Nghiên cứu nhằm mục đích đánh giá hiệu quả ức chế nấm Alternaria sp. gây bệnh đốm lá của các tinh dầu thực vật ở dạng nano trong điều kiện in vitro. Đầu tiên, tinh dầu thực vật (ớt, tỏi và sả chanh) được đóng gói vào hệ mang nano bằng phương pháp đồng hóa tốc độ cao kết hợp với sóng siêu âm để giảm kích thước, hỗn hợp được tạo thành khi trộn ba dịch phân tán nano của tinh dầu tỏi, ớt và sả chanh
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(116)/2020 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM Alternaria sp GÂY BỆNH ĐỐM LÁ BẰNG HỖN HỢP HỆ NANO CỦA TINH DẦU ỚT, TINH DẦU TỎI VÀ TINH DẦU SẢ CHANH Trần hị Ngọc Mai1, Vũ Ngọc Bích Đào1, Nguyễn Ngọc hùy Trang1, Nguyễn hị Huỳnh Nga2, Nguyễn Minh Hiệp1 TĨM TẮT Nghiên cứu nhằm mục đích đánh giá hiệu ức chế nấm Alternaria sp gây bệnh đốm tinh dầu thực vật dạng nano điều kiện in vitro Đầu tiên, tinh dầu thực vật (ớt, tỏi sả chanh) đóng gói vào hệ mang nano phương pháp đồng hóa tốc độ cao kết hợp với sóng siêu âm để giảm kích thước, hỗn hợp tạo thành trộn ba dịch phân tán nano tinh dầu tỏi, ớt sả chanh Sau đó, hiệu kháng nấm in vitro hệ nano chứa tinh dầu thực vật (dạng đơn lẻ hỗn hợp) thực phương pháp đĩa thạch nồng độ pha loãng khác 250, 500, 750 1000 lần Kết cho thấy, hệ nano tinh dầu tổng hợp thành cơng với kích thước hạt trung bình nhỏ 151 nm zeta lớn -30 mV Kết cho thấy, kết hợp ba hệ nano chứa tinh dầu ớt, tinh dầu tỏi tinh dầu sả chanh vào chế phẩm theo tỉ lệ : : (v/v/v) (gọi tắt naOTS) cho hiệu ức chế nấm Alternaria sp điều kiện in vitro cao (đạt 97,78% nồng độ pha lỗng 750 lần) Do đó, naOTS có tiềm ứng dụng rộng rãi thay cho thuốc trừ nấm hóa học phịng trừ nấm Alternaria sp Từ khóa: Hệ nano, nấm Alternaria sp., tinh dầu ớt, tinh dầu sả chanh, tinh dầu tỏi I ĐẶT VẤN ĐỀ Alternaria loại nấm gây bệnh phổ biến nhiều loại trồng Cây bị bệnh nấm Alternaria bị chết giai đoạn con, lớn bị rụng thối quả, gây thiệt hại từ 35 - 80% sản lượng (Bessadat et al., 2016) Ngày nay, việc kiểm soát nấm chiết xuất từ thực vật mà đặc biệt sử dụng tinh dầu thực vật quan tâm đến tính an tồn cho người mơi trường Những năm gần đây, tinh dầu ớt, tỏi có khả hạn chế nảy mầm nấm Alternaria alternata tinh dầu sả hạn chế phát triển nấm Alternaria solani, nhiên hiệu chưa cao (Lima et al., 2016) Điều do, loại tinh dầu thường có độ phân tán nước thấp, tính thấm bền tác động điều kiện môi trường nên hiệu sử dụng thực tế thường không cao (Asbahani et al., 2015) Để tăng hiệu sử dụng, hệ nhũ nano chất lipid sử dụng giá thành rẻ, cải thiện độ phân tán, bảo vệ hoạt chất khỏi điều kiện bất lợi môi trường kiểm sốt tốc độ phóng thích, kéo dài thời gian tác dụng, từ làm tăng hiệu sử dụng tinh dầu (Nguyen et al., 2012; Nguyen et al., 2016) Với mục tiêu bước đầu nghiên cứu chế phẩm sinh học có hiệu kháng nấm Alternaria sp., nghiên cứu này, đầu tiên, hệ nhũ nano chất lipid chứa tinh dầu tỏi (naT) tinh dầu ớt (naO) tinh dầu sả chanh (naS) tổng hợp phương pháp đồng hóa tốc độ cao kết hợp với sóng siêu âm để giảm kích thước Sau đó, hiệu ức chế nấm naT, naO, naS dạng kết hợp hai ba hệ nano chứa tinh dầu thực vật thực phương pháp đĩa thạch II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chủng nấm Alternaria sp (Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt); tinh dầu tỏi, tinh dầu ớt, tinh dầu sả chanh độ tinh khiết 98% (Công ty TNHH tinh dầu thảo dược Dalosa, Việt