50-12,18ì1,70 àm Sau ngy nuụi cy kớch thước bào tử lớn lớn môi trường YMA (12,18ì1,70 àm), kớch thc bo t ln nh nht trờn mụi trng Bt u (8,96ì1,50 àm) Kớch thc bo t nhỏ khơng có khác biệt lớn loại mơi trường dinh dưỡng, kích thước bào tủ nhỏ đạt trung bỡnh t 4,04ì1,41-4,92ì1,33 àm sau ngy nuụi cy (bảng 1) Bảng Sự phát triển nấm F fujikuroi loại môi trƣờng o khác nhiệt độ 25 C (Viện Bảo vệ thực vật, 2017) Môi trường PDA Cà rốt Bột đậu Czapek Dox YMA KTTN sau ngày (cm) 8,50±0,00 8,50±0,00 6,28±0,42 8,50±0,00 8,50±0,00 màu sắc tản TGHT bào nấm tử (ngày) Trắng Trắng hồng Trắng Trắng Trắng hồng Kích thước bào tử (µm) Bào tử lớn Bào tử nhỏ 11,62×1,86 4,76×1,74 9,36×1,86 4,36×1,33 8,96×1,50 4,04×1,41 12,10×1,65 4,92×1,33 12,18×1,70 4,68×1,33 Ghi chú: KTTN = kích thước tản nấm, TGHT = Thời gian hình thành 3.3.2 Sự phát triển nấm F fujikuroi o môi trường dinh dưỡng nhiệt độ 30 C o Ở nhiệt độ 30 C, nấm phát triển môi trường, kích thước tản nấm sau ngày đạt từ 2,42-5,82 cm Nấm nuôi cấy môi trường Bột dậu sau ngày hình thành bào tử, nấm ni cấy mơi trường PDA, Czapek Dox, YMA hình thành bao tử sau ngày nuôi cấy, nguồn nấm nuôi cấy mơi trường Cà rốt hình thành bào tử chậm sau ngày o Ở điều kiện 30 C, màu sắc tản nấm Cà o rốt, YMA thay đổi so với điều kiện 25 C từ màu trắng hồng sang màu trắng xám Trên môi trường PDA, Bột đậu, Czapek Dox nấm giữ màu trắng Bào tử lớn nấm nuôi môi trường Bọt đậu cú kớch thc ln nht l 12,1ì1,65 àm nhng li cú kớch thc bo t nh nh nht (3,78ì1,14 àm) Kích thước bào tử lớn nấm mơi trường ni cấy có kích thước trùng bình từ 9,99×1,33-10,73×1,57 o Bảng Sự phát triển nấm F fujikuroi loại môi trƣờng khác 30 C (Viện Bảo vệ thực vật, 2017) Môi trường PDA Cà rốt Bột đậu Czapek Dox YMA KTTN sau ngày (cm) 4,98±0,28 3,32±0,35 2,42±0,27 5,82±0,09 5,12±0,03 màu sắc tản nấm Trắng Trắng xám Trắng Trắng Trắng xám TGHT bào tử (ngày) 3 Kích thước bào tử (àm) Bo t ln Bo t nh 10,09ì1,53 4,68ì1,29 10,73ì1,57 4,16×1,25 12,10×1,65 3,78×1,14 9,99×1,33 4,04×1,29 10,65×1,57 4,76×1,50 Ghi chú: KTTN = kích thước tản nấm, TGHT = Thời gian hình thành 71 BVTV - Sè 5/2018 Kết nghiên cứu khoa học 3.3.3 Sự phát triển nấm F fujikuroi o môi trường dinh dưỡng nhiệt độ 35 C o Ở nhiệt độ 30 C, nấm phát triển mơi trường, kích tước thản nấm đạt từ 1,11,5 cm Màu sắc tản nấm có màu trắng mơi trường PDA, Bột đậu, Czapek Dox YMA, môi trường Cà rốt tản nấm có màu trắng vàng Thời gian hình thành bào tử rút ngắn xuống ngày mơi trường Cà rốt, Bột đậu, Czapek Dox Trên môi trường PDA YMA kéo dài thời gian hình thành bào tử so với điều kiện môi trường ngày (bảng 3, hình 3) o Bảng Sự phát triển nấm F fujikuroi môi trƣờng dinh dƣỡng khác 35 C (Viện Bảo vệ thực vật, 2017) Môi trường PDA Cà rốt Bột đậu Czapek Dox YMA KTTN sau ngày (cm) 1,50±0,10 1,30±0,02 1,40±0,10 1,10±0,09 1,30±0,06 màu sắc tản nấm Trắng Trắng vàng Trắng Trắng Trắng Kích thước bào tử (µm) Bào tử lớn Bào tử nhỏ 10,65×1,94 5,28×1,49 7,18×1,82 3,71×1,38 18,32×3,79 5,32×2,26 12,34×2,06 4,52×1,38 10,81×1,74 5,01×1,57 TGHT bào tử (ngày) 1 Ghi chú: KTTN = kích thước tản nấm, TGHT = Thời gian hình thành Kích thước bào tử lớn bào tử nhỏ cúng có chênh lệch đáng k, kich thc bo t ln t 7,18ì1,82- 18,32ì3,79 àm, kích thước bào tử nhỏ từ 3,71×1,38-5,32×2,26 Kích thước bào lớn bào tử nhỏ đạt lớn mơi trường Bột đậu với kích thước 18,32ì3,79 àm v 5,32ì2,26 àm Hỡnh S phỏt trin nấm F fujikuroi loại môi trƣờng dinh dƣỡng khác o o o điều kiện nhiệt độ khác nhau: (1) Ở nhiệt độ 25 C, (2) nhiệt độ 30 C (3) nhiệt độ 35 C KẾT LUẬN - Nấm Fusarium fujikuroi tác nhân gây bệnh vàng thối r Ba kích tím Quảng Ninh o - Ở điều kiện nhiệt độ 25 C nấm F fujikuroi phát triển tốt loại môi trường, nấm phát triển mạnh mơi trường PDA Thời gian hình thành bào tử môi trường PDA bột đậu sớm sau ngày nuôi cấy o - Ở điều kiện từ 30 C trở lên nấm có tốc độ phát triển cấc môi trường, lại có thời gia hình thành bào tử sớm sau ngày nuôi cấy môi trường Cà rốt, Bột đậu, Czapek o Dox Ở nhiệt độ 35 C, bào tử lớn bào tử nhỏ có kích thước lớn môi trường Bột đậu 72 Lời cảm ơn Cơng trình phần kết đề tài cấp tỉnh Quảng