Giáo trình Thực tập hóa sinh học - Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa - Tài liệu VNU

Bảng tóm tắt các phản ứng màu đặc trưng của axit amin và protein.. Số.[r]

NGUYỄN QUANG VINH

BÙI PHƯƠNG THUẬN - PHAN TUẤN NGHĨA

NGUYỄN QUANG VINH

BÙI PHƯƠNG THUẬN - PHAN TUẤN NGHĨA

THỰC TẬP■ ■

HÓA SINH HỌC (ỉn lần thứ 2)

Mục lục• ■

C h n g P V o te in 1

1.1 Tính chất lưỡng tính axit amin protein 2

1.2 Tính chất keo dung dịch protein 3

1.2.1 Phản ứng kết tủa thuận nghịch p ro tein 4

1.2.2 Sự biến tính p ro tein 5

1.3 Các phản ửng màu axit amin protein 9

1.3.1 Phản ứng b iu r e 9

1.3.2 Phản ứng với n inhiđ rin 11

1.3.3 Phản ứng với axit n itrơ 13

1.3.4 Phản ứng xantoprotein axit am in v ò n g 14

1.3.5 Phản ứng Pauli để phát histiđin tirozin 15

1.3.6 Phản ứng M illon đặc trưng cho tiro zin 16

1.3.7 Phản ứng Adam kievic đặc trưng cho triptophan: 17

1.3.8 Phản ứng prolin VỎ1 thuốc thử iz a t in 19

1.3.9 Phản ứng axit amin chứa lưu huỳnh (Phản ứng F o lia ) 20

1.3.10 Phản ứng Sakaguchi đặc trưng cho a c g in in 21

1.4 Định lượng axit am in protein 23

1.4.1 Xác định nitơ amin (N-amin) phương pháp chuẩn độ focm ol 23

1.4.2 Định lượng p r o te in 25

Chương Enzim » „.33

2.1 Các thí nghiệm định tín h số e n z im ;i3

2.1.1 Pepxin (peptit-peptidohidrolaz) ;Ỉ3 2.1.2 Am ilaz nước bọt ;ì4 2.1.3 U r e a z 35

2.1.4 P eroxidaz 36

2.2 Tính chất en zim ;Ỉ6 2.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính của am ilaz nước b ọ t 36•

2.2.2 Anh hưởng pH môi trường đến hoạt độ của enzim - Xác định pH thích hợp am ilaz trong nưốc bọt 'M 2.2.3 Ảnh hưởng chất kích thích chất kìm h ã m ‘59

2.2.4 Tính đặc hiệu en zira ,‘59

2.3 Xác định hoạt độ sơ"enzim 40• • • • '% ,

2.3.1 Xác định hoạt độ catalaz 40• • •

2.3.2 Xác định hoạt độ a - am ilaz theo phương pháp W o h lg em u th 42

2.3.3 Xác định hoạt độ ureaz theo phương pháp chuẩn độ 43

2.3.4 Xác định hoạt độ proteinaz theo phương pháp Anson cải tiế n 45

2.3.5 Xác định hoạt độ lip a z 47

Chương S a c a r it 48

3.1 Các phản ứng định t ín h 49

3.1.1 Các phản ứng mono - đ isa c a rit 49

3.1.2 Phản ứng định tính polisacarit 58

3.2 Định lượng s a c a n t 61

3.2.1 Định lượng đường khử theo phương pháp B ertran d 62

3.2.2 Định lượng tinh b ộ t 64

C h n g A x it n u c l e i c 66

4.1 Các tính chât lí - hố axit n u c le ic 66

4.1.1 Tính tan axit n u c le ic 66

4.1.2 Các phản ứng màu axit n u c le ic 67

4.2 Đ ịnh lượng axit nucleic 70

4.2.1 Định lượng A D N 70

4.2.2 Định lượng A R N 72

('h n g L ip it 74

5.1 Mỡ trung tính (tn a x y lg lix erin ) 74

5.1.1 Tính chất lý hố m ỡ 74

5.1.2 Phản ứng phân biệt thành phần cấu tạo của mở 75

5.1.3 Xác định sô mỡ 78

5.2 L ip it 81

5.2.1 Tách lơxitin từ lòng đỏ tr ứ n g 82

5.2.2 Một sơ" tính chất lơ x itin 82

5.3 Đ ịnh lượng L ipit 83

C h n g V it a m in 86

6.1 Các phản ứng định tính v ita m in 86

6.1.1 Các vitam in hòa tan chất b é o 86

6.1.2 Các vitam in hòa tan n c 90

6.2.2 Định lượng vitam in A 97

Chương H ocm on 99

7.1 Hocmon động v ậ t 100

ĩ.l.l.H o c m o n ster o it 100

7.1.2 Hocmon peptit p r o te in 102

7.1.3 Hocmon dẫn xuất axit a m in 103

7.2 Hocmon thực v ậ t 106

7.2.1 Các hocmon dẫn xuất indol 106

7.2.2 G iberelin 109

Chương Các chất thực vật thứ sin h 113

8.1 G licozit 113

8.1.1 Định tính glicozit acbutin trúc đ o 114

8.1.2 Glicozit đào (Prunus persica L B atsch) 115

8.2 A n k a lo it 119

8.2.1 Một sơ" phản ứng định tín h 119

8.2.2 Định lượng a n k a lo it 120

8.3 Các hợp chất p h en ol 122

Phu lu c 126• •

1 Một sơ" chất thị màu để đo p H 126

2 Chuẩn bị dung dịch Folin (để xác định p rotein ) 127

3 Chuẩn bị giấy Picrô - s ô đ ê 127

4 B ảng chuyển đổi lượng đồng thành lượng đường (mg) theo phương pháp B ec tr a n d 128

Lời nói đầu

Giáo trình "Thực tập hóa sinh học” biên soạn để dùng làm tài liệu thực hành chương trình uHóa sinh học đại cươrg” bậc đại học Mục đích thí nghiệm tron* KĨáo trình minh họa củng phần kiến thức lý th m ết sinh viên học Ngồi ra, giáo trình củng cịn nhằm giúp sinh viên làm quen với sô phương pháp định lượng thường dùng phịng thí nghiệm Hóa sinh.

Trên sở giáo trình "Thực tập hóa sinh học” tập thể các cán 3Ộ giảng dạy Bộ mơn Hóa Sinh, Khoa Sinh học, trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay trường Đại học Khoa học Tự nhiên) biên soạn trước qua thực tế sử dụng vối kinh nghiệm hướng dẫn thực tập điều kiện phịng th í nghiệm hiện tại, chọn lọc biên soạn lại giáo trình, có sửa đổi 'à bơ sung sơ phần như: hocmon, chất thực vật thứ sinh nhằm đáp ứng yêu cầu đào tạo nay.

Phương Thuận; Chương IV, VI - Phan Tuấn Nghĩa; Chương V, VII, VIII - N guyễn Quang Vinh.

Chúng hy vọng sách tài liệu tham khảo tốt cho người làm cơng tác thuộc lĩnh vực Hóa sinh học lĩnh vực liên quan khác.

Những thiếu sót giáo trình khơng thể tránh khỏi. Chúng tơi mong nhận ý kiến đóng góp từ nhà chuyên môn, người sử dụng bạn đọc để có th ể cải tiến tốt lần xuất tiếp theo.

Chương 1

Protein

Protein hợp chất hữu phân tử lốn nhiều gốc a -L -a x it am in kết hợp vói liên kết peptit.

Trong thể sông protein thực nhiều chức quan trọn g khác như: ngun liệu tạo nên tế bào (vai trị cấu trúc), xúc tác sinh học, vận tải, chuyển động, điều hòa, bảo vệ

Các protein chia thành hai nhóm lớn: protein đơn giản vỉ* protein phức tạp Thuộc loại protein đơn giản đại ph ân tử thủy phân nhận axit amin Trong th n h phần protein phức tạp, ngồi axit amin, cịn cơ chất protein như: axit nucleic, sacarit, lipit, sểic tô, ion kim loại

Có khoảng 20 loại axit amin tham gia vào thành phân tử củ a protein khác Các axit amin khác phân biệt bôi mạch bên (gốc R) chúng.

phẩm màu đặc trưng Các tính chất ứng dụng đẻ định tính định lượng protein.

1.1 Tính châ't lưỡng tính axit amin protein

Trong phân tử axit am in protein có nhóm cacboxyl nhóm am in tự nên chúng có tính chất lưỡng tính. Trong dung dịch nưóc, số (0,1%) phân tử axit amin dạng khơng tích điện, cịn phần lớn ở dạng lon lưởng cực. Tùy thuộc vào pH mơi trường mà axit am in có tính chất của một axit hay m ột bazơ Trong môi trường kiểm, axit amin cho proton (tính chất axit) trở thành anion Trong mơi trường axit, nh ận proton (tính chất bazơ) và trở thành cation Sơ đồ phản ứng sau:

c o o _ T- c o o

/ + O H /

a) R - C H —— ► R - C H + * ,0

N N H g NN H 2

Anion

c o c r TT+ COOH

/ + H /

b) R - C H — —— ► R - C H

\ + \ +

n h J n h ;

Cation

Xác định điểm đẳng điện cazein

Hỏa chất: Axit axetic (CHịCOOH) 0,1 N; dung dịch cazein 0,4% natri axetat (CH^COONa) 0,1 N.

Cách Làm: Lấy ông nghiệm khỏ Đánh sô thứ tự từ [ (tên V Cho vào ông lượng axit axetic nước cất như tiược ghi bảng, lắc Sau cho vào ống lm l cluiig dịnh cazein 0,4% natri axetat 0,1 N Sau hòa lẫn dung dịch ơng có pH xác định. Quan sát ta thấy sỏ ông dung dịch vẩn đục, đê lúc kết tủa lang xuống đáy n g có nhiều kết tủa nghĩa pH ở tương ứng với điểm đẳng điện cua.cazein Ghi mức độ kết tảa ỏ ông dâu +.

sci TT ống nghiệm

Số ml CH3COOH

0,1 N

Sỏ ml nước

Sỏ ml cazein 0,4% CH3COONa 0,1 N

pH Mức độ kết tủa

1 0,1 8,9 1,0 5,6

2 0,2 8,8 1.0 5,3

3 1,0 ị 8,0 1,0 4,7

4 4,0 5,0 1,0 4,1

5 8,0 1,0 1,0 3,8

1.2 Tính chất keo dung dịch protein

ngăn chặn kết dính phân tử keo Các yếu tố vật lý, hóa học có khả tác dụng lên màng nước làm ảnh hưởng đến trạng thái tích điện phân tử keo làm ảnh hưởng đến tính tan protein, làm chúng bị k ết tủa.

Sự kêt tủa thuận nghịch hay khơng thuận nghịch Người ta thường dùng phương pháp kết tủa thuận nghịch để tách protein enzim dạng tinh thể dạng bột.

1.2.1 Phản ứng kết tủa thuận nghịch protein

Các dung môi hữu (etanol, axeton) nh iệt độ thấp (0° - 4°C), muối kim loại kiềm kiềm thổ (thường dùng là (N H 4)2S 4, N a2S 4, NaCl, M g S 4) có tác dụng gây kết tủa thuận nghịch protein Sau loại bỏ nhanh yếu tô' gây kết tủa, protein trở trạng thái dung dịch Ịseo bển.

a) Kết tủa muối trung tính

Các muối vừa làm trung hịa điện (do ion tác dụng tương hỗ vối nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lỏp vỏ hiđrat phần tử keo Các protein khác có th ể bị kết tủa vỏi nồng độ muối khác nhau, dùng muối để tách riêng protein khỏi hỗn hợp chúng Ví dụ, dùng muối (N H 4)2S có độ bão hịa khác để tách riêng anbum in và

globulin lịng trắng trứng.

Ngun liệu hóa chất: Lịng trắng trứng khơng pha lỗng, (NH4)2S bão hòa, NaCl bão hòa, tinh (N H 4)2S 4.

Cách làm: Cho vào nghiệm 5ml lòng trắng trứng, 5ml dung dịch (N H 4)2S bão hòa, lắc đểu, xuất kết tủa globulin Để phút, lọc (thấm ướt trước giây lọc dung dịch (N H 4)2S 4).

Cho vào dịch lọc 3g tinh thể (N H 4)2S (nếu dịch lọc là 4ml), lắc, anbum in kết tủa, lọc, thu lấy kết tủa Cho riêng kết tủa globulin anbumin vào ông nghiệm tương ứng, thom vào ông khoảng 2-3ml nước cất, lắc, quan sát, so sánh Hự hoa tan kết tủa.

b) Kết tủa bàng dung môi hữu cơ

Nếu tiến hành kết tủa protein nhiệt độ thấp (0°- 4°C) và ]ấy kêt tủa nhanh khỏi dung mơi, protein khơng bị biến tính (có thể hịa tan lại) Nếu nhiệt độ cao (20-30°C) kết tủa bị ịậũ lâu dung môi hữu cơ, protein bị biến tính.

Ngun liệu hóa chất: Dung dịch lòng trắng trứng 1%, tftanol 96%, axe ton, NaCl bão hịa.

Cách làm: Lấy ơng nghiệm , cho vào ống lm l dung (lịch lòng trắng trứng 1%, làm lạnh nước đá Thêm vào ỏng I: 2m l etanol 96% lạnh, ống II: 2ml axeton lạnh, quan sát; cho them vào hai ống vài giọt dung dịch NaCl bão hịa, kết tủa lắng xng đáy ống nhanh Sau kết tủa lắng xuống đáy ống, gạn bỏ lớp dung môi, thêm nước vào, lắc đểu, kết tủa tan.

Làm lại th í nghiệm ỏ nhiệt độ 20°- 30°c, quan sát so sánh với th í nghiệm trên.

1.2.2 Sự biến tính protein

mơi trường kiềm mạnh axit mạnh), phân tử protein ỏdạing tích điện nên không bị đông tụ lại mà dạng hịa tan :rong dung dịch Tuy nhiên, dùng mi trung tính để trung h ịa điện, protein bị đơng tụ thành kết tủa.

Các yếu tơ' có thê gây biến tính protein nhiệt độ cao, atxit vô đặc, sô" axit hữu cơ, kiểm đặc, muối kim loại nậtng nồng độ cao Một sô chất khác ure, gưanidin có tác dụ ng phá hủy liên kết hiđro, phá hủy cấu trúc bậc 2, 3, 4 của phân tử protein.

a) Tác dụng nhiệt độ cao

Ngun liệu hóa chất: Dung dịch lịng trắng trứng 5% (đã lọc qua giấy lọc nhiều lần), axit axetic 1% 10%, NaOH 10%, NaCl bão hòa.

Cách làm: Cho vào ông nghiệm , ông 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5%.

Đ un ống I theo dõi kết tủa protein.

Thêm vào II: giọt axit axetic 1% đun Kể: ttủa protein hình thành nhanh nhiều hơn.

Thêm vào ống III: 0,5m l axit axetic 10% ống IV: 0,5>ml NaOH 10% Đun, quan sát thấy kết tủa protein khơng hìtnh thành đun sôi.

Thêm vào ông V: 0,5m l axit axetic 10% 3-4 giọt MaiCl bão hòa Đun, protein kết tủa nhanh nhiều.

So sánh giải thích khác biệt vê mức độ kết tủa ,rc>ng các Ống.

b) Kết tủa protein axit vô đặc

(lo gây kết tủa protein Nếu kéo dài thời gian tác dụng, kết tủa bị hòa tan Với axit nitric kêt tủa bị hòa tan chậm.

Nguyên liệu hóa chất’. Dung dịch lòng trắng trứng 5%, H N đặc.

Cách làm: Cho vào ống nghiệm ml HNO3 đặc, sau cầm nghiêng ơng, giỏ cẩn thận theo thành ông 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5% Ở m ặt tiếp xúc hai chất lỏng tạo thành kết tua protein.

c) Két tủa protein bàng axit hủỉ1 cơ

Khi cho axit tricloaxetic hay axit sunfosalisilic vào dung dịch protein protein kết tủa Phản ứng ứng dụng rộng rãi thực tế: người ta thường dùng axit tricloaxetic để phát để loại protein khỏi dung dịch, dùng axit sunfosalisilic để phát protein nước giải (phản ứng có độ nhạy đến 0,0015%).

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch lòng trắng trứng 5%, axit sunfosalisilic, axit tricloaxetic (TCA) 10%.

Cách làm: Cho vào ông nghiệm lm l dung dịch lòng trắng trứng 5%, thêm 5-10 giọt dung cỉịch axit sunfosalisilic hay axit tricloaxetic 10% Xuất kết tủa protein.

d) Kết tủa protein bàng muôi kim loại nặng

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch lịng trắng trứng 5°At FeCl3 5%, chì a x eta t Ị(CH3COO)2Pb] 5%, CuSO, 7%.

Cấch làm: Lấy ông nghiệm, cho vào ông 2ml d i n g dịch lòng trắng trứng 5%.

Thêm vào ống I: 1 giọt dung dịch FeCl3 5% ơng II: giọt chì axetat 5%

ống III: giọt C u S 7%

Quan sát kỹ Sau cho thêm lượng muối kim loại rụn g tương ứng vào từ ng ống, kết tủa tan lượng dung dịc h muối chì đồng phải thêm vào để làm tan kết tủa lớn Iơ'n lượng dung dịch FeC l3 nhiều.

e) Kêi tủa bàng thuốc thửankaloit

Protein ankaloit có nhóm - N H nên phầnlớ^n các thuốc thử ank aloit có tác dụng kết tủa pro.ei n (trong mơi trường axit).

Ngun liệu hóa chất: Dung dịch lịng trắng trứng õ°/o, axit picric 10%, dung dịch tanin bão hòa, axit axetic 1%, 10%; kali feroxianua [K4Fe(C N )6 ] 5%.

Cách làm: Cho vào ông nghiệm ống lm l dung <tịc‘h lòng trắng trứng 5%.

Thêm vào ống I: - giọt dung dịch axit picric 10% i - 3 giọt axit axetic 1%: xuất kết tủa chuyên thành nàiu vàng.

Thêm vào ống II: - giọt dung dịch tanin bão hòa và‘ i - 4 giọt axit axetic 1%: xuất kết tủa màu xám (Tanin CxỉỢc dùng để kết tủa protein công nghiệp thuộc da).