Nam); môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) (Công ty TNHH HiMedia Laboratories, Ấn Độ) Các hóa chất khác có độ tinh khiết cấp độ phân tích 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tổng hợp hệ nano chứa tinh dầu thực vật Hệ nano chứa tinh dầu thực vật (tinh dầu ớt, tinh dầu tỏi tinh dầu sả chanh) tổng hợp phương pháp đồng hoá tốc độ cao kết hợp với sử dụng sóng siêu âm để giảm kích thước Cụ thể, 10 g tinh dầu cho vào hỗn hợp chứa 10 g chất hoạt động bề mặt gồm lecithin tween 80 (1 : 1, w/w) khuấy tan 80 g nước Sau đó, hỗn hợp dung dịch đồng hố 16 000 vòng/phút phút máy Ultra Turrax homogenizer digital (T25D, Laboratory equipment, Đức) giảm kích thước sóng siêu âm sử dụng thiết Trung tâm Công nghệ xạ Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Khoa Sinh học, Đại học Đà Lạt 141 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(116)/2020 bị Ultrasonic Liquid Processor (VC 750, Sonics & Materials, USA) phút, công suất 25% Dịch phân tán nano thu sử dụng cho thí nghiệm sau (Nguyen et al., 2012) Các chế phẩm hỗn hợp tinh dầu trộn theo tỉ lệ : (v/v) kết hợp hai loại tinh dầu tỉ lệ : : (v/v/v) kết hợp ba loại tinh dầu 2.2.4 Phương pháp xử lý kết Số liệu tính tốn phần mềm Microsot Excel Các kết số liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Đánh giá độ tin cậy thơng qua phân tích thống kê phần mềm SPSS phương pháp One-Way Anova, phép thử Duncan (mức ý nghĩa p < 0,05) 2.2.2 Khảo sát thông số đặc điểm hệ nano chứa tinh dầu 2.3 hời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng 01 năm 2020 đến tháng năm 2020 Trung tâm Công nghệ Sinh học Công nghệ Bức xạ, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Kích thước hạt, số phân tán zeta hệ nano chứa tinh dầu xác định thiết bị Zetasizer Nano ZS (Malvern, U.K.) Cụ thể, dịch phân tán nano pha loãng 100 lần với nước cất phép đo thực 25oC với góc đo 173o 2.2.3 Khảo sát hiệu ức chế nấm chế phẩm điều kiện in vitro Hiệu ức chế nấm Alternaria sp chế phẩm nano chứa tinh dầu thực vật (naT, naO, naS) dạng riêng lẻ kết hợp thực phương pháp đĩa thạch (Amini et al., 2012; Nguyễn hị Hoài hu Nguyễn Anh Dũng, 2017) Cụ thể, nấm cấy lên mơi trường PDA có bổ sung dịch phân tán (hoặc hỗn hợp dịch phân tán) nano tinh dầu thực vật với độ pha loãng 250, 500, 750 1000 lần Với mẫu đối chứng mẫu khơng có bổ sung dịch phân tán nano Sau ngày, mẫu quan sát đo đường kính nấm phát triển Hiệu ức chế nấm tính theo cơng thức Soylu Kose (2015) sau: D – Dt Hiệu ức chế nấm (%) = c 100 Dc Trong đó: Dc đường kính khuẩn lạc môi trường đối chứng; Dt đường kính khuẩn lạc mơi trường có bổ sung tinh dầu III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tổng hợp hệ nano chứa tinh dầu thực vật Hệ nano loại tinh dầu thực vật tổng hợp thành cơng phương pháp đồng hóa tốc độ cao kết hợp với giảm kích thước sóng siêu âm Như trình bày bảng 1, tất hệ nano chứa tinh dầu thực vật tổng hợp có kích thước trung bình cấp độ nano Cụ thể, naO có kích thước lớn 150,6 nm naT có kích thước nhỏ 99,7 nm Bên cạnh đó, kết hợp hệ nano tinh dầu (kết hợp hai ba loại), kích thước hạt trung bình có thay đổi mức nhỏ 150 nm Trong đó, việc phối trộn với tỉ lệ : : (v/v/v) loại nano tinh dầu (gọi tắt naOTS) cho kích thước hạt trung bình khoảng 134 nm Với kích thước giúp hệ nano dễ thấm vào tế bào nấm làm tăng hiệu sinh học Đồng thời, kết bảng cho thấy zeta