Ninh Nghiên cứu giải pháp khoa học công nghệ quản lý tổng hợp sâu, bệnh hại Ba kích tím Giảo cổ lam tỉnh Quảng Ninh TS Trịnh Xuân Hoạt (Viện Bảo vệ thực vật) làm chủ trì TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguy n Thị Hồng Hạnh, 2012 “Nghiên cứu nấm Fusarium fujikuroi hạt lúa” Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Viện Bảo vệ thực vât, 1997 Phương pháp Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 nghiên cứu bảo vệ thực vật tập Nxb Nông nghiệp Hà Nội tr 46-57 Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J., 1990 Basic local alignment search tool J Mol Biol 215:403-410 Booth C., 1971 The Genus Fusarium Commonwealth Mycological Institute, Eastern Press Limited, Kew Surrey Doyle J.J and Doyle J.L.,1990 Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus 12:13-15 Kumar S., Stecher G., Tamura K., 2016 MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets Mol Biol Evol 33(7):1870-1874 Luo S., Chen Z., 1989 Study on the Fusarium wilt disease of medicinal Indian mulberry Journal of Fujian Agricultural College 18(4):526-531 Shi X and Chi P., 1988 Identification of the pathogen causing wilt disease of the medicinal herb Indian mulberry (Morinda officinalis How.) Acta Phytopathologica Sinica 18(3):137-142 White T.J., Burns T., Lee S and Taylor J.W., 1990 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: Innis MA, Gelfald DH, Sninsky JJ and White TJ (eds) PCR Protocol: A Guide to Methods and Applications (pp 315-322) Academic press, New York, USA Phản biện: TS Hà Minh Thanh NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM Botrytis cinerea Pers GÂY BỆNH THỐI XÁM TRÊN THƢỢC DƢƠC, CÀ CHUA VÀ LẠC TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG Study on Biological Characteristics of Botrytis cinerea Pers Causing Gray Mold Disease on Dahlia, Tomato and Groundnut in Red River Delta 1 Mai Văn Quân , Trịnh Xuân Hoạt , Đặng Vũ Thị Thanh , Lê Quang Mẫn , Ngô Quang Huy Ngày nhận bài: 08.08.2018 Ngày chấp nhận: 27.08.2018 Abstract Botrytis cinerea is an important pathogen that causes gray mold disease in different crop in Viet Nam In present study, a total of 15 isolates were isolated from tomato (Solanum lycopersicum L.), dahlia (Dahia pinnata Cav.), groundnut (Arachis hypogae L.) in the Red River delta The morphological characteristics were based on characters such as conidiophore and conidial length; and the results indicated that all isolates belonged to Botrytis cinerea PCR with universal primer pair ITS4/ITS5 amplified DNA fragments of about 700 bp from all isolates The DNA sequencing and phylogenetic analysis based on ITS confirmed that B cinerea is the causal agent of gray mold disease on crop The effect of various culture conditions on mycelium growth, sporulation, sclerotia formation of B cinerea was performed CR is an oftimal medium for production of mycelium, spores and sclerotia The growth of mycelium cultured on CR as the fastest with the production of mycelium, fungal spores and sclerotia The optimal conditions for mycelium growth and o sporulation of B cinerea isolated from dahlia was 15-20 C on PDA medium The optimal conditions for mycelium growth was the 12:12 (CL:D) cycles of 12 hours light and 12 hours darkness; and the continous Viện Bảo vệ thực vật, Hội KHKT Bảo vệ thực vật Việt Nam darkness was optimum condition for sporulation Keywords: B cinerea, gray mould disease, biological characteristic and molecular identification 73 .. .Kết nghiên cứu khoa học gây hại biện pháp phòng trừ bệnh vàng thối r nấm F fujikuroi gây Viện Bảo vệ thực vật tiến hành Bài báo số kết nghiên cứu nấm F fujikuroi gây bệnh vàng thối r hại ba kích. .. PDA, (D) biểu bệnh sau lây nhi m 45 ngày 3.2 Giám định nấm F fujikuroi gây bệnh vàng thối rễ hại Ba kích tím kỹ thuật PCR phân tích phả hệ Nấm gây bệnh vàng thối r phân lập, làm Bào tử nấm chiết... thập phân lập bệnh vàng thối r Ba kích tím theo phương pháp điều tra phát bệnh Viện Bảo vệ thực vật (1997) - Định danh nấm gây bệnh: Nấm gây bệnh vàng thối r sau làm đỉnh sợi nấm Cấy nấm môi trường