Bảng tóm tắt phản ứng kết tủa protein

TT Tên nhòm chát

làm kết tủa protein Hóa chất

Màu

kết tủa Ghi

1 Dung môi hữu

2 Axit vỏ Axit hữu

4 Muối kinj loai nặng Thuốc thửankaloit

1.3 Các phản ứng màu axit amỉn protein

1.3.1 Phản ứng biure

Dây phản ứng đặc trưng liên kết peptit Trong môi trường kiềm, hợp chất có chứa từ hai liên kết peptit trở lên có th ể phản ứng với C u S tạo thành phức chất m àu xanh tím, tím , tím đỏ màu tùy thuộc vào sơ lượng liên kết peptit nhiêu hay Hóa thức phản ứng sau:

- Phản ứng với bíu re

H H

dun I I

2 H ,N - C - N H ,— ► H , N - C - N - C - N H , i = ^ H N = C - N - C = N H

II v h Ạ II II I I

0 3Ĩ 0 0 OH OH

Ưre Biure (xeto) Biure (enol)

- Phản ứng với protein

H T

2HN = C - N - C = N H + Cu(OH)., + N a O H ►

I I

OH OH

ONa ONa

I I

C = N H HN = C v

/ V ' ' \

— ► HN 0 - C u - Ọ NH

n C = N H N H = C /

D ạng phức hợp (với bốn nguyên tử nitơ tham gia tạo liên kết phối trí) thường có màu đỏ (hấp thụ cực đại hước sóng 520- 535nm) Trong trường hdp có hai hay ba nguyỏn tử N tham gia tạo liên kết phức có màu tím màu xanh (hấp thụ cực đại bước sóng tương ứng 540-580nm 615- 670nm ) Vì vậy, thịng thường sản phẩm phản ứng polipeptit khác có màu thay đổi từ xanh tím đến đỏ tím Phản ứng biure thường ứng dụng để định lượng protein.

Ngun liệu hóa chất: Dung dịch lịng trắng trứng 1%, ure tinh thể, NaOH 10%, C u S 1%.

Cách làm:

- Phản ứng với biure: Cho vào ống nghiệm khơ tinh thể ure, đun lửa yếu Lúc đầu ure nóng chảy, đến khi

bắt đầu cứng lại ngừng đun Quá trình tạo biure, axit xianuric amoniac (có th ể ngửi mùi thử giấy qùy).

Để ống nguội, thêm vào 2ml NaOH 10%, lắc cho tan Thêm vài giọt C u S 1%, quan sát màu (Chú ý không cho nhiều C u S màu xanh Cu(OH)2 tạo thành có thê lấn át màu phản ứng).

- Phản ứng với protein: Cho vào ống nghiệm 3ml dung dịch lòng tráng trứng 1%, lm l NaOH 10% 1-2 giọt dung dịch

c 11 SO4 1%, lắc kỹ, quan sát màu.

1.3.2 Phản ứng với ninhiđrin

Các axit amin phản ứng với ninhiđrin ỏ nhiệt độ cao cho sản phẩm có màu xanh tím (hấp thụ cực đại ỏ khoảng bước sóng 570nm) Đây phản ứng chung cho tất axit amin có chứa nhóm amin vị trí Ca Ngồi a-axit amin, peptit, protein, muối amôn, am inosacarit amoniac cho phản Ung Cơ chê phản úng phức tạp sau:

Đầu tiên tác dụng axit amin VỚI ninhiđnn sẽ xuất hiộn phức chất dạng bazơ -schiff Sau xẩy chuyển nhóm, đề cacboxyl hóa phân tách phức chất thành anđehit aminođixetohiđrinden:

o o

0

Am inođixetohiđrinden lại ngưng tụ vối phân tử ninhiđrin khác hình thành nên hợp chất mới, đồng thời bị enol hóa chuyển thành dạng có màu.

o

Nmhi drill

R

A x it ain in

o R Bazơ-schiff

o

o o

H

N = CHR

+11,0

-> R —c = o +

o H

0 0 0 0 (phức màu xaih tím) Khi có dung môi hữu (axeton, etanol, piriđin thường dùng để pha ninhiđrin) xẩy phản ứng sau:

ở k - C H - C - R * o - ỏ o

0 0

•h20

0 CH 0 a CH

I

R

(phức có màu)

Sản phẩm phản ứng có chứa gốc R axit amin ban đầu Gốc định màu sắc khác [xanh da tròi, đỏ ) hợp chất phản ứng với ninhiđrin.

Đặc biệt phức chất tạo thành prolin (có chứa nhóm imin) ninhiđrin có màu vàng tươi, khác biệt hẳn với màu axit amin khác tạo nên phản ứng Do vậy, ninhiđrin sử dụng cho phản ứng màu đặc :rưng đê phát prolin:

N^ ~ ~ | + C0 + H20

Phản ứng với ninhiđrin có độ nhạy cao, thường dược dùng để định tính định lượng axit amin.

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch lòng trắng trứng 1%, prolin 1%, dung dịch ninhiđrin 0,1% pha axeton 95%.

Cách làm: Lấy hai ống nghiệm, cho vào Ống I: lm l dung dịch lòng trắng trứng 1%, ỏng II: nil prolin 1%; thêm vào mỗi ông lm l dung dịch ninhiđrin, đun sôi 1-2 phút Quan sát màu hai ơng, giải thích kết nhận được.

Có thể làm phản ứng giấy lọc sau: nhỏ giọt dung dịch axit am in protein (lòng trắng trứng 1%) lên giấy, cho thêm giọt thuốc thử ninhiđrin, hơ nhẹ lửa đèn cồn. Quan sát màu tạo thành.

1.3.3 Phản úng với axit nitrơ

Dưới tác dụng HNOo, axit amin bị dezamin hóa tạo thành nitơ dạng khí Phản ứng sử dụng để định lượng a- axit amin (phương pháp Van Slyke).

Phản ứng xảy sau:

COOH COOH

I _ ~ I

H2N — CH + = N - H -► HO — CH + N 2t + H 20

R R

1.3.4 Phản ứng xantoprotein axit amin vòng

Các axit amin vòng phenylalanin, tirozin, triptophan khi tác dụng với H N đặc tạo thành dẫn xuất nitrơ màu vàng. Khi thêm dung dịch kiềm vào tạo thành mi có cấu tạo kinoic màu da cam Các protein không chứa axit amin vịng (gelatin) khơng cho phản ứng này.

Hóa thức phản ứng với tirozin sau:

OH

+ H ,0

CHo—CH — COOH CH.2- C H - C O O H

J I

NH2 n h 2

OH

N

ONH. o

+ HoO

c h 2- c h - c o o h I

NH,

CH 2— C H — COOH I

NH„

2

muối amôn nitrotirozin (màu da cam)

Nguyên liệu hóa chất: D ung dịch lòng trắng trứng 1%), dung dịch gelatin 1%, H N đặc, N H 4OH đặc

nghiệm lm l H N đặc Đun sôi hỗn hợp phản ứng phút, làm nguội Thêm từ từ vài giọt am oniac đặc Quan sát sự chuyên màu ông nghiệm.

1 3.5 Phản ứng Pauli đẻ phát histiđin tirozin

Khi tác dụng với axit diazobenzensunfonic (thuốc thử cha/.o), histiđin tạo thành phức chất màu mận chín, cịn tirozin tạo phức màu da cam.

Hóa thức phản ứng sau:

+ Sự tạo thành axit tliazobenzensunfonic: o

s = + NaNOo + HC1 I

OH

0 'I

► N = N 5 = + NaCl + H ,0 o

+ Phản ứng histiđin:

N H

I

0

N = N + N a 2C 03

NH, I

N -r C H o -C H -C O O H o

II I 2 V M

I ỎNa

s = + H jC O -j

ONa

+ Phản ứng tirozin:

+

c h 2- c h - c o o h

ọ » o = s

I

0 o

-N = -N + -Na2CO.,

NH.

o OH 0

0 = S - < ^ ^ ) - N = N -Ị<^XỊ p N = N - ^ ỵ — S = o + H2C 03

ỚNa ỚNa

C H o-C H -C O O H I

n h 2 (màu da cam)

Hóa chất: D ung dịch histiđin tirozin chuẩn (0,1%), N a2C 10% C huẩn bị thuốc thử Pauli: hòa tan lg a x it sunfanilic 100ml HC1 N, sau trộn với 10ml dung dịch nitrit natri 0,7% nưốc cất.

Cách làm: N hỏ dung dịch histiđin tirozin lên giấy lọc, hơ nhẹ cho khơ, sau phun thuốc thử Pauli lên, làm khô giấy. Cuối phun lên giấy dung dịch N a2C 10% Quan sát, so sánh giải thích kết nhận được.

1.3.6 Phản ứng Millon đặc trưng cho tirozin

Thuổc thử M illon hỗn hợp muối nitrat nitrit -oxit thủy ngân hòa tan H N Khi thuốc thử tác dụng với nhân phenol tirozin tạo nên hợp chất nitrotirozin - thủy ngân có màu đỏ Hóa thức phản ứng như sau:

OH o OHg

0 + H 20 + UNO., + HgNOj

CH., — CH — COOH

2

Phản ứng Millon sử dụng để phát tirozin các

họp c h ấ t phenol

Nguyên liệu hóa chất Dung dịch lòng trắng trứng 1%, gelatin 1% Chuẩn bị thuốc thử Millon: Hòa tan 40g thủy ngân tr-ong 57ml H N 03 đặc Quá tr ìn h tiế n h n h đ ầ u tiê n ỏ điều

kiện lạnh, sau ỏ nồi cách thủy (50°C) thủy

n g â n t a n hoàn toàn Dung dịch dược p h a lỗng gấp đơi b ằ n g

nước cất, thêm lml KNOvhoặc NaNO? 1% Khuấy đều, để lắng, gạn lấy dịch Chú ý thuốc thử Millon để lâu bị oxi hoá.

Cách làm: Lấy hai ống nghiệm Cho vào I: lml lòng trắng trứng 1%, ông II: lml gelatin 1%. Thêm vào ống lml

(hoặc giọt) thuôc thử Millon, lắc đều, đ u n n h ẹ

xuất màu ông I So sánh kết hai ơng,

g iải thích

Chú ý khơng cho q nhiều thuốc thử Millon HNO3 có trong thuốc thử tác dụng vói protein cho màu vàng.

1.3.7 Phản úmg Adamkievic đặc trưng cho triptophan

T ro n g môi trường axit, trip to p h a n p h ả n ứ n g với n h iều loại a n d e h i t tạo th n h sản p h ẩ m n g n g k ế t có m u đỏ tím đ ặ c trư n g

H óa th ứ c phản ứng n h sau:

ĐAI H Ọ C Q U Ồ C GIA HÀ NỘI

_ " °

H O O C — cT + h , s o4 n h

/ /o

A xit glioxilic COOH H2N - C H

NH

T rip to p h a n

+► H - C v + CO., H

Foocm aldehit COOH

I

H C -N H o

+ H2S 04

T rip to p h an

COOH COOH

COOH

I

H.,N—CH

I

B is-2 -trip to p h an y lm e ta n

COOH COOH COOH

I I I

H C - N H H2N - C H

CH NH I

OH

Bis-2-triptophanylcacbinoI

Cách làm:

o II

- Phản ứng với cixit glioxilic ( HOOC - c - H )

Lấy 2 ông nghiệm, cho vào ơng nghiệm I: lml dung dịch lịng trắng trửng 1%, ông II: lml gelatin 1%, thêm vào ống lml axit axetic đặc (có chứa axit glioxilic dạng vệt), lắc đểu (có

t h ể đ u n n ó n g đ ế n k h i t a n , s a u đ ê n g u ộ i ) , t h ê m v i g i ọ t

CuS04, lại lắc Cầm nghiêng cmg nghiệm, giỏ theo thành ông 1 ml HoSOj, cho chảy xuống từ từ Quan sát xuất vịng tím mật phân cách hai chất lỏng ở ống I Giải thích sai khác 2 ơYig.

- Phấn ứng VỚI oximetilfucfurol (được h ình thành do

sacarozơ bị thủy phân nước tác dụng của H:S đặc).

Cho vào ỏng nghiệm 2ml dung dịch lòng trắng trứng 1%, thêm vài giọt sacarozd 1% CuS04 5%, lắc Nhỏ theo thành ống lml H2S 04 đặc Quan sát hình thành sản phẩm có màu.

- Phản ứng với focmandehit

Cho vào ông nghiệm 2ml dung dịch lòng trắng trứng 1%, thêm vài giọt focmandehit lỗng CuS04 5%, lắc Nhỏ theo thành ơng lml H2S 04 đặc Quan sát hình thành sản phẩm có màu CuSO.t có tác dụng làm tăng độ nhạy phản ứng.

1.3.8 Phản úmg prolin vói thuốc thử izatin

o r w o

V ^ N H NH

COOH + 0

+ C02 + 2H 0

Hóa chât: Dung dịch prolin oxiprolin 0,1% pha axil axetic đặc Chuẩn bị thuốc thử izatin gồm hỗn hợp dung dịch izatin 0,2%, CdCl2 0,06% axit axetic 4% axeton. Cũng chuẩn bị cách đơn giản cách pha dung dịch izatin 0,2 % axit axetic đặc.

Cách làm: Chấm dung dịch prolin lên giấy lọc Hơ nhẹ cho tới khơ Sau phun thuốíc thử izatin lên giấy, sấy nhẹ, thấy xuất màu xanh lơ đậm Nếu chấm oxiprolin ra màu xanh nhat.

1.3.9 Phản ứng axit amin chứa lưu huỳnh (Phản ứng Folia)

Các axit amin chứa lưu huỳnh xistin, xistein, metionin dưới tác dụng kiềm bị phân hủy tạo thành natri sunfua (Na.,S):

RSH + 2NảOH -> Na2S + ROH + H20

Thêm chì axetat vào Na2S phản ứng tạo thành kêt tủa nâu đen chì sunfua (PbS):

Na2S + Pb(CH3COO)2 = 2(CH3COO)Na + P bSi

(kết tủa nâu đen)

Cách làm: Cho vào ông nghiệm 2ml dung dịch lòng trắng trứng 1% 2ml NaOH 10% Đun sôi phút Lắc đểu Thêm vài giọt Pb(CH3COO)2 1% Quan sát tạo thành kêt tủa.

1.3.10 Phản ứng Sakaguchi đặc trưng cho acginin

Đâv phản ứng phát acginin: tác dụng vối hipobromit (NaBrO) a-naphtol, acginin tạo thành sản phẩm màu đỏ cam Hóa thức phản ứng trình bày sau:

NHL I

Ộ = NH I

NH Ị

( C H 2 ),3

CHNHo COOH

NH,

ì

ộ I

*^H + N2 + NaBr + H20 CH,)

CHNHo

ĩ

COOH

Hóa chất: Acginin 0,01%, a- naphtol 2% pha etanol 96;% (trước dùng pha loãng 10 lần loại dung mơi), NíaOH 5% 10%, ure 40%.

Chuẩn bị dung dịch hipobromit (NaBrO): hòa tan lg brom (Br2) 50ml NaOH 5% (phản ứng toả nhiệt nên cần được làm lạnh nước đá) Bảo quản thuốc thử tủ lạnh Thời

Cách làm: Cho vào ống nghiệm 2ml acginin, thêm 2ml NaOH 10% vài giọt a- naphtol, lắc đểu, thêm 0,5ml dun& dịch hipobromit, lại lắc, thêm lml ure 40% để cô định màu Quan sát, giải thích kết quả.

Bảng tóm tắt phản ứng màu đặc trưng axit amin protein

Số

TT Phản ứng Hóa chất chính Đối tượng phát hiện

Sản phẩm màu

1 Biure

Đổng suníat trong mơi trường kiềm

Liên kết peptit (- CO - NH -)

Xanh tím- đỏ

tím

2 Ninhiđrin Ninhiđrin Các axit amin, proỉin

Xanh tím, vàng

3 Axit nitrơ h n o2 Các axit amin Bọt khí N? bay ra

4 Xanto-protein

Axit nitric, sau cho thêm kiềm

Triptophan, tirozin, phenylalanin

Vàng,chuyển thành da cam

5 Pauli • Axit diazobenzen-sunfonic Histiđin, Tirozin

Mận chín.

Da cam

6 Millon

Thủy ngân nitrat và nỉtrit trong

H N đặc

Tirozin Đỏ

7

Adam-kievic

Axit axetic đặc,

H2S đặc,

focm andehit

Triptophan Vịng đỏ tím

8 Izatin Izatin Proỉin

Oxiprolin

Xanh ìơđậm Xanh nhạt

9 Folia Kiềm, chì

axetat

Xistein, xỉstỉn,

metionin Tủa nâu đen

10

Saka-guchi

Naỉri hipobromit,

a-naphtol

1.4 Định lượng axit amin protein

1.4.1 X c định nitơ am in (N -am in)

bằng phương pháp chuẩn độ focmol

Nguyên tắc: Các axit amin phản ứng với focmol trung tính đê tạo thành metyl - axit amin Focmol bao vảy nhóm amin mang tính kiềm nên chuẩn độ nhóm cacboxyl trong phân tử axit amin kiềm Dựa vào lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ sẻ tính lượng nitơ axit amin Hóa thức phản ứng biểu diễn sau.

NH, H N = CHn

I I I

R -C H + C = - ► R- CH + HọO

I I I

COOH H COOH

Axit amin Focmol Metyl-axit amin

Nguyên liệu hóa chất: Dịch mẫu có chứa axit amin cần xác định, NaOH 0,1N , H2S 04 0,1N.

Chuẩn bị hỗn hợp focmol: trộn 0ml focmol vối 2ml dung ilịch phenolphtalein 0,5% pha etanol, dùng NaOH 0,1N đế trung hịa đến có màu hồng nhạt (chỉ chuẩn bị trước dùng).

Dụng cụ: Bình nón (V= lOOml), buret.

Cách làm: Lấy 2 bình nón, bình I dùng làm bình thí nghiệm, bình II dùng làm bình kiểm tra.

Cho vào bình I: 10ml nước cất vơ dạm, thêm vào 5ml (lung dịch hỗn hợp focmol 5ml dung dịch NaOH 0,1N Sau đó, dùng H2S040,1N để điều chỉnh màu bình khi chỉ màu hồng nhạt, thêm 2 giọt NaOH 0,1N, màu đỏ tươi xuất hiện, ứng với pH = 8,8.

màu đỏ tươi (màu cần đậm màu bình kiểm tra) Dùng H<>S04 0,1N để điều chỉnh màu dịch bình đến hồng nhạt, sau thêm vài giọt NaOH 0,1N đế có màu đỏ tươi, tương đương với màu ỏ bình kiểm tra (pH = 8,8).