tất chế phẩm có giá trị tuyệt đối lớn 30 mV, số nghiên cứu trước cho thấy zeta lớn 30 mV cho thấy hệ nano có độ ổn định thời gian dài, sau tháng giữ kích thước nano, giúp tăng thời gian bảo quản sử dụng (Honary Zahir, 2013; Mehnert and Mäder, 2001) Bảng Các thông số đặc điểm hệ nano chứa tinh dầu thực vật Dịch phân tán nano 142 Kích thước hạt (nm) Chỉ số phân tán (PDI) hế Zeta (mV) Ớt (naO) 150,6 ± 2,7 0,251 ± 0,010 -45,2 ± 2,2 Tỏi (naT) 99,7 ± 1,0 0,203 ± 0,024 -41,3 ± 1,7 Sả chanh (naS) 113,0 ± 3,3 0,234 ± 0,033 -36,2 ± 1,0 Tỏi + ớt (naTO) 135,5 ± 1,5 0,264 ± 0,007 -43,8 ± 1,5 Tỏi + sả chanh (naTS) 104,4 ± 1,5 0,176 ± 0,015 -37,3 ± 1,3 Ớt + sả chanh (naOS) 127,1 ± 2,1 0,240 ± 0,023 -38,4 ± 1,8 Ớt + tỏi + sả chanh (naOTS) 134,5 ± 1,6 0,242 ± 0,021 -42,6 ± 1,6 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(116)/2020 Hình Biểu đồ phân bố kích thước dịch phân tán nano Ghi chú: (A): Dịch phân tán naO, (B) Dịch phân tán naT, (C): Dịch phân tán naS, (D): Dịch phân tán hỗn hợp naOTS Bên cạnh đó, hình cho thấy đóng gói vào hệ nano, tinh dầu có độ phân tán tốt nhiều so với dạng thông thường Cụ thể, tinh dầu dạng thông thường cho vào nước bị tách lớp độ tan nước (hình 2A) Trong đó, tinh dầu sau đóng gói vào hệ nhũ nano chất lipid có khả phân tán tốt nước (hình 2B) Ngồi ra, hệ nano giúp bảo vệ tinh dầu hạn chế thất thoát khỏi điều kiện bất lợi môi trường tăng khả thấm vào trồng (Nguyen et al., 2016) Hình Độ phân tán tinh dầu thực vật Ghi chú: (A): Dạng thông thường, (B): Dạng nano 3.2 Hiệu ức chế nấm Alternaria sp chế phẩm điều kiện in vitro Hiệu ức chế nấm điều kiện in vitro thực phương pháp đĩa thạch Kết từ bảng hình cho thấy, mẫu đối chứng, nuôi cấy môi trường PDA, hệ sợi nấm phát triển mạnh sau ngày ni cấy Trong đó, nghiệm thức có bổ sung naT, naS độ pha loãng 250 lần cho hiệu ức chế nấm hoàn toàn naO cho hiệu ức chế nấm đạt khoảng 76% Tuy nhiên, nghiệm thức có bổ sung naT, naS naO độ pha loãng 500 lần, hiệu ức chế nấm 61,88%, 27,75% 4,7% Điều cho thấy, naT cho hiệu ức chế nấm Alternaria sp tốt so với naS naO Tuy nhiên, kết bảng rằng, tiến hành kết hợp loại tinh dầu với nhau, hiệu ức chế nấm tăng lên rõ rệt Cụ thể, việc kết hợp naT naO tỉ lệ : (v/v) (naTO) kết hợp naT naS tỉ lệ : (v/v) (naTS) cho hiệu ức chế nấm hoàn toàn nồng độ pha loãng 500 lần, kết hợp naO naS tỉ lệ : (v/v) (naOS) cho hiệu đạt khoảng 74% Điều cho thấy, việc sử dụng hỗn hợp hai loại tinh dầu cho tác dụng hiệp đồng dẫn đến làm tăng khả ức chế nấm Alternaria sp cao so với riêng lẻ Cụ thể, naTS độ pha loãng 500 lần cho hiệu ức chế nấm gấp 1,62 lần so với naT 3,6 lần so với naS Tương tự 143 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(116)/2020 naTO cho hiệu cao 1,59 lần so với naT gần 21 lần so với naO Kết bảng cho thấy rằng, naO độ pha loãng 500 lần cho hiệu thấp (khoảng 4,7%) Tuy nhiên, việc kết hợp naO với naT giúp tăng hiệu ức chế nấm Alternaria sp cho naT độ pha loãng 500 lần từ 61,88% lên 98,23% (tương đương tăng gần 36%), nồng độ naT hỗn hợp naTO 50% so với nghiệm thức naT độ pha loãng Tương tự, việc sử dụng kết hợp naO naS giúp làm tăng hiệu trị nấm lên 46,5% so với naS Qua kết này, thấy naO có vai trị nhân tố mở đường giúp tăng hoạt tính sinh học cho naT naS Bảng Hiệu ức chế nấm Alternaria sp điều kiện in vitro Dịch phân tán nano naO naT naS naTO naTS naOS naOTS Độ pha loãng 250 lần 76,06 ± 2,66b 