Thực tập hóa sinh học

NGUYỄN QUANG VINH BÙI PHƯƠNG THUẬN - PHAN TUẤN NGHĨA h ó a s i n h h ọ Is L m I NHÀ XUẤT BÀN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI c NGUYỄN QUANG VINH BÙI PHƯƠNG THUẬN - PHAN TUẤN NGHĨA THỰC TẬP HÓA SINH HỌC ■ ■ (ỉn lần thứ 2) NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Mục lục • ■ Lời nói đ ầ u V C h n g P V o tein 1.1 Tính chất lưỡng tính axit amin protein 1.2 Tính chất keo dung dịch protein 1.2.1 Phản ứng kết tủa thuận nghịch p ro tein 1.2.2 Sự biến tính p ro tein 1.3 Các phản ửng màu axit amin protein 1.3.1 Phản ứng b iu r e 1.3.2 Phản ứng với ninhiđrin 11 1.3.3 Phản ứng với axit n itrơ 13 1.3.4 Phản ứng xantoprotein axit amin v ò n g .14 1.3.5 Phản ứng Pauli để phát histiđin tirozin 15 1.3.6 Phản ứng M illon đặc trưng cho tirozin 16 1.3.7 Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho triptophan: 17 1.3.8 Phản ứng prolin VỎ1 thuốc thử iz a tin 19 1.3.9 Phản ứng axit amin chứa lưu huỳnh (Phản ứng F o lia ) 20 1.3.10 Phản ứng Sakaguchi đặc trưng cho a cg in in 21 1.4 Định lượng axit am in protein 23 1.4.1 Xác định nitơ amin (N-amin) phương pháp chuẩn độ focmol 23 1.4.2 Định lượng p ro tein 25 Chương Enzim » „.33 2.1 Các thí nghiệm định tính số e n z im ;i3 2.1.1 Pepxin (peptit-peptidohidrolaz) ;Ỉ3 2.1.2 Amilaz nước bọt ;ì4 2.1.3 U r e a z 35 2.1.4 Peroxidaz .36 2.2 Tính chất enzim ;Ỉ6 2.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính am ilaz nước b ọ• t 36 2.2.2 Anh hưởng pH môi trường đến hoạt độ enzim - Xác định pH thích hợp am ilaz nưốc bọt 'M 2.2.3 Ảnh hưởng chất kích thích chất kìm h ã m .‘59 2.2.4 Tính đặc hiệu enzira ,‘59 2.3 Xác định hoạt độ sơ"enzim .40 • • • • '% , 2.3.1 Xác định hoạt độ• catalaz 40 • • 2.3.2 Xác định hoạt độ a - am ilaz theo phương pháp W ohlgem u th 42 2.3.3 Xác định hoạt độ ureaz theo phương pháp chuẩn độ 43 2.3.4 Xác định hoạt độ proteinaz theo phương pháp Anson cải tiế n 45 2.3.5 Xác định hoạt độ lip a z 47 Chương S a ca rit 48 3.1 Các phản ứng định tín h 49 3.1.1 Các phản ứng mono - đ isa ca rit 49 3.1.2 Phản ứng định tính polisacarit 58 ii 3.2 Định lượng s a c a n t 61 3.2.1 Định lượng đường khử theo phương pháp B ertrand 62 3.2.2 Định lượng tinh b ộ t 64 C h n g A x it n u c l e i c .66 4.1 Các tính chât lí - hố axit n u c le ic 66 4.1.1 Tính tan axit n u cleic 66 4.1.2 Các phản ứng màu axit n u c le ic 67 4.2 Định lượng axit nucleic 70 4.2.1 Định lượng A D N 70 4.2.2 Định lượng A R N 72 ('h n g L ip it 74 5.1 Mỡ trung tính (tn axylglixerin ) 74 5.1.1 Tính chất lý hố mỡ 74 5.1.2 Phản ứng phân biệt thành phần cấu tạo mở 75 5.1.3 Xác định sô mỡ 78 5.2 L ip it 81 5.2.1 Tách lơxitin từ lòng đỏ trứ n g 82 5.2.2 Một sô" tính chất lơ x itin .82 5.3 Đ ịnh lượng L ipit 83 C h n g V ita m in 86 6.1 Các phản ứng định tính vitam in 86 6.1.1 Các vitam in hòa tan chất b éo 86 6.1.2 Các vitam in hòa tan n c .90 6.2 Đ ịnh lượng vitam in 96 6.2.1 Định lượng vitam in c theo phương pháp chuẩn độ 96 iii 6.2.2 Định lượng vitam in A 97 Chương H ocm on 99 7.1 Hocmon động v ậ t 100 ĩ.l.l.H o c m o n stero it 100 7.1.2 Hocmon peptit p ro tein 102 7.1.3 Hocmon dẫn xuất axit a m in .103 7.2 Hocmon thực v ậ t .106 7.2.1 Các hocmon dẫn xuất indol .106 7.2.2 G iberelin 109 Chương Các chất thực vật thứ sin h 113 8.1 G licozit 113 8.1.1 Định tính glicozit acbutin