Thêm vào bình I: giọt NaOH 0,1N, xuất màu đỏ tươi ứng với pH = 9,1.

Thêm vào bình II: vài giọt NaOH 0,1N xuất hiện màu đỏ tươi giơng bình I (pH = 9,1).

Tính kết quả: Cộng tồn lượng kiểm axit cho vào mỗi bình trình thí nghiệm kết tính theo cơng thức sau:

X T „,x _ [('VI - Vi) - (v2 - v )] 1,4,100 N (mg%) = - - -

-a trong đó:

Vj - Tổng lượng kiềm dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm (I). Vi - Tổng lượng axit dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm (I). V2 - Tổng lượng kiểm dùng để chuẩn độ bình kiểm tra (II) v2 - Tổng lượng axit dùng để chuẩn độ bình kiểm tra (II) a - Lượng mẫu (g) ứng với 10ml dịch mẫu dùng để xác định N

(V, - v ,)k 1,4.100

X(mg %) = i-I -l i — -a

trong đó:

X- mg nitơ amin mẫu thí nghiệm (tính theo %)

Vj - sô' nil NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm (I).

V2 - sô ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra (II)

k - hệ sô" diều chỉnh dung dịch NaOH 0,1N. 1,4 - 1 ml NaOH 0,1N ứng với l,4mg nitơ.

a - Lượng mẫu (g) ứng với 10ml dịch mẫu dùng để xác định N.

1.4.2 í)ịnh lương protein

Hlàm lượng protein xãc định phương pháp khác nhau, vậy, phương pháp hoá lý phổ biến hcin cảt.

D»ựa vào hấp thụ phô ánh sáng vùng tử ngoại (278 -280 nm) sô" axit amin chứa nhân thơm có protein như Iiriptophan, tirozin phenylalanin, ngưịi ta định lượng protein phép đo hấp thụ quang phổ.

C ó thể định lượng protein phương pháp Kjeldahl trên cơ sỏ xác định hàm lượng nitơ protein (thường chiếm khoảng 16% tìrong protein khác nhau) Nhân giá trị nitơ xác định được v/ói hệ sơ" 6,25 (100 : 16) hàm lượng protein tổng số.

Các protein thực vật có tỷ lệ nitơ lớn hơn, khoảng 16,8%, vậy trong ttrường hợp hệ sô nhân 5,95.

sau cho protein phản ứng vỏi sô thuốc thử đặc trưng. Sau giới thiệu sô" phương pháp xác định protein thông dụng nay.

a) Định lượng protein bàng phương pháp Kjeldahl

Phương pháp dựa sở định lượng nitơ protein, từ đó tính lượng protein cách nhân với hệ số tương ứng:, ỉ)ê định lượng nitơ protein ta thường xác định nitơ tổng sô' và nitơ phi protein theo phương pháp Kjeldahl, sau lấy hiệu sô giữa hai dạng nitơ này.

Xác định nitơ tổng sô theo phương pháp Kjeldahl (N tông sò) Nguyên tắc: Dưới tác dụng H2S04 đặc nhiệt độ cao, các hợp chất hữu có chứa nitơ (N) bị phân hủy bị oxi hóa đến C02 nưốc, nitơ chuyển thành amoniac tiếp tục kêt hợp với H2S 04 tạo thành muon amoni sunfat.

Quá trình tiến hành theo bước sau: - Vơ hóa ngun liệu:

r - c h n h 2 - C O O H + h 2s o 4 - » c o 2 + h 20 + ( N H 4)2s o 4

- Cất đạm:

(NH 4)2S 04 + 2NaOH = Na2S 04 + 2NH3Í+ 2H20 Phản ứng xảy bình hứng:

NH3 + H2S 04 -+ (NH4)2S 04 + H2S04 dư (ở bình hứng) - Chuẩn độ H2S 04 dư bình hứng NaOH có nồng độ 0,1N.

Cách làm:

- Vị hóa mẫu: Cân 0 ,2g protein cho vào bình Kjeldahl. Thêm vào bình 5-lOml H2S 04 đặc Đậy bình nút bơng

hoặc phễu thủy tinh nhỏ Đun bình Kjeldahl bếp điện hay bọp đầu hỏa, lúc đầu đun nhẹ đến thấy S02 bay ra, có thê đun mạnh hơn, sau sơi 30 phút, nhấc bình khỏi bếp, để nguội, thêm giọt H202 30% HC104 57% (chất xúc tác), tiếp tục đun 20 phút Nếu dịch bình chưa trắng cần thêm một lần xúc tâc đun tiếp dịch trắng hoàn toàn Quá trình vơ hóa kết thúc.

* Cất đạm: Quá trình cất đạm tiến hành máy cất

Kjeldahl Chuyển tồn dịch vơ hóa bình Kjeldahl sang binh cất máy, tráng lại bình Kjeldahl 10ml nước cất vơ đạm chung vào bình cất Thêm vào vài giọt dung dịch chỉ thị hỗn hợp, dịch bình có màu tím (mơi trường axit), SHU cho vào lượng kiềm 30-40% đến màu dịch trong bình cất chuyển từ tím thành xanh mạ (mơi trường kiềm).

Ỏ bình hứng có chứa sẵn thể tích dư (A ml) H2S04 0,lN, thêm vào vài giọt dung dịch thị hỗn hợp Đặt bình hứng đầu hệ thông làm lạnh, ý đầu phải ngập dung dịch axit.

Hệ thơng cất phải đảm bảo hồn tồn kín Bát đầu cất, theo dõi màu bình hứng, dung dịch đổi sang màu xanh mạ phải cho thêm vào 5ml H9S040,1N (lấy bằng buret cần cho nhanh vào để khỏi nitơ).

* Chuẩn độ: Lấy bình hứng ra, chuẩn độ H2S04 0,1N (lư bằng dung dịch NaOH 0,1N đến vừa mầu hồng.

Hiệu sô" tổng thể tích dưng dịch H2S 04 ,lN cho vào

bình hứng thể tích dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ cho biết lượng axit tác dụng với NH3, lml dung dịch H2S040,1N tương ứng vói l,42mg Nitơ.

Tính kết quả:

Tính lượng nitơ tổng sô" 1 gam protein sau: (A-B.1,42)

N (mg) = L ^ P

trong đó:

A - Tổng thể tích (ml) H2S 040 ,1 N cho vào bình hứng B - Thể tích (ml) NaOH 0 ,1 N chuẩn độ H2S 040,1 N cịn lại bình hứng.

0,2 - Lượng mẫu (g) lây nghiên cứu.

Ngoài hệ chuẩn H2S 04-Na0H, người ta sử dụng hệ chuẩn H2S04- H3BO3 việc xác định hàm lượng nitd (lê tránh sai sô' thay đổi nồng độ kiềm khơng khí Cách tiến hành sau: cho vào bình hứng 2 0ml H3BO3

2%, thêm nưốc cất đủ để dung dịch ngập đầu hệ thơng

làm lạnh Trong bình hứng xẩy q trình phàn ly H3BO3:

H3BO3 = H B 02 + H20

Khi cất đạm, NH3 bị kiềm đẩy khỏi (NH4)2S 04 phản ứng với HB02:

NH4OH + HB02 = NH4+ + BO; + H20

Vì BOj bazơ mạnh nên dung dịch bình hứng sẽ chuyển từ màu tím sang màu xanh mạ Lượng B02 được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy trình

cat đạm xác định cách chuẩn độ Iìgược với H2S 04 ,1 N Giai đoạn chuẩn độ kết thúc dung dịch chuyến từ màu xanh mạ sang màu tím:

b o + H + = h b o

Tính kết quả:

c 1 42 N(mg) = — —

0,2

trong đó:

c - Lượng H2S040 ,1 N (ml) dùng để chuẩn độ 0,2 - Lượng mẫu (g) lấy nghiên cứu

Xác định nitơ phi protein (N-phi protein)

Để xác định N- phi protein cần dùng dung mơi thích hạp để chiết rút tất dạng N-phi protein, nhiên trong dịch chiết cịn lẫn vài loại protein Vì cần dùng chất kê t tủa để tách phần protein hịa tan q trình chiết rút.

Dung môi chiết rút dạng N- phi protein thường là etìânol 70% Cách làm sau: cân 5-10g nguyên liệu nghiên nhỏ cho vào cối thủy tinh, nghiền lẫn với etanol 70% (tỷ lệ thể tích nguyên liệu 1/4 nêu mẫu tươi 1/8 mẫu khơ). Nghiền 20 phút, sau ngâm khoảng 40-80 phút, khuấy liên tục Lọc tách bã Bă chiết lại etanol lần theo tỷ lệ 1/4 nhiều lần nước cất vô đạm thử khơng cịn phản ứng màu vỏi ninhiđrin Dồn tất dịch chiết lại đem kết tủa protein.

Kết tủa protein tiến hành theo nhiều cách như: bằng

etamol, axeton, muôi kim loại nặng, axit, thấm tích đổi nước

Sau loại bỏ kết tủa, dịch lọc chứa dạng N -phi protein Đem vơ hóa dịch tiếp tục tiến hành x.ác định hàm lượng nitơ theo phương pháp Kjeldahl.

Định lượng protein nguyên liệu

N-tổng sô' bao gồm N-protein N-phi protein Muôi! x.áe định hàm lượng protein nguyên liệu phải xác định N-tổing số N-phi protein Hàm lượng protein mẫu dược tíitih cơng thức sau:

Protein(mg) — (Ntcmg gô' - N pkj protein) * 6,25

b) Xác định protein theo phương pháp Lowry

Nguyên tắc: Protein tác dụng với thuốc thử Folin tạo thàmh sản phẩm màu xanh Đây sản phẩm khử ciủa photphomolipđen-photphovolíramat phức chất đồng-protin và có độ hấp thụ cực đại bưỏc sóng 750nm Dùng máy so m«àu để xác định cường độ màu mẫu so sánh với dỊch

protein chuẩn.

Phương pháp Lowry sử dụng kết hợp phản ứng biure (tác dụng lên liên kết peptit, mục 1.3.1) phản ứng vối thuốc tlhử Folin (tác dụng lên gốíc tirozin, triptophan, histiđin) để tạo phức có màu đặc trưng Phương pháp có độ nhạy tương đơi Cíao,

c h o p h é p x c đ ị n h được đ ế n n n g đ ộ v i c h ụ c p r o t e i n , d c V ậ y

được sử dụng rộng rãi để xác định nhiều loại protein đạmg tương đối tinh khiết Tuy nhiên có nhược điểm màu ciủa phức chất bị ảnh hưởng dung dịch có sơ" chất nlhư EĐTA, đệm Tris, sacarozơ hay sô" chất khử xi&eiin, ditiotreitol

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch nghiên cứu (trong ỉó có chứa khoảng 50-300 Ixg protein/ml)

Dung dịch B: CuS04 5H >0 0 ,5% pha dung dịch natri xitrat 1% (hoặc kali natri tactrat 1%).

Dung dịch c (chỉ pha trước dùng): trộn 1 tích dung dịch B vói 49 thê tích dung dịch A.

Dung dịch Folin pha loãng 2 lần (xem phụ lục).

Thiết bị: Máy so màu quang điện.

Cách làm: Hút xác vào ơng nghiệm khơ 0,5ml dung dịch nghiên cứu, thêm vào 2,5ml dung dịch c, lắc và giữ nhiệt độ phòng 10 phút Sau thêm xác 0,25ml dung dịch Folin pha loãng 2 lần, lắc đều, sau 30 phút đem so màu máy với kính lọc ánh sáng màu đỏ.

Song song với mẫu thí nghiệm, làm ốhg đơì chứng đó thay dung dịch protein nước cất tiếp tục làm nói trên.

Lập đồ thị chuẩn protein: Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn (thường anbumin tinh khiết) có nồng độ pha loãng khác chứa lượng protein tương ứng là: 20, 50, 100, 150, 200, 300 400 Ịig/ml protein từ dịch gốc ban đầu có nong độ lmg/ml Tiến hành làm phản ứng màu với dịch chuẩn theo thứ tự, thành phần tỷ lệ hóa chất với dịch nghiên cứu Dựng đồ thị biểu diễn tương quan mật độ quang học nồng độ protein.

Từ sô* đọc mẫu thí nghiệm, đổi chiếu với đồ thị chuẩn đổ tính hàm lượng protein lml dịch nghiên cứu, từ đó tính hàm lượng % protein ngun liệu.

c) Xác định protein theo phương pháp Bradford

màu tỷ lệ với nồng độ protein dung dịch Phương pháp cỏ độ nhạy cao, cho phép phát tới vài ng protein/ml, dễ thực hiện tiết kiệm thời gian.

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch mẫu protein cần xác định, dung dịch protein chuẩn (anbumin huyết bò)

lmg/ml.

Chuẩn bị thuốc thử Bradford: hòa tan lOOmg CBB G250 trong 50ml etanol 95% 10 0ml H3P04 85%, bố sung H.,0 đến

10 0ml.

Thiết bị: Máy so màu quang điện.

Cách làm: Cho vào ông nghiệm 20 0|il dung dịch mẫu protein, 2ml dung dịch thuốc thử Bradford, lắc Sau 2 phút đo độ hấp thụ ánh sáng ỏ Ằ = 595nm (chú ý cần đo trưốc 1 giờ).

Dựng đồ thị chuẩn protein từ dung dịch anbumin huyết thanh bị lmg/ml: chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, khơ, cho vào lán lượt ống từ I-VT lượng dung dịch chuẩn tương ứng 1; 2,5; 5; 0; 15; 2 0fil, thêm H20 đến 200|il, cho thêm 2ml thuổc thử Bradford, lắc đo mật độ quang học ỏ Dựng đồ thị biểu diễn tương quan mật độ quang học nồng độ protein.

Chương 2

Enzim

Enzim protein đơn giản protein phức tạp có khả xúc tác đặc hiệu cho phản ứng hóa sinh Để định tính định lượng enzim dùng phản ứng đặc

trưng với chất enzim (chất bị chuyển hóa) với sản phẩm tạo thành trình phản ứng.

Hoạt độ enzim phụ thuộc vào yếu tơ" vật lý hóa

hoc khác nhiệt độ, pH môi trường sơ" cỊ^ất có ban chất hóa học khác Các chất làm tăng hoặc làm giảm hoạt độ xúc tác enzim gọi tương ứng là các chắt kích thích chất kìm hãm enzim.

2.1 Các th í nghiệm đ ịnh tính m ột s ố enzim 2.1.1 Pepxin (peptit-peptidohidrolaz)

Đê định tính enzim dựa vào khả làm đơng sữa Q trình làm đơng sữa chun cazeinogen hịa tan thành cazein khơng tan khoảng pH = 4,5 - 5,5.

Dụng cụ: Tủ ấm nồi cách thủy ổn nhiệt (25°C), đồng hồ bấm giây.

Cách làm: Cho vào ống nghiệm 5ml hỗn hợp sừa-axetat, giữ ở 25°c, sau khi đạt đến nhiệt độ thêm o.lml dịch dày, liic đều, dùng đồng hồ bấm giây xác định thời gian xuất kềt tủa cazein thành ống nghiệm.

2.1.2 Amilaz nước bot9

Amilaz nước bọt người thuộc loại a - amilaz, xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột thành dextrin khác Cac dextrin khác khổi lượng phân tử, khả cho phản ứng màu với iôt khả khử dung dịch Fehling.

Nguyên liệu hóa chất'. Dung dịch tinh bột 1% (xem mực 3.1.2.a), thuốc thử Liugôn (xem mục 3.1.2.a), thuốc thử Fehling (xem mục 3.1.1 b).

Dụng cụ thiết bị: Nồi cách thủy ổn nhiệt (40°C), sứ để thử pH, phễu thủy tinh, bình nón (V= 10 0ml), ông đong (V= 50ml).

Cách làm: Chuẩn bị dung dịch nước bọt: súc miệng sạch, lấy 50ml nước cất để súc miệng nhẹ vài lần khoảng - 5 phút Lọc dịch nước bọt qua dịch lọc dùng đê thí nghiệm.

- Thủy phân tinh bột: chuẩn bị 2 ông nghiệm, cho vào mỗi ông 5ml dung dịch tinh bột Thêm vào ông thứ I: 5ml dung dịch

tùy theo thịi gian phản ứng: từ màu xanh tím đên đỏ nâu, đỏ và Cuối màu vàng Ở dãy kiểm tra, tất giọt có màu xanh tím Giải thích kết thu dược.

Thử khả khử hỗn hợp Fehling: Thêm vảo ống I II mỗi ông 2ml hỗn hợp Fehling, đun sôi, ông có amilaz xuất hiện kết tủa đỏ nâu Cu20.

2.1.3 Ureaz

Ureaz xúc tác cho phản ứng thủy phân ure tạo thành amoniac (NH;ì) khí C02.

H2N-C-NH2 + H20 - ♦ 2NH3T + C02t M

O

Ure Amoniac

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch ure 1%, dung dịch phenolphtalein 1% etanol dưng dịch ureaz chuẩn bị qua bưóc sau:

- Loại lipit khỏi nguyên liệu: cân lOOg đậu tương khơ, nghiền thật nhỏ, cho vào bình, lắc - phút với 200ml ete dầu hỏa để loại lipit, lọc qua phễu lọc Buchner Lặp lại bước loại li pit 5-6 lần Sau rải bột giấy lọc để làm bay dung môi Bột khô thu dùng để tách ureaz.

- Chuẩn bị dung dịch ureaz: cho 20 - 30g bột đậu tương đã loại lipit vào cốc bình nón, thêm lần thê tích nước cất, lắc đều, cho vài giọt toluen, để 15 - 20 5°c Li tâm ở 3000 vòng/phút 20 phút, dung dịch kêt tủa suốt nhận chứa ureaz dùng cho thí nghiệm tiếp theo.

Thiết bị: Tủ ấm nồi cách thủy ổn nhiệt (37°C).

enzim (ống II đê nguyên) Thêm vào ống 2ml dung dịch ure và giọt dung dịch phenolphtalein, lắc đểu, giữ 37° 30 phút Quan sát chuyển màu hỗn hợp phản ứng, giỉii thích kết quả.