100 ± 0a 100 ± 0a 100 ± 0a 100 ± 0a 100 ± 0a 100 ± 0a Hiệu ức chế nấm (%) Độ pha loãng Độ pha loãng 500 lần 750 lần e 4,7 ± 2,03 0e 61,88 ± 1,54c 0e d 27,75 ± 2,77 0e 98,23 ± 3,07a 23,76 ± 4,06c 100 ± 0a 38,83 ± 2,66b b 74,29 ± 3,07 12,48 ± 1,27d 100 ± 0a 97,78 ± 3,0a Độ pha loãng 1000 lần 0c 0c 0c 0,71 ± 0,41b 2,48 ± 0,93b 1,86 ± 0,27b 17,55 ± 2,66a Ghi chú: Các chữ a, b, c, d, e khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Khi tiếp tục tăng độ pha loãng đến 750 lần việc kết hợp sử dụng hai loại tinh dầu dạng nano giảm rõ rệt hiệu cao 38,83% hệ nano naTS Cụ thể, so với hiệu nghiệm thức pha lỗng 500 lần hiệu phịng trị nấm Alternaria giảm 74,47% hệ naTO, 61,17% hệ naTS giảm 61,81% hệ naOS Tuy nhiên, kết hợp ba hệ nano tinh dầu tỏi, ớt, sả chanh với tỉ lệ : : (v/v/v), nồng độ loại tinh dầu 1/3 so với nồng độ chúng naO, naT, naS hiệu kháng nấm lại tăng lên rõ rệt dù pha loãng 750 lần, đạt tới 97,78% (tương đương gấp 4,12 lần so với naTO; 2,52 lần so với naTS 6,83 lần so với naOS) Các kết rằng, điều kiện nuôi cấy in vitro, việc kết hợp sử dụng hỗn hợp ba hệ nano chứa tinh dầu tỏi, ớt sả chanh (naOTS) cho hiệu ức chế nấm Alternaria sp tốt nhất, pha lỗng tới 750 lần giúp mang lại hiệu kinh tế, có khả ứng dụng vào thực tế Kết tất nghiệm thức cho thấy hiệu ức chế nấm gần khơng cịn độ pha lỗng 1000 lần Điều pha lỗng 1000 lần nồng độ chất hoạt tính chứa lượng tinh dầu ngưỡng “nồng độ ức chế tối thiểu” (minimal inhibitory concentration) nấm Alternaria sp (Cruz et al., 2013) Hình Hiệu ức chế nấm Alternaria sp điều kiện in vitro 144 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(116)/2020 IV KẾT LUẬN Các hệ nano chứa tinh dầu thực vật naT, naO, naS tổng hợp thành công có kích thước trung bình đạt mức nano từ 99,7 đến 150,6 nm giá trị tuyệt đối zeta lớn 30 mV cho thấy hệ bền Ở điều kiện in vitro, naT có hiệu ức chế nấm Alternaria sp tốt naS naO, gần 62% nồng độ pha loãng 500 lần Khi kết hợp ba hệ nano tinh dầu ớt, tỏi sả chanh (naOTS) cho hiệu ức chế nấm gần hồn tồn đạt 97,78% nồng độ pha lỗng 750 lần Như vậy, bước đầu cho thấy hệ naOTS cho hiệu ức chế nấm Alternaria sp., có tiềm ứng dụng thực tế nông nghiệp nước ta TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn hị Hoài hu, Nguyễn Anh Dũng, 2017 Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật nano Ag/Chitosan điều kiện in vitro Tạp chí trường Đại học Tây Nguyên, 22: 25-30 Amini, M., Safaie, N., Salmani, M.J., Shams-Bakhsh, M., 2012 Antifungal activity of three medicinal plant essential oils against some phytopathogenic fungi Trakia J Sci., 10: 1-8 Asbahani, A E., Miladi, K., Badri, W., Sala, M., Addi, E H A., Casabianca, H., Mousadik, E A., Hartmann, D., Jilale, A., Renaud, F.N.R., Elaissari, A., 2015 Essential oils: From extraction to encapsulation Int J Pharm., 483: 220-243 Bessadat, N., Berruyer, R., Hamon, B., BatailleSimoneau, N., Benichou, S., Kihal, M., Henni, D., Simoneau, P., 2016 Alternaria species associated with early blight epidemics on tomato and other Solanaceae crops in Northwestern Algeria Eur J Plant Pathol., 148: 181-197 Cruz, R.C., Werneck, S.M.C., Oliveira, C.S., Santos, P.C., Soares, B.M., Santos, D.A., Cisalpino, P.S., 2013 Inluence of diferent media, incubation times and temperatures for determining the MICs of seven antifungal agents against Paracoccidioides brasiliensis by microdilution