trúc đ o 114 8.1.2 Glicozit đào (Prunus persica L B atsch) 115 8.2 A n k a lo it 119 8.2.1 Một sô" phản ứng định tín h 119 8.2.2 Định lượng an k aloit 120 8.3 Các hợp chất ph en ol 122 Phu• lu• c .126 Một sô" chất thị màu để đo p H 126 Chuẩn bị dung dịch Folin (để xác định protein) 127 Chuẩn bị giấy Picrô - s ô đ ê .127 Bảng chuyển đổi lượng đồng thành lượng đường (mg) theo phương pháp B ectra n d 128 Tài liêu tham khảo c h ín h 129 # Lời nói đầu Giáo trình "Thực tập hóa sinh học” biên soạn để dùng làm tài liệu thực hành chương trình uHóa sinh học đại cươrg” bậc đại học Mục đích thí nghiệm tron* KĨáo trình minh họa củng cô phần kiến thức lý th m ết sinh viên học Ngồi ra, giáo trình củng nhằm giúp sinh viên làm quen với sơ phương pháp định lượng thường dùng phòng thí nghiệm Hóa sinh Trên sở giáo trình "Thực tập hóa sinh học” tập thể cán 3Ộ giảng dạy Bộ mơn Hóa Sinh, Khoa Sinh học, trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay trường Đại học Khoa học Tự nhiên) biên soạn trước qua thực tế sử dụng vối kinh nghiệm hướng dẫn thực tập điều kiện phòng thí nghiệm tại, chọn lọc biên soạn lại giáo trình, có sửa đổi 'à bơ sung sơ phần như: hocmon, chất thực vật thứ sinh nhằm đáp ứng yêu cầu đào tạo Giáo trình phân thành tám chương, giới thiệu tám nhón hợp chất quan trọng tê bào thể sông như: protein, enzim, sacarit, axit nucleic, lipit v ề bản, chưcng bao gồm phần chính: phần định tính phần định lượn* nhóm chất Trong đó, chịu trách nhiệm về: Chương I - Bùi Phương Thuận, Nguyễn Quang Vinh; Chương II - Phan Tuân Nghĩa, Nguyễn Quang Vinh; Chương III - Bùi Phương Thuận; Chương IV, VI - Phan Tuấn Nghĩa; Chương V, VII, VIII - Nguyễn Quang Vinh Chúng hy vọng sách tài liệu tham khảo tốt cho người làm công tác thuộc lĩnh vực Hóa sinh học lĩnh vực liên quan khác Những thiếu sót Chúng tơi mong nhận chuyên môn, người tiến tốt lần xuất giáo trình khơng thể tránh khỏi ý kiến đóng góp từ nhà sử dụng bạn đọc để cải C ác tá c g iả Chương Protein Protein hợp chất hữu phân tử lốn nhiều gốc a-L -axit amin kết hợp vói liên kết peptit Trong thể sông protein thực nhiều chức quan trọng khác như: nguyên liệu tạo nên tế bào (vai trò cấu trúc), xúc tác sinh học, vận tải, chuyển động, điều hòa, bảo vệ Các protein chia thành hai nhóm lớn: protein đơn giản vỉ* protein phức tạp Thuộc loại protein đơn giản đại phân tử thủy phân nhận axit amin Trong th àn h phần protein phức tạp, axit amin, chất khơng phải protein như: axit nucleic, sacarit, lipit, sểic tơ, ion kim loại Có khoảng 20 loại axit amin tham gia vào thành phân tử protein khác Các axit amin khác phân biệt bôi mạch bên (gốc R) chúng Tính chất protein phụ thuộc vào thành phần, trình tụi xếp gốc axit amin cấu hình khơng gian Tiùy thuộc phân tử protein có gốc axit amin nào, nhóm hóa học mà chúng biểu khác dưng dịch (về tính tan, khả tích điện), tác du ng với chât riêng biệt (thuốc thử) cho sản phẩm màu đặc trưng Các tính chất ứng dụng đẻ định tính định lượng protein 1.1 Tính châ't lưỡng tính axit amin protein Trong phân tử axit amin protein có nhóm cacboxyl nhóm am in tự nên chúng có tính chất lưỡng tính Trong dung dịch nưóc, số (0,1%) phân tử axit amin dạng khơng tích điện, phần lớn dạng lon lưởng cực Tùy thuộc vào pH mơi trường mà axit amin có tính chất axit hay bazơ Trong môi trường kiểm, axit amin cho proton (tính chất axit) trở thành anion Trong mơi trường axit, nhận proton (tính chất bazơ) trở thành cation Sơ đồ phản ứng sau: c o o _ T+ OH / a) R -C H —— ► N NHg c o o / R -C H + * ,0 NN H Anion b) / cocr R -C H \ n h + J TT+ +H — —— ► COOH / R -C H \ + nh; Cation Vì vậy, điện trường, tùy theo pH môi trường mà axit am in protein di chuyển vể anơt catơt Giá trị pH mà chúng không di chuyển vê cực gọi pH đẳng điện (pHi) Ở pH đẳng điện, dung dịch protein khơng bền, dễ dàng bị kết tủa Tính chất ứng dụng để xác định điểm đẳng điện protein đisacarit cấu tạo từ hai phân tử Ị3-D-glucozơ nốì V'6i liên kết P-1,6 -glicozit: OH CH2OH ch2 o C - H CN HO HO OH OH Disacarit Agliccn Amigdalin Dưới tác dụng enzim, amigdalin bị thủy phân thành anđehit benzoic, axit xianhiđric P- D - glucozơ CHnOH Anđehit benzoic p-D-gluco2ơ Trong enzim thủy phân am igdalin (glucosơidíiz, prunaz, oxinitridaz) khơng hoạt động, tĩomg môi trường nước nhiệt độ 35-40°C phản ứng thủy phân glicozit xảy mạnh Có thể nhận biết glicozit qua axit xianhiđric đượic giải phóng q trình thủy phân nhờ sơ' phản ửntg màu đặc trưng Nguyên liệu: Chuẩn bị dung dịch chiết đào 116 Cân 50 gam đào, thái nhỏ cho vào cốì sứ với nước, giã dập (làm nhanh để tránh bay HCN), cho vào bình cất có chứa lOOml nước, lắp máy để cất Cất r)0ml (nước cất đào) Lắc m ạnh dung dịch thu được, lọc qua giấy lọc thấm ướt nước cất Giữ dung dịch lọc lọ màu, nút kín (nên đựng đầy lọ) a) Định tính axit xianhiđric (HCN) Trong mơi trường kiềm, có ion Fe2\ F e 3*, axit xianhiđric tạo thành phức cha't feric feroxianua có màu xanh nưóc nước biển; axit xianhiđric tác dụng với axit picric môi trường kiềm, tạo thành dẫn xuất có màu đỏ Hóa chất: NaOH 10%, F e S tinh thể, FeCl3 5%, HC1 10%, íixit picric bão hòa Giấy picro - sơđê (cách chuẩn bị: xem phụ lục) Cách làm: - Phản ứng tạo thành feric feroxianua Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch chiết đào, thêm vào 2-3 giọt NaOH 10% vài h t F e S Đun sôi, cho thêm giọt dung dịch FeCl3 Nhỏ giọt HC1 để axit hóa Dung dịch chuyển thành màu xanh nước biển, để lâu kết tủa lắng xucmg đáy ông nghiệm - P hản ứng với axit picric Cho vào Ống nghiệm 2ml dung dịch chiết đào, thêm vào 2-3 giọt NaOH 10%, lắc đều, thêm giọt axit picric, lắc nhẹ, để lúc, quan sát màu Có thể tiến hành phản ứng với giấy picro - sôđê sau: lấy 2ml dung dịch chiết đào cho vào ống nghiệm, đặt mẩu giấy picro - sôđê vào miệng ống, đậy n ú t lại Để lúc quan sát chuyển màu 117 b) Định luọng HCN Nguyên tắc: Dùng A gN 03 tác dụng với HCN môi trường kiểm dựa vào lượng AgNO.) đả tác dụng, tính lượng HCN có mẫu Khi cho NH4OH vào dung dịch nưốc cất đào, HCN chuyển thành NH4CN A g N thêm vào tác dụng với N H 4CN để tạo thành muối kép bạc amoni xianua hòa tíin NH4OH: AgNOa + NH4CN = [Ag(CN)2]NH4 + NH4 NO3 Lượng A g N dư thừa dung dịch tạo thành AgCN tan NH4OH [Ag(CN)2]NH + A g N 3= NH4 NO3 + 2AgCN Nhưng có I2 (dưới dạng KI) lượng A g N thừa tạo thành Agl kết tủa màu vàng nhạt không tan NH4OH Do dùng KI làm thuốíc thử chuẩn độ dung dịch A g N 3, dung dịch vẩn đục dấu hiệu phản ứng ciã kết thúc Nguyên liệu hóa chất' Dung dịch chiết đào (xem cách chuẩn bị phần trên), NaOH 1%, NH4OH đặc, KI 20%, A g N 0, 1N (dùng dung dịch chuẩn) Cách làm: Cho 25ml dung dịch chiết đào vào bình nón dung tích 250ml, thêm 75ral nước cất 10 giọt NaOH 10%