2.1.4 Peroxidaz

Peroxidaz xúc tác cho phản ứng oxi hóa pirogalol nhờ H2O2 tạo thành purpurogalin (kết tủa nâu - vàng).

Nguyên liệu hóa chất: Khoai tây tươi, dung dịch pirogalol 1%, H2022%.

Cách làm: Mài nhỏ khoại tây, lấy cho vào ống nghiệm, thêm 1 - 2ml dung dịch pirogalol 1% 1 - 2 giọt dung dịch H2022%, xuất kết tủa nâu vàng.

2.2 Tính chất enzim

2.2.1 Ảnh hưỏng nhỉệt độ đến hoạt tính amilaz nước bọt

Đa sô" enzim tách từ thể động vật máu nóng hoạt động mạnh 37 - 40°c (nhiệt độ thích hợp) Ngồi giới hạn nhiệt độ này, hoạt động enzim thường bị giảm Ở nhiệt độ cao hơn 70°c hầu hết enzim bị hồn tồn hoạt tính xúc tác.

36

Pirogalol Purpurogalin

Trong thí nghiệm này, dùng a~amilaz nước bọt để thủy phân tinh bột nhiệt độ khác Đánh giá hoạt dộng của enzim phản ứng màu với iơt.

Ngun liệu hóa chất: Dung dịch nước bọt pha loãng 10 lần (chuẩn bị theo phương pháp mục 2.1.2), dung dịch tinh bột

1%, thuổíc thử Liugơn dung dịch iơt 0,3% KI 3%.

Đụng cụ thiết bị: sứ thử pH, nồi cách thủy (100°C), tù âm (37°C), phích đá.

Cách làm: Chuẩn bị ống nghiệm, cho vào ông 2ml dung dịch tinh bột 1% Đặt ống l vào nồi cách thủy sôi, ông II vào tủ ấm 37°c, ông III vào nước đá Giữ 15 phút để dung dịch ông đạt đến nhiệt độ tương ứng Cho vào mỗi ông 0,5ml dung dịch enzim đạt nhiệt độ trên. Đặt ông nghiệm vào nhiệt độ cũ Sau 1, 2, 4, 6, 8 12 phút lấy từ ỏng 1 giọt, nhỏ vào giọt thuổc thử Liugôn đã chuẩn bị sẵn giếng sứ kính. Quan sát màu tạo thành, nhận xét sai khác giừa mẫu và giải thích.

2.2.2 Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt độ enzim - Xác định pH thích hợp amilaz nước bọỉ

pH môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt độ enzim. Mỗi enzim hoạt động mạnh pH xác định, pH khác hoạt độ enzim bị giảm pH thích hợp cho hoạt độ thủy phân tinh bột a-amilaz nước bọt ở vùng trung tính (gần bằng 7) Tuy nhiên pH thích hơp enzim thay đổi tùy thuộc điểu kiện phản ứng.

Cách làm: Chuẩn bị ống nghiệm sạch, đánh sô' thứ tự t I - VII, cho vào ống dung dịch Na2HP04 KH2P04 theo các thể tích ghi bảng, lắc Cho vào ông lml dung

dịch tinh bột 0,5% NaCl 0,1%, lắc đều, thêm vào ông lml dung dịch nước bọt pha loãng 20 lần, lắc đểu Sau phút lấy 0 ,2 m l dung dịch ống cho lên sứ để thử phản

ửng màu với thuốc thử Liugôn Cứ sau phút lại thử 1 lần cho đến dung dịch ống cho phản ứng âm với thuốc thử Liugơn bắt đầu cho vào tất ống giọt thuốc thử Liugôn, lắc Ghi màu ông vào bảng Xác định pH thích hợp a - amilaz nước bọt (pH ống cho phản ửng âm với thuổc thử Liugôn).

Đảng xác định pH thích hdp a-amilaz nước bọt

Số TT

N a2H P 4 1/15M (ml) khjpo4 1/15M (ml) pH dung dịch Dung dịch tinh bột 0,5% (mi) Dung dịch nước

bọt (ml)

Màu với thuốc thử

Liugòn

1 0,1 4,9 5,3 1 1

II 0,3 4,7 5,6 1 1

III 1.0 4,0 6,2 1 1

IV 2,5 2,5 6,8 1 1

V 3,5 1.5 7,2 1 1

*

VI 4,5 0.5 7,7 1 1

2.2.3 Ảnh hưởng chất kích thích chất kìm hãm

Anh hướng NaCI CuS04 đến hoạt dộ amilaz

Hoạt độ thủy phân tinh bột a-amilaz nước bọt được kích thích NaCl bị kìm hảm C11SO4 Để nghiên cứu ti 1C dụng chất người ta cho enzim thủy phân tinh bột điều kiện có khơng có NaCl C11SO4 Đánh giá hoạt độ enzim dựa theo màu hỗn hợp phản ứng với iơt.

Hóa chất: Dung dịch nước bọt pha loãng 20 lần, dung dịch tinh bột 0,5%, NaCl 1%, CuS041%, thuốc thử Liugòn.

Cách làm: Chuẩn bị ơng nghiệm, cho vào Ơng I : lml nước cất.

Ống II : 0 ,8 ml nước cất 0 ,2 ml NaCl Ống I I I : 0,8ml nước cất 0,2ml C11SO4

Lắc đều, cho vào ông lml nước bọt pha loãng 20 lần và ]ml dung dịch tinh bột, lắc Sau vài phút, thêm vào mỗi ốitg vài giọt thuốc thử Liugôn, lắc đểu quan sát khác nhau giữa ơng Giải thích kết quả.

2.2.4 Tính đặc hiệu enzim

a) Tinh đặc hiệu ureaz

Hóa chất: Ureaz (bột đậu tương), dung dịch ure 5%, dung dịch axetamit 5%

Cách làm: Chuẩn bị 2 ông nghiệm sạch, cho vào ơng I: • 4ml dung dịch ure 5%, ống II: - 4ml dung dịch axetamit 5%, thêm vào ống lg bột đậu tương, lắc đều, đặt miệng mỗi Ống nghiệm mảnh giấy quỳ, đậy ống băng nút bấc Sau một lúc ta thấy ỏ ống chứa ure giây quỳ chuyển sang màu xanh. Ớ ông II giây quỳ không đồi màu Giải thích khác này.

b) Tính đặc hiệu tác dụng a- amilaz nước bọt sacaraz của nấm men

Hóa chất: Dung dịch a - arnilaz nước bọt, dung dịch sacaraz của nâ'm men, dung dịch tinh bột 1%, dung dịch sacarozơ 1%, dung dịch iôt 0,3% KI 3%, thuốc thử Fehling.

Thiết bị: Tủ ấm nồi cách thủy ổn nhiệt (38- 40°C).

Cách làm: Chuẩn bị ống nghiệm, đánh số thứ tự từ I đến IV, cho vào ống I II ống 2ml dung dịch tinh bột, ông III ốhg IV: 2ml dung dịch sacarozơ Thêm vào ống I III: mỗi ống 0,5ml dung dịch nước bọt: ống II ông IV - 0,5ml dung dịch sacaraz Lắc ống, giữ 38 - 40°c 10 phút, làm lạnh Thêm vài giọt dung dịch iôt KI vào ống I ông II Quan sát màu giải thích Làm phản ứng với thuốc thử Fehling vối ống III ống IV Quan sát, giải thích kết quả.

2.3 Xác định hoạt độ m ột số enzim 2.3.1 Xác đinh hoat đô catalazỉ • •

Catalaz xúc tác cho phản ứng sau:

Đê định lượng catalaz dùng dung dịch KMnOj 0,1N dê xác định lượng H9O2 trước sau enzim tác dụng, từ đó tinh dược lượng H,0 , bị phân giải.

5H20 2 + K M n 04 + 3H2S 04 = M n S 04 + K2S 04 + + 8H20

Từ phương trình phản ứng ta tính lml dung dịch KMn040,lN tương ứng với l,7mg H20 2.

Nguyên liệu hóa chất: Khoai tây, cát thạch anh (hoặc bột thủy tinh), bột CaC03, KMn04 ,1 N, H2S04 10%, H202 0,1% trong đệm photphat pH = 7,0.

Dụng cụ va thiết bị: Côi, chày sứ, buret (V = õOml), bình định mức (V = 10 0ml), bình nón (V = 250ml), nồi cách thủy a 00°C).

Cách làm: Chuẩn bị dung dịch catalaz: cân 2g khoai tây cho vào côi, nghiền với cát thạch anh (hoặc bột thủy tinh) Thêm từ từ 2-3ml nước CaC03 để trung hịa dung dịch chiết (đến ngừng tạo thành bọt C02) Chuyển toàn mẫu vật đã nghiên nhỏ cơi vào bình định mức, thêm nước cất vào đến 100ml, lắc đểu để lắng khoảng 30 phút, lọc thu dung dịch trong.

Xác định hoạt độ catalaz dung dịch lọc Lấy 2 bình nón dung tích 250ml, cho vào bình I (bình thí nghiệm): 25ml dung

dịch H20 ,1 %, 2 ml dung dịch enzim, giữ ở 30° 30 phút,

thêm 5ml H2SOj 10% chuẩn độ KMn04 0,1N đến khi xuất màu hồng bền 1 phút Cho vào bình II (bình kiểm tra) 20ml dung dịch enzim đặt vào nồi cách thủy đang sôi phút đổ bất hoạt enzim, lấy để nguội Thêm vào binh 25ml dung dịch H202 0,1% tiếp tục làm vói bình I.

Tính kết quả: Sơ mg H202 bị phân giải enzim lg khoai tây (X) tính theo cơng thức sau:

trong đó:

A - Thể tích KMn04 0,1N dùng để chuẩn độ H202 có trong bình kiểm tra (bình II).

B - Thể tích KMn04 0,1N dùng chuẩn độ H202 cịn lại trong bình thí nghiệm (bình I).

v r Thể tích dung dịch enzim ban đầu (trong thí nghiệm này = 10 0ml)

V2 - Thể tích dung dịch enzim lấy để xác định (20ml). a - Số gam nguyên liệu lấy nghiên cứu (2g).

Sô" đơn vị catalaz lg khoai tây/ịimol H202 bị phân giải sau 1 phút là:

Y (đơn vị) = -30x0,034 trong đó:

30: thời gian enzim tác dụng.

0,034: 1 micro đương lượng H202 0,034mg.

2.3.2 Xác định hoạt độ a - amilaz theo phương pháp Wohlgemuth

Ngun tắc: Dùng dung dịch amilaz có độ pha lỗng khác nhau tác dụng với lượng tinh bột Tìm nồng độ enzim nhỏ phân giải hồn tồn lượng tinh bột dó. Biểu diễn hoạt độ đơn vị Wohlgemuth.

Một đơn vị Wohlgemuth lượng enzim phân giải lmg tinh bột thành sản phẩm khơng có màu với iơt 30

phút ỏ 37°c có anion clo fcr)

Ngun liệu hóa chất: Nước bọt pha lỗng 10 lần, dung dịch tinh bột 0,1 % đệm photphat pH = 6,8 NaCl 0,9%, dung dịch iôt 0,0 2N (2g KI hòa tan 3- 5ml nước, thêm 0,25g iôt dẫn nưỏc đến lOOml).

Cách làm:Chuẩn bị 10 ống nghiệm, đánh số từ I - X Cho vào ông lml NaCl 0,9% Thêm vào ống thứ I: lml dịch

eỉnzim, lác đổu, lấy lml cho vào ống II, lắc đều, lấy lm l cho

vào ông III Tiếp tục làm ông X, lấy lml từ

ômg X bỏ Sau cho vào ơng 2ml dung dịch tinh bột

0 , '<ì, lắc đều, giữ ỏ 37°c 30 phút Khi thời gian hết, làm

nguội ỏng nghiệm đến nhiệt độ phòng, cho vào ông 2 giọt

durg dịch iôt 0,0 2N Ghi ỏng có độ pha lỗng lớn cịn k nãng phân giải hồn tồn tinh bột (ơng có màu vàng ống

ti ếj: sau cịn màu đỏ nâu tím).

Tính kết quả:

Trong ống nghiệm có chứa ml tinh bột ,1 % (tương

ứmg 2mg tinh bột) Giả sử sau thêm iôt, từ ống I đến ống V đung dịch đểu có màu vàng, ơng VI có màu đỏ nâu hoạt độ cùa a - amilaz lml nước bọt chưa pha lỗng dùng để

th í Ìghiệm là:

25 10.2 = 32 10 = 640 đơn vị

trorg đó:

32.10- độ pha loăng V. - 2ml tinh bột.

2.3.5 Xác định hoạt độ ureaz theo phương pháp chuẩn độ

Nguyên tắc: Dùng phương pháp chuẩn độ để xác định lượng N Ẹ tạo thành từ ure tác dụng ureaz.

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch ureaz (xem 2.1.3.), Pb(CH3COO)2 5%> dung dịch ure 2%, HC1 ,1 N, dung dịch chỉ

th ị hỗn hợp

Thiết bị’. Tủ ấm (30°C)

Cách làm: Lấy hai bình nón dung tích 10 0ml Cho vào mỗi

(l)ình kiểm tra) đun sơi 2-3 phút, sau làm nguội đến nhiệt (tộ phịng Cho vào bình 10ml ure 2%, lắc đều, để vào tủ âm

30°c trong 30 phút Khi thòi gian hết, lấy ra, thêm vào bình 5ml Pb(CH3COO)2 5%, - giọt dung dịch thị hỗn hợp làc đều Chuẩn độ hai bình HC1 0,1N đến dung dịch có màu tím nhạt, lml HC1 0,1N tương ứng với l,4mg nitơ.

Hoạt độ ureaz sôT mg nitơ giải phóng từ ure tác dụng ureaz có lượng dung dịch enzim dùng 1 phút tính theo cơng thức sau.

V _ (A-B).l,4 30 trong đó:

X - Hoạt độ ureaz.

A - Thể tích HC1 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm (I).

B - Thể tích HC1 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra (II).

30 - Thịi gian phản ứng (tính phút). 1,4- Hệ sơ" chuyển thành lượng nitơ.

Muốn tính hoạt độ nguyên liệu ban đầu (trên gam mẫu), cần nhân kết vối tổng thể tích dưng dịch enzim chiết được, chia cho sơ" gam mẫu Ví dụ: từ 20 gam bột chiết

được 10 0ml dung dịch enzim, lấy 10ml để xác định hoạt độ. Khi hoạt độ 1 gam mẫu là:

Y _ X.100

~ 10.20

trong đó:

Y - hoạt độ enzim tính 1 gam mẫu

2.3,4 Xác định hoạt độ proteinaz theo phương pháp Anson cải tiên

Nguyên tắc: Cho proteinaz tác dụng với chất cazein hoặc hemoglobin đả bị biến tính, sau kết tủa protein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm tạo thành bang phản ứng màu với thuốc thử Folin.

Biểu diễn hoạt độ dờn vị hoạt độ Một đơn vị hoạt độ

là lương enzim điểu kiện tiêu chuẩn, sau 1 phút phân giải protein tạo thành sản phẩm hòa tan TCA tương ứng vói ljimol tirozin.

Nguyên liệu hóa chất: Thuốc thử Folin (pha lỗng lần), Na2C03 6%, TCA 5% Dung dịch cazein 1% đệm photphat 1/15M, pH = 8,0 Dung dịch enzim: dung dịch môi trưịng ni cấy vi sinh vật dịch proteinaz chiết từ nguyên liệu nhất định (dung dịch chiết từ dứa tươi).

Thiết bị: Tủ ấm 37°c, máy quang phô máy so màu quang điện.

Cách làm: Lấy hai ông nghiệm sạch, khô.

+ Cho vào ống I (ong thí nghiệm) 0,5inl dung dịch enzim, giữ 10 - 15 phút ỏ 30°c, thêm lml dung dịch cazein (đã đạt 30°C), lác đểu, giữ 30°c 10 phút Sau cho 2,5ml TCA vào, lắc đểu để lắng 30 phút nhiệt độ phòng Lọc, dung dịch lọc suốt nhận có chứa sản phẩm hịa tan trong TCA phản ứng enzim Hàm lượng sản phẩm dung dịch lọc xác định phản ứng màu.

+ ống II (ống kiểm tra): cho 0,5ml enzim, 2,5ml dung dịch TCA, lắc đểu để bất hoạt enzim, thêm lml dung dịch cazein, lắc đểu để 30°c 10 phút, sau để thêm 30 phút nhiệt độ phòng tiếp tục làm ống I.

+ Ông đốỉ chứng: ống đối chứng thay 0,5ml dung dịch lọc bằng 0,5ml nước cất Các bước thực với ông 1 và ống II.

Tính kết quả: Tính hiệu số giá trị mật độ quang học của mẫu thí nghiệm mẫu kiểm tra, dựa vào đồ thị chuẩn tính lượng |j.moỉ tirozin tương ứng Tính hoạt độ lml dung dịch enzim theo công thức sau:

v _ a.8.b A —

-t trong đó:

X - Số đơn vị hoạt độ lml dịch enzim

8 - Thể tích hỗn hợp phản ứng TCA (4ral: 0,5ml). a - Số Ịimol tirozin tương ứng với hiệu sô' giá trị mật độ quang học ống thí nghiệm kiểm tra.

b - Độ pha lỗng dung dịch enzim (nếu có) t - Thòi gian phản ứng (10 phút)

Ghi chú: Đồ thị chuẩn tirozin làm song song hoặc làm trưốc.

Cách làm: Chuẩn bị dung dịch tiroãn 1 Ịimol/ml HC1 0,2 N pha loãng dung dịch vối độ pha loãng khác từ ,0 1 - 0 ,1 |imol/ml HC1 0,2 N Lấy 0,5ml từ dịch pha loãng làm phản ứng màu Đo mật độ quang học của các ông Dựng đồ thị chuẩn biểu diễn tương quan mật độ quang học nồng độ protein.

2.3.5 Xác định hoạt độ lipaz

Có thể xác định dược hoạt độ lipaz theo hàm lượng axit béo được giải phóng từ lipit tác dụng lipaz.