Honary, S., Zahir, F., 2013 Efect of zeta potential on the properties of Nano-Drug delivery systems - a review (part 2) Trop J Pharm Res 12, 265-273 Lima, C B de, Rentschler, L L A., Bueno, J T., & Boaventura, A C., 2016 Plant extracts and essential oils on the control of Alternaria alternata, Alternaria dauci and on the germination and emergence of carrot seeds (Daucus carota L.) Ciência Rural, 46(5), 764-770 Mehnert, W., Mäder, K., 2001 Solid lipid nanoparticles: production, characterization and applications Adv Drug Deliv Rev., 47: 165-96 Nguyen, M.H, Nguyen, T.H.N., Hwang, I.C., Park, H.J., 2016 Efect of physical state of nanocarriers on their penetration into the root and upward transportation to the stem of soybean plants using confocal laser scanning microscopy Crop Prot., 87: 25-30 Nguyen, M.H., Hwang, I C., Park, J W., Park, H J., 2012 Enhanced payload and photo-protection for pesticides using nanostructured lipid carriers with corn oil as liquid lipid J Microencapsulation, 29: 596-604 Soylu, E M., Kose, F., 2015 Antifungal Activities of Essential Oils Against Citrus Black Rot Disease AgentAlternaria alternaTa J Essent Oil-Bear Plants, 18 (4): 894-903 Investigation of inhibitory efect of mixture of nanocariers encapsulating chili, garlic and lemongrass oil on Alternaria sp causing leaf spot disease Tran hi Ngoc Mai, Vu Ngoc Bich Dao, Nguyen Ngoc huy Trang, Nguyen hi Huynh Nga, Nguyen Minh Hiep Abstract his study aims to investigate the in vitro inhibitory efect of nano-formulations of essential oils against Alternaria sp causing leaf spot disease Firstly, essential oil (chili oil, garlic oil and lemongrass oil) encapsulated nanocarriers was prepared by using a combing method of homogenization and sonication, and their mixture was generated by mixing these nanoformulations Ater that, the in vitro antifungal efect of these prepared nano-formulations (individual forms and mixture forms) was carried out by agar disk method at 250, 500, 750, and 1000 times dilution he results showed that the nano-formulations of essential oils were successfully prepared with an average particle size smaller than 151 nm and the zeta potential lager than -30 mV he results also indicated that the mixture with ratio : : (v/v/v) of the nano-formulations of chili oil, garlic oil and lemongrass oil (NaOTS) had the highest in vitro inhibitory efectiveness (approximately 97.78% at 750 times dilution) on Alternaria sp herefore, NaOTS shows great potential of wide application for replacing chemical fungicides in Alternaria sp control Keywords: Alternaria sp., nanocarriers, chili oil, lemongrass oil, garlic oil Ngày nhận bài: 3/7/2020 Ngày phản biện: 15/7/2020 Người phản biện: PGS TS Nguyễn hị Minh Tú Ngày duyệt đăng: 23/7/2020 145 ... góc đo 173o 2.2.3 Khảo sát hiệu ức chế nấm chế phẩm điều kiện in vitro Hiệu ức chế nấm Alternaria sp chế phẩm nano chứa tinh dầu thực vật (naT, naO, naS) dạng riêng lẻ kết hợp thực phương pháp... việc kết hợp sử dụng hỗn hợp ba hệ nano chứa tinh dầu tỏi, ớt sả chanh (naOTS) cho hiệu ức chế nấm Alternaria sp tốt nhất, pha lỗng tới 750 lần giúp mang lại hiệu kinh tế, có khả ứng dụng vào thực... in vitro, naT có hiệu ức chế nấm Alternaria sp tốt naS naO, gần 62% nồng độ pha loãng 500 lần Khi kết hợp ba hệ nano tinh dầu ớt, tỏi sả chanh (naOTS) cho hiệu ức chế nấm gần hoàn toàn đạt 97,78%