Nguyên liệu hóa chất: KOH 0,1N, etanol tuyệt đơi hoặc 96%, phenolphtalein 1% Chế phẩm lipaz tụy tạng chuẩn bị sau: Cân 1 gam tụy tạng động vật cho vào cối sứ, thêm 5ml hỗn hợp nước - glixerin (tỷ lệ 3: 1), nghiền kỹ - 5 phút Sau lại thêm 5ml hỗn hợp nước - glixerin nghiền ti(‘p 1 - phút Lọc vắt hỗn hợp qua hai lớp vải màn, sau lọc lại qua giấy lọc, thu dịch lipaz để làm thí nghiệm.

Dụng cụ thiết bị: Bình nón dung tích 10 0ml, buret, tủ

ấm (37°c - 40°C)

Cách làm: Lấy hai bình nón dung tích 10 0ml, cho vào mỗi bình 10ml sữa tươi Bình I (bình kiểm tra) đun đến sôi, sau đỏ cho 2ml lipaz vào đun sôi tiếp phút Để nguội đến nhiệt độ phịng Bình II (bình thí nghiệm) để ngun, thêm vào 2ml lipaz, lắc đểu Đê hai bình vào tủ ấm 37 - 40°c Sau 1 giờ lấy hai bình ra, thêm vào bình 8ml etanol tuyệt đối hoặc 96%, vài giọt phenolphtalein chuẩn độ hai bình KOH 0,1 N Hoạt độ lipaz biểu thị sôml KOH dùng để chuẩn độ axit héo tạo thành từ thủy phân lipit có 1 lít sữa tính theo cơng thức:

x = (a-b) k .100

trong đó:

a - Sô" ml KOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm (II)

b - Sơ" ml KOH 0,1N đă dùng để chuẩn độ bình kiểm tra

(I)

Chương 3

Sacarit

Sacarit thành phần quan trọng cơ

thể sinh vật, thành phần chủ yếu thức ăn người và nhiều động vật Tuy nhiên chúng khơng có vai trị cung cấp năng lượng mà cịn có vai trị cấu trúc bảo vệ thể.

Để phân loại sacarit người ta thường dựa vào chất hổa học chúng; phân thành hai nhóm lớn: monosacarit và polisacarit.

Monosacarit anđehit poliol (các anđozơ) hoậc xeton poliol (các xetozơ), chúng cho phản ứng nhóm chức Phản ứng quan trọng dùng nhiều định tính định lượng sacarit phản ứng khử cốc muối kim loại Ngoài phản ứng chung này, monosacarit khác cho sơ" phản ứng màu đặc trưng, có thể dùng để nhận biết phân biệt loại đường khác nhau (giữa pentozơ hexozơ, anđozơ xetozơ).

Tùy theo số cacbon phân tử, ngưịi ta phán monosacarit thành nhóm nhỏ: triozơ, tetrozơ, pentozơ, hexozơ, heptozơ, octozơ, nanozơ Trong nhóm phơ hiến nhất pentozơ hexozơ.

Polisacarit monosacarit kết hợp với tạo thành Mức dộ phức tạp polisacarit tùy thuộc vào sô lượng cách kêt hợp giừa monosacarit Ngưòi ta dựa vào dặc điểm đê phân loại polisacarit Các oligosacarit quan trọng phô biến sacarozơ, mantozơ, lactozơ Các pdisacarit bậc cao thường gặp tinh bột, glicogen, xenlulozơ

I)u3i giới thiệu sơ" phản ứng định tính định lượng quan trọng sacarit.

3.1 Các phản ứng định tính

3 /1.1 Cac phản ứng mono - đisacarit

aj) Phản úng Tromer

Dưải tác dụng mono - sô" đisacarit môi trường kiềm Cu2* bị khử thành Cu\ đồng thời nhóm chức amđehit xeton đường bị oxi hoá thành muối tương ứĩng Phản ứng xảy sau:

*pH y^ONa

H COH HCOH

I I

(| ưH f 2CuS + õNaOH — ► HỸ ° H + 2N a2SO., + 2CuOH + 2H20

H COH HCOH

H COH HCOH Cu2 ° i + H °

L I

c h2o h c h2o h

Hóc chất: Glucozơ 5%, NaOH 10%, CuS04 5%.

Cách làm: Cho vào nghiệm 2ml dung dịch glucozơ 5%, ‘

CuS04 5% vào đến xuất kết tủa xanh Cu(OH)2-Đun đến sơi, quan sát, giải thích.

Chú ý khơng cho thừa CuS04 đun tạo kẻt tủa đồng (II) oxit (CuO) có màu đen làm lấn át màu phản ứng.

b) Phản úng vớí thuốc thửFehling

Phản ứng với thuốc thử Fehling phản ứng Tromer cải tiến: Cu2+ dạng kết hợp với muối kali natri tactrat bị các mono - đisacarit có tính khử khử thành Cu' theo cách tương tự phản ứng Tromer:

cC u COOH

ĩ H _ r

HCOH COOK HCOH COOK

i I _ L I _ -I

HCOH C H O -^ HCOH CHO + C u ,o ị

I + Cu + NaOH — ► I + 1

HCOH CHO"" HCOH CHO + 2H 0

i_ i_ I i

HCOH COONa HCOH COONa

I _ I

CH2OH c h2o h

So với phản ứng Tromer, phản ứng Fehling có ưu ỏ chỗ có cho thừa thuốc thử khơng tạo thành CÚO.

Hóa chất: - Glucozd 1%, mantozd 1%, sacarozd 1%.

- Chuẩn bị thuốc thử Fehling gồm hai thành phần". + Dung dịch Fehling A: hòa tan 40g CuS04.5H20 1 lít nước cất Nếu dung dịch đục lọc.

+ Dung dịch Fehling B: hịa tan 0g kali natri tactrat (C4H406NaK 4H20) 150g NaOH 1 lít nước cất.

Thuổc thử Fehling (chỉ pha trước dùng): trộn lẫn 1 thể tích dung dịch Fehling A vói 1 thể tích dung dịch Fehling B, lắc đểu, nhận dung dịch trong, màu xanh biếc.

Cách làm: Lấy ông nghiệm, cho vào ông I: lml dung dịch g’lu:ozơ 1%; ống II: lml mantozơ 1%; ông III: lml sacarozd 1%.

T h án vào ông lm l thuôc thử Fehling Lắc đun 3

ôĩng đến bắt dầu sôi Quan sát, so sánh kêt các ơrng giái thích.

Có thể dùng phản ứng để tìm thấy đường lát cắt

của mô, cách làm sau: đặt lát cắt lam kính, nhỏ vài

g?iọt thuôc thử Fehling, đậy lamen lại, hơ nhẹ đèn cồn một liic len nước ở bắt đầu sơi Quan sát kính hiển vi. N ếi có đưịng sè thấy nhừng chấm nâu nhỏ Cu >0 lát cắt.

cj) Phản útig Benedict

Phản ứng đặc trưng nhạy đường khử hơn plhản ứng với thuốc thử Fehling Trong thuốc thử Benedict dùng N a.C()3 thay cho NaOH, natri xitrat thay cho muôi segnet của thư)C t h Fehling Vì phản ứng khơng tạo thành đồng h:iđ*oxit mà tạo thành đồng cacbonat Độ nhạy phản ứng rất caio cần dùng dung dịch đưòng 0,1% làm thay đối màu dung dịch phản ứng (từ xanh da tròi đến xanh lục). Míàìi xanh lục màu Cu20 hịa lẫn vối màu xanh của tbiưếc thử.

Hóa chát:

- Glucozơ

0,1% Chuẩn bị thuốc thử Benedict: hịa tan 173g natri xitrat trorg 700ml nước sơi, thêm 10 0g Na2C03 khan, làm lạnh, thêm từí ;ừ 10 0ml dung dịch CuS04.5H20 17,3%, thêm nước đến

lQOỈml.

thủy sôi phút Dung dịch chuyển thành màu Xan h lục, có kết tủa đỏ tùy theo lượng glucozd dung dịch.

d) Phản úng với động axetat [(CH3COO)2Cu] (Phản úng Barf*d)

Phản ứng khác với phản ứng ỏ chỗ không ‘,iến hành mơi trường kiềm mà mơi trường gần trintg tính, điều kiện đisacarit khơng bị oxi hóa Vì vậy đây phản ứng để phân biệt đisacarit monosacarit có tín h khử.

Hóa chất:

- Glucozơ 5%, mantozơ 5%.

- Chuẩn bị thuốc thử đồng axetat: Hòa tan 13,3g dồrug axetat 200ml nước cất nóng, lọc, thêm vào dung dịch lọc 19ntil axit axetic bàng (đậm đặc).

Cách làm: Lấy 2 nghiệm, cho vào ông I: linl dung dịch glucozơ 5%; ống II: lml mantozơ 5% Thêm vào ống lnnl thuốc thử đồng axetat, sau đế hai vào nồi cách tiủ y đang sôi 10 phút Quan sát, so sánh giải thích kết quả nhận Viết phương trình phản ứng.

Chú ý khơng đun q lâu, đisacarit bị thủy piân thành monosacarit cho phản ứng dương tính.

e) Phản úng tráng gương (tạo thành bạc kim loại)

Các mono - đisacarit khử bạc dạng muối thành bạic

kim loại (Ag+ -> Ag).

Cách làm: Cho vào ống nghiệm lml dung dịch AgN035%. Thêm giọt amoniac, tạo thành kết tủa Sau tiêm amoniac đến vừa tan, cho tiếp vào 3ml dung dịch glucozd 5°/i V à đun Quan sát Phản ứng xảy sau:

AgNO, + 3NH OH = [Ag(NH,)2 OH] + NH |NO;1 + 2H,0.

CH2OH - (CHOH) 4 - c - H + [Ag(NH3)2]OH

-> CH2OH-(CHOH)4 - c - ONH4 + 2Ag + 3NH3i + H,

Phản útìg khử xanh metylen

E>ưới tác dụng glucozơ, xanh metylen bị khử thành chất không: màu.

Hóa chất: Xanh metylen 1%, NaOH 5%, glucozơ 1%.

Ciách làm: Lấy hai ông nghiệm:

O’ng I: cho 2ml nưỏc, thêm giọt xanh metylen 1% giọt VíaOH 5% Đun sơi - quan sát.

ốĩng II: Làm thay nước cât dung dịch lucoz<đ 1% Quan sát.

Liàm lạnh hai ông vài phút Quan sát giải thích.

Xanh metilen

(Dạng oxi hóa, màu xanh) +2e+2H

-2e -211

H

Lơco metiien

g) Phản úng khử kali fenxianua

Trong môi trường kiềm, glucozơ khử kali ferixianua thành kali feroxianua:

C6H1206 + 6K3Fe(CN)6 + 6KOH

-> (CHOH)4 - (COOH)2 + 6K,Fe(CN)e + H20

(kali ferixianua) (kali feroxianua)

Phản ứng dùng để định lượng đường khử.

Hóa chất: K3Fe(CN)6l%> KOH 5%, glucozd 1%, xanh metylen 1%.

Cách làm: Cho vào ống nghiệm 5ml dung dịch K3Fe(CN)6 1%, 2ml KOH 5%, lml glucozd 1% Đun, quan sát Thêm 1 giọt xanh metylen, quan sát.

h) Sự tạo thành họp chất vòng s ố phản úng màu đặc trưng chúng

Dưói tác dụng axit vô đặc nhiệt độ cao, các monosacarit có sơ" cacbon phân tử lớn b ị nước tạo thành hợp chất vòng: từ pentozơ tạo thành fucfurol, từ hexozơ tạo thành oximetylfucfurol:

—7—— !

H - C - O H H O - C - H H C - CH

o *

H - c - H H - c - c r , , HC c - c r „

H \ / H

o H HO c r

Pentozd Fucfurol

Khi đun dung dịch fructozơ (hoặc xetohexozơ khác) với HC1 (có thuốc thử) tạo thành oximetylfucfurol, hợp chất n*à' phản ứng VỚI rezoxin tạo thành hợp chất có màu đỏ

tỉhẫm.

Trong điêu kiện thí nghiệm, anđozơ củng cho phản ứng nhưng chậm, ngược lại xetozơ cho phản ứng sau 30 giâ/, nhanh gấp nhiêu lần so với andozd Vì phản ứng Xêl.vanôp coi phản ứng đặc trưng xetozơ được cỉ ùrg làm sở cho phương pháp định lương fructozơ Có thể xác đim cường độ màu sản phẩm phản ứng máy so màu q ugng điện vối kính lọc bước sóng 490nm.

Hóa chát:

- Dung dịch fructozơ 0,5%, glucozd 0,5%.

- Chuẩn bị thuôc thử Xêlivanôp: hòa tan 0,05g rezoxin tror.g 10 0ml dung dịch HC1 6 N.

Cách làm: Lấy hai ông nghiệm, cho vào ống lml thuôc thủ Xêlivanôp Thêm vào ống I: 1- 2 giọt dung dịch fructozơ 0,5%, lác đều, đặt vào nồi cách thủy sôi, sau 30 giây lấy ra quan sát xua't màu ống Thêm vào ống II: 1 - giọt dung dịch glucozơ 0,5% làm tiếp ống I, theo dõi thời gian xuấ: màu ống Giải thích kết nhận được.

2 Phản ứng với antron

Khi kết hợp với antron, hợp chất vòng tạo thành từ hexozơ (dưới tác dụng H2S 04 có thc thử) cho sảinphẩm ngưng tụ có màu xanh nước biển đặc trưng:

1 Phản ứng Xêliưanôp (p h ả n ứng xetozơ với rezoxin)

o

Sản phẩm ngưng tụ (màu xanh nước biển)

Phản ứng với antron dùng làm sở cho phương pháp định lượng glicogen thơng dụng, glicogen dược xác định cách trực tiếp mà không cần phải qua thủy phân nên tiết kiệm nhiều thời gian Cường độ màu sản phẩm phản ứng xác định máy so màu quang điện với kính lọc màu đỏ (Ằ = 620nm).

Hóa chất:

- Glucozơ 1%. %

- Chuẩn bị thuốc thử antron: Hòa tan 1 g tioure 50mg antron (đã kết tinh lại) 10 0ml H2S 04 66% nồi cách thủy 80- 90°c, lây để nguội, cho vào lọ nâu bảo quản trong tủ lạnh Thòi hạn sử dụng: 2- tuần.

Cách làm: Cho vào ống nghiệm 0,5ml glucozơ, thêm 5inl thuổc thử antron, lắc đều, để nhiệt độ phòng 0- ]5 phút, sau để nồi cách thủy sơi 15 phút (chú ý không để nước bắn vào làm đục dung dịch) Để nguội Quan sát màu tạo thành (có thể để thêm 30 phút chỗ tối cho cường độ màu đạt tới cực đại), giải thích.

3 Phản ứng Bial

Khi có muối sắt, fucfurol tạo thành từ pentozơ (trong môi trường axit thuổc thử) phản ứng với ocxin tạo thành hợp chất màu xanh lục:

Phản ứng vói ocxin phản ứng đặc trưng pentozơ, và là cơ sở cho phương pháp định lượng pentozd theo Meibauin.

Cường độ màu sản phẩm phản ứng xác định được trên máy so màu quang điện với kính lọc bước sóng 660nm.

Cách làm: Cho vào ông nghiệm 1 -2nil thuốc thử ocxin, cỉun đ<ên sôi Thêm vào thuỏc thử dang nóng 4-5 giọt dung dịch p*entozơ 1- 2%, để ông nghiệm nồi cách thủy sôi khoảng 20 phút Quan sát chuyển màu hỗn hợp

phản ứng.

4 Phản ứng với a- naphtol

Fucfurol oximetylfucfurol kết hợp với a- naphtol

sẽ' tạo thành hợp chất ngưng kết quinoit có màu tím đỏ đặc

trưng Phản ứng có độ nhạy cao nên sử dụng để phát hiện các pentozơ hexozd thành phần hợp chất hữu cơ (n hư axit nucleic).

O H

-OH OH

Ribozd

+ HC1 0_cf0 + 3H.,0

o H

Fucfurol

h o c h 2 - Ọ - c t H + 3H20

5-oximetylfucfurol

Hóa chất: Glucozd 1%, fructozd 1%, a- naphtol 0% pha ỉro>ng etanol 96%, H2S04 đặc.

Cách làm: Lấy hai ống nghiệm, cho vào I: lml glucozơ i%, ống II: lml fructozơ 1% Thêm vào ống hai giọt

+ HC1

a-naphtol Nhỏ theo thành ống nghiệm lml H2SO4 đậc. Quan sát xuất vòng sản phẩm màu mặt phân cách hai lóp chất lỏng, giải thích kết quả.

5 Phản ứng với ure

Hóa chất: Fructozơ 1%, glucozd 1%, ure tinh thể, HC1 đặc.

Cách làm: Cho vào ô>ng nghiệm 0,lg ure tinh thể, thêm 5-6 giọt HC1 đặc 2-5 giọt fructozơ, lắc cẩn thận đến hòa tan ure Đặt ông nghiệm vào nồi cách thủy sôi Sau - 5 phút xuất vòng màu xanh.

Làm lại thí nghiệm với glucozơ 1%, sản phẩm có màu đỏ. Trong điều kiện thí nghiệm, ribozơ các andopentozd khác cho màu vàng.

k) Phản útìg sacarozơ với mi coban

Trong mơi trường kiềm, sacarozơ tạo thành hợp chất màu tím vói muối coban.

Hóa chất: Dung dịch sacarozơ 1-2%, dung dịch coban nitrat hoặc sunfat • 2%, KOH NaOH 5%.* •

Cách làm.'. Cho vào ơng nghiệm 2ml dung dịch sacarozơ, lml dung dịch kiểm vài giọt dung dịch mi coban, dung dịch chuyển sang màu tím.

3.1.2 Phản ứng định tính poiisacarit

a) Phần úng màu tinh bột với iôt

khi dung dịch tráng hồn tồn khơng hồi phục màu xanh dù có làm lạnh dung dịch.

Phản ửng màu tinh bột với iơt có độ nhạy cao, vậy thường cỉược sử dụng phương pháp chuẩn độ iôt (làm chât chỉ thị) Ngồi người ta thưịng dùng phản ứng đê quan sát hạt tinh bột mô thực vật.

Nguyên liệu hỏa chất:

- D ung cỉịch tinh bột 0,5%: hòa tan 0,5g tinh bột một

ít mước cất, thêm nước cất sôi vào, khuấy đều, tiếp tục đun (iếĩn sôi, để nguội, thêm nước cất đến 10 0ml.

- Thuốc thử Liugòn: hòa tan 2,5g KI 20ml nước cất, thềm 1 g iôt, lác cho tan hết, thêm nước cất đến 10 0ml.

Cách làm: Cho vào nghiệm 2-3ml dung dịch tinh bột, thếlm vài giọt thuốc thử Liugơn, quan sát màu Đun nóng ống nglhiệm đến dung dịch vừa màu Làm lạnh dung dịch, qan sát Lại đun ơng nghiệm, lần kỹ đến dung dịch màu hoàn toàn Làm lạnh, quan sát, giải thích.

Ghi chú: Phản ứng màu tinh bột với iôt không xảy ra trOing mơi trường kiềm.

b) Kiểm tra tính khử dung dịch tinh bột

Dung dịch tinh bột tinh khiết khơng có tính khử, nhưng sau bị thủy phân (dưới tác dụng axit amilaz) tạo thàmh sản phẩm có tính khử.

Ngun liệu hóa chất:

• Dung dịch tinh bột 1% (chuẩn bị theo phương pháp mục 3.1 2.a).

Cách làm: Chuẩn bị hai ống nghiệm, cho vào ống 4-5ml

dung dịch tinh bột Thêm vào ống I: giọt dung dịch HCl đặc;

ống II: giọt nưỏc cất Đặt hai ông khoảng 1 -15 trong

nồi cách thủy sơi Sau lấy hai ống ra, làm lạnh, trung hòa, thử phản ứng Trome Trong I xuất kết tủa nâu đỏ Cu20,ốhg II cho phản ứng âm (nếu dun^ dịch tinh bột thật tinh khiết).

c) Sự thủy phân tinh bột

Dưới tác dụng axit amilaz, tinh bột bị thủy phân tạo thành sản phẩm trung gian gọi dextrin cuôi cùng tạo thành mantozd glucozơ Có thể phân biệt loại dextrin dựa vào khác chúng khối lượng phân tử, khả khử phản ứng màu với iơt Amilodextrin cho màu tím, eritrodextrin cho màu đỏ nâu, acrodextrin và maltodextrin không cho phản ứng màu với iôt Vì dựa vào phản ứng màu với iôt khả khử sản phẩm được tạo thành để phán đoán mức độ thủy phân tinh bột.

Nguyên liệu hóa chất:

- Dung dịch tinh bột 1%.

- HC1 đặc (1 2N) H2S04 đặc (2 0N), dung dịch iôt 0,001N.

Glicogen có cấu tạo gần giơng amilopectin tinh bột với các gôc a - D - glucozơ kết hợp với liên kết 1,4 liên kêt 1,6 (ở chỗ phân nhánh) Glicogen tạo thành dung dịch keo t r o n g nước nóng, tác d ụ n g VỚI iơt cho m àu đỏ nâu P hản ứng

màu sử dụng để phát glicogen gan,

Nguyên liệu hóa chất: Gan ếch (để tách glicogen), KOH 30 %, ete etylic, etanol, thuốc thử Liugôn.

Dụng cụ thiết bị: Cối, chày sứ, cốc (V=10 0ml), đĩa đồng hồ, máy ly tâm, nồi cách thủy (10 0°C).

Cách làm:

- Chuẩn bị glicogen: Cân õg gan ếch (lấy sau giết ỗclh), nghiền nhỏ cốỉ sứ chuyển vào ông ly tâm hoặc

cốc Thêm vào 10 thể tích dung dịch KOH 30% etanol íỉã đun nóng, khuấy đều, giữ 15 phút nồi cách thủy đang sơi Sau để nguội ly tâm 10-15 phút với vận tốc 3000 vòng/ phút Gạn lây nùốc kết tủa, thêm giọt etanol í)6'% để kết tủa glicogen Kết tủa thu sau ly tâm rửa bằ ng cồn 50%, 75%, 96% cuối ete etylic Kết tủa glicogen cho vào đĩa đồng hồ hong khơ khơng khí.

- Phản ứng màu: Cho vào ông nghiệm glicogen, lml nư^ớc cất nóng, lắc cho tan, để nguội, thêm 2 giọt thuốc thử Liugôn Quan sát xuât màu, giải thích.

3.2 Đ ịnh lượng sacarit

Các dạng đường (mono-, oligo - polisacarit) định lưcing nhiều phương pháp hóa học khác nhau: dùng phíản ứng màu (như với antron hay phenol để xác định glicogen, hoíặc xác định pentozd phản ứng màu với ocxin ), dùng

phản ứng khử đường hay sản phẩm sau thủy phân bàng enzim axit oligo- polisacarit Các phương pháp thông dụng sử dụng phản ứng khử đường, dó phản ứng khử muối Cu2* phô biến nhất.

3.2.1 Định lượng đưòng khử theo phương pháp Bertrand

Tất đường có nhóm anđehit hay nhóm xeton tự do trong điểu kiện định có khả tham gia vào phản ứng oxi hoá- khử với ion kim loại gọi đường khử.

Phương pháp Bertrand dựa vào khả khử dung dịch Cu2+ môi trường kiềm để định lượng các loại a n đ ( ) Z ( i,

xetozơ hay disacarit có tính khử (như mantozd, lactozơ).

Quá trình định lượng đường khử tiến hành lần lượt theo bước:

- Đun dung dịch kiềm Cu2* (dung dịch Fehling) với dung dịch đường để tạo kết tủa Cu20 (phản ứng vỏi thuôc thử Fehling, mục 3.1.1).

- Sau rửa sạch, kết tủa Cu20 được hòa tan dung

dịch sắt (III) sunfat, axit Cu+ chuyển thành Cu2* Feu chuyển thành Fe2+:

Cu20 + Fe2(S 04 ) 3 + H2S 04 = C u S 04 + F e S 04 + H20

- Chuẩn độ Fe2+ dung dịch KMn040,1N:

- Dung dịch mẫu (chứa đường khử cần xác định hàm lượng).

- Thuốc thử Fehling (chuẩn bị theo phương pháp ở

mục 3.1-l.b), dung dịch Fe2(S0 4)3 H9SO4, dung dịch KMnO4 0,lN.

Dụng cụ thiết bị'. Bình nón (V=10 0ml), buret, phễu lọc Buchner, bình Buchner, bơm hút chân không, bếp điện, lưới amiảng.

Cách làm:

- Cho vào bình nón 20ml dung dịch đường, thêm 20ml hỗn họp Fehling Đậy bình nút thủy tinh đun bếp có lưới amiăng Đun sơi phút kế từ bắt đầu xuất hiện bọt Kết tủa đỏ gạch Cu20 xuất bình. Lấy bình đế nguội.

- Rửa kết tủa Cu20 vài lần nưóc ấm đun sơi (mục chch loại O9) dung dịch rửa khơng cịn phản ứng kiểm giấy quỳ Q trình rửa kết tủa tiến hành trên phễu lọc Buchner (được gắn liền với bình Buchner bơm hút chân không) với giấy lọc dày; ý giữ kết tủa lại bình và trên lớp oxit (ở giây lọc bình) phải ln ln có lỏp nưóc để Cu20 khơng bị oxi hóa oxi khơng khí.

Để hòa tan kết tủa CuoO, đặt phễu lọc Buchner lên bình nón có chứa kết tủa Đổ vào phễu 15ml dung dịch sắt (III) sunfat axit [Fe2(S04)3] chảy từ từ xuống bình, lắc Quan

s t xem k ế t tủ a ỏ p h ễu bình hịa ta n h ế t chưa,

nếu chưa thi cần phải thêm sắt sunfat Sau hòa tan hết kết tủa, rửa phễu nước nóng nước rửa không cho phản ứng axit giấy quỳ.

- Chuẩn độ dung dịch bình (Fe2*) dung dịch

KMn040,1N xuất màu hồng 30 giáy.

Tính kết quả: Từ lượng KMn04 dùng để chuẩn độ tính ra lượng đồng Từ lượng đồng tra bảng tìm lượng đưịng tương ứng.

Từ kết tính phần trăm đường dung dịch:

v a.100

X(mg%) = ^

a - Sô mg đường nhận từ bảng (xem phần phụ lục).

3.2.2 Định lượng tinh bột

Để định lượng tinh bột dùng nhiều phương pháp

khác Phương p h p đơn giản phổ biến nhâ't d ù n g axit

để thủy phân hoàn toàn tinh bột thành glucozơ Dùng trong các phương pháp định lượng đường khử để xác định lượng glucozd tạo thành, từ suy lượng tinh bột cácR nhân với hệ sô" 0,9.

Nguyên liệu hóa chất: Bột gạo khoai lang tươi, HC1 20 - 25%, NaOH 10%, hóa chất để định lượng đường khử theo phương pháp Bertrand.

Dụng cụ thiết bị: Cối, chày sứ, bình nón bình cầu cổ ngắn (V= 250ml) có lắp ống sinh hàn, phễu lọc, bình định mức (V= 250ml), dụng cụ thiết bị để định lượng đường khử theo phương pháp Bertrand (xem mục 3.3.1).

h oàn toàn đường khử (kiểm tra nước rửa phản ứng Tromer hoậc phản ứng VỚ I thuốc thử Fehling).

Dặt phễu với giấy lọc có chửa ngun liệu bình nón bình cầu (V=250ml) Dùng đũa thủy tinh nhỏ chọc thủng giấy lọc, rửa toàn nguyên liệu giấy lọc vào bình b ằng niíỏc cất (khoảng 80ml) Thêm vừa đủ lượng HC1 20% vào binh dể nồng độ axit cuối dung dịch 2%. Láp ơmg sinh hàn, đặt bình vào nồi cách thủy sôi đun giờ, thỉnh thoảng lắc Sau thủy phán xong, lấy bình để nguội, trung hòa dưng dịch thủy phân NaOH 10% (thử bàng giấy qụỳ để đạt môi trường axit yếu) Chuyển tồn dung dịch sang bình định mức, dẫn nước cất đến vạch mức bình (250ml). Khuấy đểu, lọc, dung dịch lọc suốt Lấy 20ml để xác địịnh đường khử theo phương pháp Bertrand.

Tính kết quả:

Lượng bột nguyên liệu tính theo cơng thức: v /_ / a.0,9.V|

X(mg)= ’

v

a - Lượng glưcozơ (mg) có V2 ml dịch thủy phân.

- Tổng thể tích nguyên liệu sau thủy phân trung hòa (250ml).

Chương 4

Axit nucleic

Axit nucleic là thuật ngữ chung cho a x i t

dezoxiribonucleic (ADN) axit ribonucleic (ARN) Chúng

một nhóm hợp chất chính, quan trọng mọi tế bào thể sông Cả ADN ARN đểu tạo thành từ các mononucleotit thông qua liên kết 3,5- photphođieste Mỗi mononucleotit gồm bazơ nitơ thuộc nhóm purin như adenin, gưanin thuộc nhóm pirimidin timin, xitozin, uraxin liên kết với gôc đường bon (5C) axit photphoric Sự khác ADN ARN ỏ gôc đường 5C; trường hợp ADN đường 5C dezoxiribozơ, cịn trong ARN đường ribozơ Ngồi ra, gốc timin ADN được thay gốic uraxin ARN Đây sở để nhận biết định lượng loại axit nucleic này.

4.1 Các tính châ't lí - hố a xit nucleic 4.1.1 Tính tan axit nucleic

nư<íc axit nucleic tạo thành dung dịch keo, dễ dàng bị kết tủa tác dụng chất lấy nước.

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch ARN 0,1% từ nấm men, dung dịch ADN 0,1% tách từ gan động vật (có thể dùng che phẩm ARN ADN thương mại), HC1 0,1 N, axit axetic 0 ,1 N, NaOH 0,1N, etanol 96%, izopropanol)

Cách làm:

- Lấy ông nghiệm, cho vào ỏng nghiệm I: 0,5ml dung dịch ADN 0,1%, ông II: 0,5ml ARN 0,1%, thêm vào 0,5ml HC1 0,1 N, kết tủa trắng axit nucleic tạo thành Thêm từng giọt dung dịch NaOH 0,1N, kết tủa lại hịa tan.

Có thê làm lại thí nghiệm này, thay HC1 dung dịch axit axetic 0,1N nhận kết tương tự trên.

- Lấy ông nghiệm, cho vào ống nghiệm I: lml dung dịch ADN 0,1%, ông II: lml ARN 0,1%, thêm vào ống thể tích etanol 96% lạnh (2ml) hay 0,6 thể tích izopropanol (0,6ml), kết tủa tráng axit nucleic xuất hiện.

4,1.2 Các phản úmg màu axit nucleic

a) Sự tạo màu với xanh tnetylen

Trong môi trường axit, axit nucleic kết hợp vối xanh metylen tạo kết tủa màu xanh.

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch axit nucleic 0,1%, axit axetic 0,1N, dung dịch xanh metylen 0,1%

Các phản ứng chủ yêu dựa vào sai khác thành phần đường ARN chứa đưòng ribozơ ADN chứa đường dezoxiribozơ Hai loại đường khác khả phản ứng với số chất ocxin, điphenilamin, thuổc thử Schiff Sự sai khác chủ yếu độ nhạy phản ứng Vì tiêu chuẩn để xác định phản ứng dương tính hay âm tính chủ yếu là dựa vào thời gian xảy phản ứng.

Nguyên liệu hóa chất:

- Dung dịch ARN nấm men 0,1%, dung dịch ADN gan động vật 0,1%, HC1 IN,

NaOH 0,1N.

- Thuốc thử ocxin (xem mục 3.1.l.h)

- Chuẩn bị thuốc thử điphenylamin: hòa tan lg điphenylamin 100ml axit axetic đặc, thêm 2,75ml H2S04 đặc.

- Chuẩn bị thuốc thử Schiff: hòa tan 0,2g fucsin trong 0ml nưốc câ't nóng Làm lạnh, thêm từ từ dung dịch NaHS03 đến dung dịch có màu.

Thiết bị: Nồi cách thủy (10 0°C).

Cách làm:

- Phản ứng với thuốc thử ocxin:

Chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào ông I: lml dung dịch ARN 0,1%, ông II: lml dung dịch ADN 0,1% Thêm vào ống lml thuốc thử ocxin, lắc, giữ 15 phút nồi cách thủy sơi. Ơng I có màu xanh lục, thứ II cho màu nhạt.

- Phản ứng với điphenylamin.

Chuẩn bị hai ông nghiệm, cho vào ông I: lml dung dịch ARN 0,1%, ỏng 11:1 ml dung dịch ADN 0,1%, thêm vào ống

2ml thuôc thử điphenylamin, lắc đều, giữ hai ông nghiệm 10

phút nồi cách thủy sơi Ơng có chứa ADN chuyển sang mau xanh, ông chứa ARN cho phản ứng âm.

* Phản ứng Feulgen V Ớ I dezoxiribozơ.

Cho vào ống nghiệm lml dung dịch ADN 0,1%, thêm 5-6 giọt HC1 giữ phút nồi cách thủy sôi, làm lạnh, dùng dung dịch NaOH 0,lN đê điều chỉnh pH đến Thêm 2ml thuốc thử Schiff, xuất màu đỏ chứng tỏ có dezoxiribozơ. ARN khơng cho phản ứng này.

c) Thủy phân nhận biết thành phẩn

cấu tạo axit nucleic

Dưới tác dụng axit vô nhiệt độ cao, ARN bị thủy phân tạo thành bazơ purin tự nucleotit pirimidin. Có thể nhận biết thành phần đưòng pentozơ, axit photphoric và bazơ nitơ phản ứng đặc trưng.

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch ARN 0,1%, H2S 04 0% hoặc HC1 IN, HN03 đặc, HC1 đặc, dung dịch amoni molipđat 5%, AgNO;ỉ NH4OH, NaOH 1 N, dung dịch đồng sunfat

1%, NaHS03 bão hòa, florogluxm tinh thể. Thiết bị: Nồi cách thủy (10 0°C).

Cách làm: Thủy phân ARN: cho 10ml dung dịch ARN 0,1% vào bình nón dung tích 50ml, thêm 1 0ml H2S041 0% đật vào nồi cách t hủy sôi 45 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Dung dịch thủy phân nhận dùng để làm phản ứng tiếp theo.

tinh thể florogluxin Đun sôi dung dịch, xuất màu đỏ chứng tỏ có pentozơ.

- Phản ứng nhận biết H3P 4: lấy 0,5ml dung dịch thủy phân ARN, trung hòa amoniac Thêm 0,5ml HN03 đặc và 2ml dung dịch amoni molipđat Đun sôi, tạo thành kết tủa vàng amoni photphomolipđat.

- Phản ứng nhận biết bazơ purin: Cho vào ống nghiệm lml dung dịch thủy phân ARN, thêm dung dịch amoniac đến có phản ứng kiềm yếu Lọc đê nhận dung dịch trong, thêm 3ml dung dịch bạc nitrat amoniac Xuất hiện kết tủa purin không tan dung dịch amoniac muối bạc.

Cho vào ống nghiệm lml dung dịch thủy phân ARN, thêm NaOH IN phản ứng axit yếu giấy Congo Đun sôi, thêm 4-6 giọt dung dịch C11SO4 1% thêm cẩn thận từng giọt dung dịch NaHS03 bão hòa NaHS03 khử ion Cu2+ thành Cu* Ion Cu* tạo thành muổi đồng vói bazơ purin khơng hịa tan.

4.2 Định lượng axỉt nucleic

4.2.1 Định lượng ADN

a) Định lượng ADN bảng cách đo độ hấp thụ ánh sáng ở buúc sóng 260 nm

Nguyên tắc: Trong thành phần ADN chứa bazơ nitơ có khả hâ'p thụ ánh sáng vùng tử ngoại, cực đại ỏ

X = 260nm, độ hấp thụ tỷ lệ với nồng độ ADN.

Nguyên liệu: Dung dịch nghiên cứu (dung dịch ADN).

thì cần pha lỗng dung dịch ADN) Từ sơ đọc thu tính ra lượng ADN mẫu theo cơng thức sau:

c (ng/ml) = A260nm • 50 n trong đó:

c - nồng độ ADN

A260nm độ hấp thụ dung dịch ADN 260 nm 50 - hệ sô chuyên đổi ADN

n- sơ lần pha lỗng

Phương pháp đơn giản, nhanh, có hạn chê sơ đọc vê độ hấp thụ có thê bị ảnh hưỏng mẫu chứa ARN và protein Vì vậy, thực tê phương pháp thường được dung để định lượng mẫu ADN tinh khiết.

b) Định lượng ADN theo phương pháp Dise

Nguyên tắc: Khi đun nóng dung dịch ADN với thuốc thử điphenvlamin tạo thành phức chất màu xanh da trịi có độ hấp thụ ánh sáng cực đại ở X = 595nm.

Nguyên liệu hóa chất:Dung dịch ADN cần xác định hàm lượng, dung dịch ADN tinh khiết có hàm lượng 500 |ag/ml, HClO40,5N, TCA 5%, H2S045%, thuốc thử điphenylamin.

Thiết bị: Nồi cách thủy (10 0°C), máy so màu quang điện.

Cách làm: Cho vào ông nghiệm 2ml dung dịch ADN, 10ml HClOị 0,5 N (hoặc TCA 5%), lắc đều, đậy kín ơrig nghiệm đặt vào nồi cách thủy sôi 30 phút đê thủy phân ADN. Sau làm nguội dung dịch.

kính lọc sáng màu đỏ (X = 595nm) Từ sô đọc mật độ quang học thu được, dựa vào đồ thị chuẩn ADN tính lượng ADN trong mẫu.

Xây dựng đồ thị chuẩn ADN: Từ dung dịch gốíc ADN tinh khiết có nồng độ xác định tiến hành pha lỗng để có nồng độ 50, 100, 200, 300, 400 500|ig/ml Sau lấy từ nồng độ ra 2ml tiến hành thí nghiệm với dung dịch ADN mẫu ờ trên Dựng đồ thị tương quan mật độ quang học nồng <ỉộ ADN tương ứng.

Từ sô” đọc mật độ quang học thu dung dịch mÃu đơì chiếu vối đồ thị chuẩn ADN tính lượng ADN mẫu.

4.2.2 Định lượng ARN

a) Định lượng ARN bâng cách đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm

Nguyên tắc: Tương tự phương pháp định lượng ADN.

Nguyên liệu: Dung dịch nghiên cứu (dung dịch ARN).

Cách làm: hút lml ARN vào cuvet thạch anh đo độ hấp thụ ở X = 260nm Đôi chứng dung dịch dùng pha ARN (nếu sô đọc độ hấp thụ ánh sáng ống có ARN lón 1,0 cẩn pha lỗng dung dịch ARN ra)

Nồng độ ARN mẫu tính theo cơng thức sau:

c (|ig/ml) = A260nm 40 n

trong đó:

c - nồng độ ARN

A260nm độ hấp thụ dung dịch ARN 260nm 40 - hệ số chuyển đổi đổi với ARN

n sơ" lần pha lỗng

Phương pháp có ưu nhược điểm giơng như d ố i VÓI phương pháp định lượng ADN nêu mục 4.2 La.

bj Định lượng ARN theo phương pháp Meibaum

Nguyên tắc: Khi đun du ng dịch ARN với thuôc thử ocxin sẽ

tạo thành phức chất có màu xanh cây, có khả hấp thụ ámh sáng cực đại ỏ X = 670nm Cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng ARN dung dịch.

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch ARN cần xác định hàm lượng, dung dịch ARN tinh khiết có hàm lượng 500|ig/ml Thuốc thử ocxin (xem mục 3.1.l.h), H2S 04 10%, FeCl3 0,1% HC1 (đtặe):

Thiết bị: Nồi cách thủy (10 0°C), máy so màu quang điện.

Cách làm: Cho 2ml dung dịch ARN vào bình nón (V= 50ml) cơ nút nhám, thêm vào 1 0ml H2S 04 10%, đậy nút đặt vào n<ồi cách thủy sôi 30 phút, lấy làm nguội, thu được dung dịch thủy phân ARN.

Từ dung dịch thủy phân ARN lấy 2ml cho vào ổng nghiệm, thêm vào 2ml thuốc thử ocxin, lắc đặt vào nồi cáàch thủy sôi 20 phút dung dịch có màu xanh lá cây, làm nguội đến nhiệt độ phòng đo độ hấp thụ ánh sáng

ở X = 670nm (dùng kính lọc sáng màu đỏ).

Chương 5

Lipit

Lipit hợp chất hữu có tế bào sống khơ*ng hịa tan nước, tan dung môi không phâr C‘ực

như: clorofom, ete, benzen Do dùng dung môi này để chiết rút chúng khỏi tế bào.

Lipit phân thành 2 nhóm lớn: lipit dơn giản li]pit phức tạp (lipoit) Đại diện quan trọng lipit đơn giản la mờ , trung tính (triaxilglyxerol) Lipoit quan trọng phổ biến là lơxitin Tiếp theo giới thiệu số phản ứng định tính và định lượng đại diện quan trọng này.

5.1 Mõ trung tính (triaxylglixerol)

Mỡ trung tính este glixerin axit béo bậc cao T ùy theo thành phần axit béo phân tử mà mỡ trung tír.h có thể trạng thái lỏng rắn nhiệt độ bình thường.

5.1.1 Tính chất lý hố mơ

a) Tính tan

Cách làm: Chuẩn bị ỏng nghiệm sạch, khô, cho vào ông I; 2ml nước cất, ông II, III, IV, V, ống 2ml dung môi tương ứng ete, etanol, clorofom, benzen Thêm vào ông vài giọt díu lạc, lắc, quan sát sai khác độ hịa tan dầu lạc trong các lung mơi khác nhau.

b) Sự tạo thành nhũ tương

Mỡ khơng hịa tan nước, sau lắc mạnh mỡ với aước để*yên hỗn hợp lúc, mở lại tạo thành lớp nổi :rên bê mặt, nhiên có chất tạo nhũ tương (axit mật,

d\m% dịch xà phòng ) tạo thành nhũ tương mở tráng đục.

Hóa chất Dầu lạc, dung dịch xà phòng 2% mật động vật.

Cách làm: Lấy 2 ông nghiệm, cho vào ống 4ml nước cất, thêm vài giọt dầu, sau cho vào ông 0,5ml

dxinị dịch xà phòng 2% dung dịch mật, lắc mạnh 2 ông. Quan sát giải thích kết quả.

5.1.2 Phản ứng phân biệt ỉhành phẩn cấu tạo mõ

a) Phản úng tạo thành acrolein

Phản ứng dùng để chứng minh có gốc glixerin trong mỡ Khi đun nóng với chất lấy nước, gốc chuyến thành glixtTÌn tự Sau glixerin bị nước tạo thành anđehit không no acrolein, chất có mùi khét đặc biệt, dễ nhận biết.

CH2OH CHO

đ u n

CH + H20

II

CH, CHOH

CH2OH Glixerin

Phản ứng xẩy đun mỡ với kali bisunfat (KH.SOM hay natri bisunfat (NaHS04) có tác dụng lấy nưốc.

Những lipit khơng chứa glixerin (ví dụ sáp) kỉ ơng có phản ứng tạo thành acrolein.

Hóa chất: Dầu lạc, KHSO4 (kali bisunfat), dung iịech AgN03 amoniac.

Cách làm: Để vào ống nghiệm 2-3 giọt dầu lạc, thêm ít (khoảng 200mg) KHSO4, lắc đun nóng mạnh đến (CĨ khói trắng khét: acrolein tạo thành.

Lấy giấy lọc tẩm dung dịch AgN03 amoniac, hơ Víào miệng Ống nghiệm, đưa giấy vào sâu ống chỗ có khói bay ra, giấy có màu đen (phản ứng anđehit).

Làm lại thí nghiệm với mẫu sáp.

b) Phản ứng xà phịng hóa

Dưới tác dụng kiềm, mỡ bị thủy phân, tạo thành }Xà

phòng glixerin.

- Sự tạo thành xà phịng tan

Hóa chất: Dầu lạc, dung dịch KOH 0,5M etanol 50%

Cách làm: Cho 0,5ml dầu lạc vào bình nón dung tích 5)ưal, sau cho thêm 1 0ml dung dịch KOH etanol 50%, kluiấy và đun cách thủy khoảng 1 giò, chưa cạn lấy đun sôi đến khi cạn khô Lây sản phẩm ra, để nguội thêm 20-30ml ÌƯIỚC cất vào, lắc đểu Ta có dung dịch xà phòng, bọt tạo tỉành nhiều lắc mạnh.

• Sự tạo thành xà phịng khơng tan

Xà phịng khơng ta n muối canxi magie axit béiO,

Hóa chất'. CaCl2 1%, dung dịch xà phòng 2%.

Cách làm: Cho 2-3ml dung dịch xà phịng vào ơng nghiệm, thêm lml dung dịch CaCl2 1% tạo thành kết tủa không tan tr-orig nước.

c) Sự tạo thành axit béo tự do

Trong thí nghiệm (5.1.2.b) nêu q trình điểu chê xài phịng từ dầu mỡ Xà phịng mi axit béo Dưới tác dụng axit vơ đặc, axit béo giải phóng, khơng hịa ta n nước dễ dàng tách được.

Hóa chất: Dung dịch xà phòng 2%, H9S0| đặc, ete etylic, N;a()H 0,0 1%.

Cách làm: Cho vào bình nón 50ml dung dịch xà phòng 2%, th êm vài giọt H.,S04 đặc mơi trường có pH axit ("dùng giấy qùy đế thử pH) Dung dịch trở nên đục axit béo đuợe giải phóng Đun hỗn hợp đến sơi, axit béo lên, tạo th ành lớp bê mặt Tách riêng axit béo, hòa tan trong 5i?nl ete, lấy lml dung dịch cho yào ông nghiệm, thêm giọt phenolphtalein vài giọt NaOH 0,0 1% có màu hồng, thêm vài giọt dung dịch axit béo hòa tan ete, diung dịch màu.

c h2oh RjCOOK

CHOOC -R n + 3KOH

I ► CHOH I + RXOOK

CH2OH R;ịCOOK

Glixerin Xà phòng CH2OOC-R3

a) Xác định ch ỉ sô axit

Chỉ sô" axit mõ số mg KOH cần thiết để trung hòa

lượng axit béo tự có 1 gam mở.

Hóa chất: Dầu lạc, etanol 96%, KOH 0,1N

Cách làm: Cân 1 gam dầu lạc vào bình nón dung tích 50 -100ml, thêm 10ml etanol 96% để hòa tan axit béo tự Nếu dầu khó tan lắc cẩn thận hỗn hợp bình đun nhẹ trong nồi cách thủy, vừa đun vừa lắc Sau mỡ hịa tan, thêm vào bình vài giọt phenolphtalein 0,1% chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1N đến có mầu hồng nhạt.

Chỉ số axit tính theo cơng thức sau: X = A.f.5,6

trong đó:

A • Sơ" ml dung dịch KOH dùng để chuẩn độ f - Hệ sô" điều chỉnh dung dịch KOH.

b) Xác đinh ch ỉ s ố xà phịng hóa

Chỉ sơ" xà phịng hóa sô" mg KOH cần thiết để trung hỏa các axit béo tự axit béo liên kết chứa 1 gam mỡ.

Hóa chất: Dầu lạc, KOH 0,5N pha etanol 96%, HC1 0,5N, dung dịch phenolphtalein 0,1%.

Cách làm: Lấy 2 bình cầu đáy trịn bình nón, dung tích 50 - 100ml cho vào bình I (bình thí nghiệm) 0,5 gam dầu lạc, vào bình II (bình kiểm tra) 0,5ml nước cất Sau thêm vào mỗi bình 15ml dung dịch KOH pha etanol 96% Láp Ống làm lạnh vào 2 bình đun sơi nồi cách thủy khoảng 1 giị Phản ứng xà phịng hóa xem kết thúc khi dung dịch bình trở nên suốt.

5.1.3 Xác định số md

Khi xà phịng hóa xong, làm nguội dung dịch, thêm vào

bình vài giọt phenol-phtalein chuẩn độ dung dịch HC1 0,f)M lm l dung dịch KOH 0,5N tương ứng vối 28mg KOH

Lượng KOH (tính mg) dùng đê trung hòa tất axit béo gam dầu lạc là:

V / _\ _ (A - B).28

X (m g) = -a trong đó:

A - Lượng HC1 0,5N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra; B - Lượng HC1 0,5N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm; a - Khơi lượng dầu lạc tính gam

Trên sở xác định sơ xà phịng hóa sơ axit có thể

tính sơ este mở Chỉ sơ este SƠI mg KOH cần thiết

lie trung hòa axit béo liên kết với glixerin Do đó, số este

bằng hiệu số sơ xà phịng hịa số axit mỡ

Dựa sô liệu thu từ phép xác định tính hàm lượng glixerin, biết để giải phóng phân tử glixerin từ triaxylgixerin cần phân tử KOH

c) Xác định sỏ peroxit

Khi có oxi khơng khí axit béo có thành phần của

mơ, n h ấ t axit béo khơng no dễ dàng bị oxi hóa phần

tạo thành peroxit Hiện tượng xảy mỡ bị ôi hay bị khô. Việc xác định sơ peroxit dựa vào phản ứng sau: R — CH — CH — R' — COOH + 2KI + 2CH0COOH

I I

0 -

- ► R— CH — C H — R' — COOH + I2 + 2CH0COOK + H90

\ /

Lượng iơt giải phóng có thê chuẩn độ iu ng

dịch natri hiposunfit:

2 Na2s 20 + I2 = 2NaI + Na2S40 6

Theo lượng hiposuníìt cần để liên kết iơt giải phóng n , có

thể tính sơ" peroxit Chỉ số peroxit số gam iơt ỉỢe

giải phóng peroxit có 100 gam mõ

Hóa chất: Dầu thực vật, axit axetic đặc, clorofom timh khiết, dung dịch KI bão hòa (pha dùng ngay), dung dịich N a2S20 ,002N, dung dịch tinh bột 0,5%.

Cách m: Chuẩn bị bình nón dung tích 250ml, chc vào

bình I (bình thí nghiệm) gam dầu lạc, vào bình II (bình kiểm

tra) 2ml nước cất Thêm vào bình 20ml hỗn hợp axit acettic

đặc: clorofom (tỷ lệ 2:1 vể thể tích), ml dung dịch KI bão hịa, lắc đều, đậy nút đặt vào chỗ tốĩ 10 phút Sau thêm ẴOỉtnl

nước cất, vài giọt dung dịch tinh bột 5%, ch uẩn độ iơt giải pióỉtig

ra dung dịch N a2S20 ,002N đến m ất màu xanh.

Chỉ sô" peroxit tín h theo cơng thức:

v ( A - B ) k o , 0002538.100 A —

a trong đó:

A - Số ml N a2S20 dùng để chuẩn độ bình th í nghiện; B - Số ml N a2S20 dùng để ch uẩn độ bình kiểm tra;

k - Hệ số hiệu chỉnh dung dịch N a2S20 3;

0,0002538 - S ố gam iôt tương ứng vối lm l dung iịcch

Na2s 20 0,002 N;

a - Sô' gam dầu lầy để xác định. d) Xác định số iôt

Hóa c h ấ t: Etanol tuyệt đỗi 96%, dung dịch iôt 0,1N;

dung dịch tinh bột 1% Dung dịch N a2S20 , 1N, dầu lạc hoặc d/iu vừng.

Cách làm : Lấy hai bình nón, cho vào bình I (bình thí

nghiệm) 0,2g dầu lạc, bình II (bình kiểm tra) 0,2ml nước cất

Thêm vào bình 5ml etanol clorofom, sau thêm xác 5ml dung dịch iơt 0,1N Đậy kín bình, để vào chỗ tơi

15 phút Khi thịi gian hết chu ẩn độ hai bình N a2S20

0 ,lN đến màu vàng nhạt thêm vào hỗn hợp lm l

dung dịch tinh bột chuẩn độ tiếp dến m ất màu xanh Chỉ sỏ' iỏt tính theo công thức:

c _ ( A - B ) f o , 01269.100 a

trong đó:

B - Sơ ml N a 2S 20 30 ,lN dùng để chuẩn độ bình kiểm tra. A - Sô ml N a2S2O30 ,lN dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm

f - Hệ sô điêu chỉnh du n g dịch N a2S20 (nếu có)

0,01269 - S ốgam iơt tương ứng lm l N a9S2O30,lN

a - Lượng dầu lấy để xác định (tính gam).

5.2 Lipỉt

Lơxitin 5.2.1 Tách lơxitin từ lòng đỏ trứng

Lơxitin hòa tan tốt etanol nóng hỗn hợp etanoli: ete (tỷ lệ 2:1 theo thể tích) khơng tan axeton v'ì vậy dễ nhận lơxitin dùng etanol nóng để chiết lơxitin khỏi nguyên liệu, kết tủa lơxitin axeton.

Ngun liệu hóa chất: Lịng đỏ trứ n g gà, etanol tuyệt đô’1

hay 96%, dung dịch CdCl2 bão hòa etanol.

Cách làm: cho khoảng 1/5 - 1/6 lịng đỏ trứng gà vào cơc cố dung tích 50 100ml, thêm 10ml etanol nóng, dùng đũfi thủy tinh khuấy 10 phút, để yên lúc, lọc qua g iấ y lọc xếp (đã tẩm ướt etanol) vào ông nghiệm khô, n h ận

được dung dịch lọc suốt Nếu dung dịch đục cần lọc lại đ ể nhận dung dịch suốt có chứa lơxitin để làm th í nghiệm tiếp theo.

5.2.2 Môt số tính chất lơxitirv9

a) Sựtạo thành nhũ tương ìơxitin

b) Kết tủa lơxitin bàng axeton

Chơ từ từ lm l dung dịch lơxitin etanol vào ơng

nghiệm có chứa 5ml axeton, xuất kết tủa trắ n g lơxitin ứ n g dụng phản ứng để nhận lơxitin dạng bột khô

c) Kết tủa bàng CdCI2

Cho vào ống nghiệm khô lm l dung dịch lơxitin trong

etanol, thêm giọt dung dịch CdClọ, tạo thành kết tủa trắng

của phức chất lơxitin với CdClọ Colesterol dầu thực vật không cho phản ứng này.

5.3 Định lượng Lipit

Việc định lượng lipit thường dựa sở xác định khối

lượng nguyên liệu trước sau chiết rút lipit khỏi nguyên liệu dung môi hữu Bằng phương pháp trên, ngồi lipit

ra, có th ể có sơ" hợp chất khác n h vitam in ta n chất

béo chiết với lipit Tuy nhiên hàm lượng các tạp chất nhiều trường hợp không đáng kể, nên đối với th í nghiệm thơng thường, phương pháp nói vẫn đuợc chấp nhận

D ung môi thường dùng để chiết rút lipit là: ete etylic, benzen, hỗn hợp m etanol - clorofom hỗn hợp etanol - ete.

Có thể chiết rút lipit cách ngâm nguyên liệu vào dung môi tuần chỗ dùng máy Soklet Dưới sẽ gicii thiệu phương pháp dùng máy Soklet.

Máy Soklet: Máy Soklet gồm ba phận nối VỚI

bằng khớp nhánh (bảo đảm kín hồn tồn) là: bình cầu (bình đun), bình chiết ống sinh hàn

Cách làm: C hu ẩn bị túi bàng giấy lọc để đựng nguyên liệu: Giấy lọc cắt th n h m ản h hình chữ nhật, chiểu dài gấp 2,5

lần chiều rộng, chuẩn bị thành túi hình trụ có đường kính nhỏ hơn đưịng kính bình chiết, đáy túi khâu kín; có thể chuẩn bị túi dưới dạng túi gói thuốc Các túi giấy gói sau (tó được sấy khơ đến có khối lượng khơng đổi khối lượng: túi

được cân xác cân phân tích.

Cân xác (trên cân phân tích) gam ngun liệu đã được sấy khơ, nghiền nhỏ cối sứ, sau chun tồn 1>Ộ

vào túi giấy chuẩn bị trên, khâu kín gấp kin phía túi Cho dung mơi vào bình cầu đến 1/3 -1/2 thể tích bình Đặt gói ngun liệu vào bình chiết máy, làp bình chiết vào bình cầu Cho dung mơi vào bình chiết cho ngập gói ngun liệu, mức dung môi gần đạt đến phần ôVig

h ú t (xifon) bình chiết Lắp ống làm lạnh Ngâm nguyên liệu

trong dung môi vài giị Sau đặt máy vào nồi cách thủy để đun nóng dung mơi (với ete etylic khoảng 35 - 40°C) Đồng thòi cho nước lạnh chảy quay hệ thống làm

lạnh máy để làm ngưng tụ dung môi Tiếp tục đun

w (A -B ).IO O X (e> ° C

trong đó:

A - Khỏi lượng gói nguyên liệu trước chiết rút lipit (g); B - Khối lượng gói nguyên liệu sau chiết rút lipit (g); c - Lượng nguyên liệu lấy để xác định (g).

Chương 6

Vitamin

Vitam in hay cịn gọi sinh tơ bao gồm hợp chất hữu cơ phân tử thấp, có chất hóa học khác nhau, có hoạt tính sinh lý, cần đưa vào cơ th ể người động vật với lượng nhỏ để đảm bảo h o ạt động sống bình thường

Dựa vào tính tan chúng vitam in chia thành hai nhóm lón, là: Các vitam in hịa tan chất béo các

dung môi h ữ u bao gồm vitam in A, D, E, K axit béo

khơng no có hay nhiều nối đơi, Các vitam in hịa tan trong nưốc bao gồm vitam in thuộc nhóm B, c , H

Vì có chất hóa học khác nên loại vitam in có những phản ứng hóa học đặc trưng riêng Những phản ứng này được sử dụng để định tính định lượng vitamin.

6.1 Các phản ứng định tính vitamin

6.1.1 Các vitamin hòa tan chất béo

a) Vitamin A (Retinol)

Trong môi trường axit, vitam in A phản ứng với F e S tạo t.híinh hợp chất m àu xanh, chuyển dần sang màu hồng đỏ C hất t.iền vitam in A (carotin) cho ph ản ứng sản J)hẩm có màu xanh lục

Nguyên liệu hóa chất: Dầu cá (chứa vitam in A D),

íixit axetic đặc bão hịa F e S 4, H2S đặc.

Cách m: Cho vào ông nghiệm vài giọt dầu cá, thêm 5-10

giọt axit axetic đậm đặc có chứa F e S bão hòa 1-2 giọt

H9S đặc, quan s t màu - P hản ứng với H 2S 4

í í 9S đặc tác d ụng với vitam in A tạo th àn h sản phẩm

màư xanh tím khơng bền, sau thịi gian ngắn chuyển thành màu nâu đỏ.

N guyên liệu hóa chát: Dầu cá, H2S đặc, clorofom benzen

Cách m: Cho vào ông nghiệm khơ hai giọt dầu cá, 2ml

b<ìnzen clorofom, lắc cho tan Thêm hai giọt H2S đặc, lắc,

quan sát

b) Vitamin D (Canxipherol)

- P hản íừig với S b C l3

N guyên liệu hóa c h ấ t: Dầu cá 10% clorofom, dung

dịch SbCl3 21- 23% clorofom, anhiđrit axetic (CH3C )20

Cách m: Cho vào ông nghiệm khô - 5ml dung

dịch dầu cá, thêin vào - giọt anhiđrit axetic, lắc đểu và

thêm vài giọt SbCl3 Lắc quan s t x u ấ t màu vàng

- Phản ứng với a n ilin

Vitamin D môi trường axit tác dụng với anilin tao

th n h hợp chất có m àu đỏ đặc trưng

Nguyên liệu hóa chất: dầu cá, clorofom, anilin

Chuẩn bị thuốc thử anilin: Trộn anilin với HC1 đặc hoậc H2S đặc theo tỷ lệ 15 : 1.

Cách m: Cho giọt dầu cá vào ống nghiệm sạch, khô, cho thêm lm l clorofom vài giọt anilin, lắc đểu, quan sát tạo th n h th ể n h ũ nghiệm Đun sôi hỗn hợp phản ứng

trong 30 giây, dung dịch chuyển thành màu đặc trưng.

c) Vitamin E (Tocopherol)

- Phản ứng với H N 3

Vitamin E tác dụng với H N đặc tạo th n h o-tocopheril- quinon m àu đỏ m àu vàng đỏ

Hóa chất: V itam in E 0,15% etanol tuyệt đối hay trong butanol, H NO đặc.

Cách làm: Cho vào ông nghiệm vài giọt dung dịch vitamin E, sau thêm từ từ 8-10 giọt HNO3 đặc lắc nhẹ ống nghiệm.

Sau 1-2 phút q u a n s t đổi màu

- Phản ứng với FeCl3

Vitam in E có th ể khử FeCl3 th n h FeCl2 sau ion Fe2+

phản ứng vối o-phenantrolin để tạo thành ion Fe(C12H8N2)32f, do

đó dung dịch chuyển th n h m àu đỏ

CH ị

a-Tocopherol

+ FeCl3 + H ,0

+ FeCl2 + HC1

CH, OH

Tocopherylquinon

Cách làm: Cho vào ông nghiệm lm l dung dịch vitam in E, thêm vào lm l dung dịch o-phenantrolin 1-2 giọt FeCl3 Lắc quan s t m àu tạo thành

d) Vitamin K

Về m ặt cấu tạo, vitam in K có chứa 2-metyl-l,4- naphtoquinon (metinon), ph ản ứng vitam in K dựa trê n sỏ phản ứng với n h â n

o

Công thức câu tạo chung v itam in K 2-M etyl-l,4-naphtoquinon (metinon) - P hản Íừíg với anilin

0 n h2 o o h

Me ti non

(dạng oxi hóa) Anilin 2-Mety 1-3-phenyl a mi no Metinon

2-metyl-l,4- -1,4-naphtoquinon (dạng khử)

naphtoquinon

Hóa chất'. D ung dịch vitam in K 0,1% etanol tuyệt đồi,

thuốc thử anilin.

Cách m: Cho vào ống nghiệm lm l dung dịch vitam in K, thêm 6-8 giọt thuổc th anilin, lắc Hỗn hợp chuyển sang

màu đỏ.

- P hản ứng với xistein

Nguyên liệu hóa c h ấ t: Dung dịch vitam in K 0,1%,

xistein 0,03%, NaOH 5%.

Cách làm: Cho vào ống nghiệm lm l dung dịch vitam in K, thêm vài giọt xistein 0,03% 5-6 giọt NaOH 5%, lắc Dung

dịch chuyển thành màu vàng.

6.1.2 Các vitamin hòa tan nước

a) Vitamin B1 (Tiamin)

- Phản ứng với a xit dkLZobenzensunfonic (thuốc th diazo)

Vitamin Bị phản ứng với axit diazobenzosunfonic tạo

thành hợp chất có màu da cam hay màu đỏ.

Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch vitam in Bj, thuôc thử diazo (xem mục 1.3.5), NaOH 10%.

Cách làm: Cho vào ống nghiệm lm l thuốc thử diazo, thêm

q u an s t m àu (m àu vàng chuyển sang da cam chuyến sung màu đỏ)

- Phản ứng tạo thảnh tiocrom.

Trong môi trường kiềm, tác dụng kali ferixianua K*[Ke(CN)6], tiam in bị oxi hoá thành tiocrom Hợp chất p h t huỳnh q u an g có màu đặc trưng ánh đèn tử ngoại P h ả n ứng xảy sau:

N guyên liệu hóa c h ấ t: Dung dịch vitam in Bị 1%, NaOH 10%, K3[Fe(CN)6]l%, cồn izobutylic

Cách m: Cho vào nghiệm 20 giọt dung dịch vitam in Bị, thêm 10 giọt NaOH 10% giọt K3[Fe(CN)6] 1%, lắc đều, s a u để yên, hỗn hợp ông tạo th n h hai lớp ngăn cách Để ông nghiệm ánh sáng m ặt tròi án h đèn tử ngoại, q u a n s t tạo th àn h huỳnh quang Giải thích kết

nhận được.

b) Vitamin B2 (Riboflavin)

- P hản ứng k h ử

Riboflavin tồn dạng oxi hóa dạng khử Ở dạng khử

có tên lơclavin khơng màu dễ bị oxi hóa thành riboflavin.

Cl + K3[Fe(CN)J + NaOH

CH2

c h3

+ K4[Fe(CN)6] + NaCl + H20

H (C N N s CH2—CH2OH

Nguyên liệu hóa chát: Dung dịch riboflavin 0,015% (guừ trong tối), HC1 đặc, kẽm kim loại.

Cách làm: Cho vào ông nghiệm lm l dung dịch riboflavin, thêm 10 giọt HC1 đặc bột kẽm, lắc nhẹ quan sá t hiện tượng (khí hiđro bay ra, màu chuyển dần từ vàng tang xanh lục, sau thành hồng cuổi màu Sau mộ lú c bê m ặt dung dịch lại có màu vàng).

CH2-(C H O H )3- C H 2OH

+ Zn + HC1

h3c

CH2- (CHOH); - CH.OH

+ ZnCỊ

Ạ

- Phản ứng với A g N 3

Trong mơi trường tru n g tính hay axit yếu (pH = 6,5 - 7,2), riboflavin p h ản ứng với A g N tạo th n h hợp chát m àu lồing

hay đỏ.

N guyên liệu hóa chất: Riboflavin 0,015% (giữ tô>i),

A g N 30,l% (bảo quản lọ nâu)

Cách làm : Cho vào ống nghiệm lm l dung dịch riboflivitn, thêm 0,5ml A g N 3, qu an sát x u ấ t màu hồng hoậc (đỏ

Cj Vitamin (Axit nicotinic, vitamin pp hay nicotinamit)

- P hản ứng với đồng axetat

Trong môi trường axit yếu, axit nicotinic phản ứng vói (('H.ịCOO^Cu tạo th àn h kết tủa đồng nicotinat, kết tủa có màu xanh đặc trưng:

COOH

+ CH3COOH + (CH,COO)2Cu

Axit nicotinic

Nguyên liệu hóa chất'. Dung dịch axit nicotinic 1%,

CH ịCOOH 15%, (CH3COO)2Cu

Cách m: Cho vào ông nghiệm 20 giọt axit nicotinic

1%, thêm 10 giọt CH3COOH 15%, đun hỗn hợp đến sôi, thêm

10-20 giọt (CH3COO)2Cu Q uan s t hình th n h kết tủa với m àu đặc trưng

- Phản ứng với N aO H

Khi đun nóng nicotinam it với NaOH tạo natri m cotinat giải phóng N H 3:

Nguyên liệu hóa chất: N icotinam it dạng bột, NaOH 40%

Cách m: Cho bột nicotinam it vào ống nghiệm, thêm 2ml H20 lm l NaOH 40%, đun sôi p h ú t nồi cách thủy, mùi đặc biệt xuất Dùng m ẩu giây quỳ đặt miệng ống nghiệm, quan s t chuyến m àu giấy thị

c o n h í ^ ì r co o N a

L Jj + NaOH - ► L JJ

ISr N

+ n h3

d) Vitamin B6 (Piridoxin)

- Phản ứng với FeCl3

Dưới tác dụng FeCl3, piridoxin sè tạo thành phức chất có m àu đặc trưng

N guyên liệu hóa ch ấ t: Dung dịch piridoxin 1% PeCl3

5%.

Cách m: Cho vào ông nghiệm lm l piridoxin 1%, thêm

giọt FeCl3, lắc đểu Quan sát xuất màu phức châ't tạo thành.

e) Vitamin c (Axit ascocbic)

Vitam in c hợp chất không no, p h ân tử có hai nhỏm enol có khả phân ly cho ion H \ có tính axit có

tên axit ascocbic Vitamin c tồn hai dạng: dạng oxi

hóa dạng khử theo phản ứng sau:

c = 0 c = 0

H O - c \ + 0 = c \

II ọ ~2H ^ II ộ

H O —c I ^ = C I

I +2H+ I

H C — H C— *

I I

HO—ộ — H HO—ộ — H

T T

c h2oh ch2oh

Dạng khử D ạng oxi hóa

Vitam in c có nhiều rau, hoa Nó tham gia tích

cực vào q trìn h oxi hóa - khử Có thể tiến hành định tính

và định lượng vitam in c dựa vào tính chất khử nó.

hứa t r ị cao xuống dạng hóa trị th ấp như: kali ferixiamua [K aFe*(CN)6], xanh metylen, d u ng dịch iôt

- Phản ứng k h K ‘ịFe(CN)6

A xit ascocbic khử K3Fe(CN)6 th n h K4Fe(CN)6, sau K.4Fe(CN)6 tác dụng với Fe3* tạo th àn h hợp châ't F e4[Fe(CN)6]3 có m.àu x an h biển đến xanh Phản ứng xẩy sau:

c=0 c =0

HíO - c \ = c \

II II

HO — c

I

H C —

I

H O - C - H H O - C - H

+ 2K3Fe(CN)6 _^ I I + 2K4Fe(CN)6

+ 2KOH H C— ' + 2H20

c h.2o h c h 2o h

iDạn.g khử Dạng oxi hóa

3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 = F e4[Fe(CN)6]3 + 12 KC1 (Xanh nước biển)

N guyên liệu hóa chất:Y)\ing dịch vitam in c 0,1%, K;3Fe(CN )6 1%, KOH 5% F eC l3 1%,x a n h m etylen 0,01%, HC1 10%, d u n g dịch iôt 0,01 N, N aO H 5%

Oách m: Cho vào ông nghiệm 2ml dung dịch vitam in c , gi<ọt d ur.g dịch KOH 5%, lm l d u n g dịch K3Fe(CN)6 1%, lắc m ạnh h ỗ n h»ợp ống Sau th ê m vào nghiệm 5-8 giọt HC1 10% V'à 0,5ml d u n g dịch F eC l3, lắc nhẹ Q uan s t x u ất

k ế t tủ a màu xanh biển xanh cây.

- Phản ứng với iôt

Cánh m: Lấy hai ông nghiệm, cho vào ống I: 2ml dun& dịch vitam in c , ông II: 2ml nước cất Sau thêm vào cYntf

giọt dung dịch iôt ,01N, lắc Quan sát, giải thích sai khác hai ông.

- Phản ứng với xa n h m etylen

N guyên liệu hóa chất: Dung dịch vitam in c 0,1%, dung

dịch xanh metylen 0,01%, NaOH 5%

Cách làm: Lấy hai ống nghiệm, cho vào ống I: lm l dung

dịch vitam in c , ống II: lm l nước cất Sau thêm vào ỗng

1-2 giọt xanh m etylen 2-3 giọt NaOH 5% Lắc quan

sát màu hai ống N ếu khơng có thay đơi màu, đặt Cíi 2

ống nghiệm vào nồi cách th ủ y 37-40°C, quan s t m àu dung

dịch ống nghiệm sau vài phút Giải thích kết quả.

6.2 Định lượng vitam in

6.2.1 Định lượng vitamin c theo phường pháp chuẩn độ

N guyên tắc: V itam in c có thể khử dung dịch iơt, dựa vào

lượng iơt bị khử vitam in có mẫu, suy hàm lượng

vitam in c

N guyên liệu hóa chất: Lả thìa là, HC1 5%, dung dịch

I2 0,01 N, dung dịch tinh bột 1%.

D ụng cụ: Cốì chày sứ, bình định mức ơng đong

(V = 50ml), bình nón (V = 100ml), buret.

12 C ỏ t i n h b ộ t l m c h ỉ t h ị m u ( c h o - g i ọ t t i n h b ộ t % v o

bì nh chứa v itam in C) Chuẩn độ đôn bắt đầu xuất màu xainh dừng lại

Hàm lượng vitam in c mẫu (theo phần trăm )

tíỉnb cơng thức sau:

x m = V-Vị-0-00088-100

v2.a

tr o n g đó:

V - Sơ ml dung dịch iôt 0,01N dùng để chuẩn độ

V ] - T h ể tích tống sơ" dung dịch mẫu (50ml) V2 - T h ể tích m ẫu lấy để xác định (20ml)

a - Sô gam nguyên liệu dùng để chiết vitam in c (5g)

0,00088 - So gam vitamin c tương ứng với lm l dung dịch

iôt 0,01N.

6 2.2 Định lượng vitamin A

N guyên tắ c: Khi có m ặt anh iđrit axetic, vitam in A tác chạng với angtim on clorua (SbCl3) tạo th n h phức chất m àu Xianh có khả n n g hấp th ụ án h sáng m àu đỏ Cường độ màu chung dịch tỷ lệ với nồng độ viatm in A có mẫu

N guyên liệu phương p h p: Dầu cá, a n h iđ rit axetic, chorofom, SbC l3 bão hòa clorofom

L)ụng cụ th iết bị: Bình định mức (V= 25ml 50ml), niiáy so m àu q u a n g điện

Cách làm : Cho 2,5ml dầu cá vào bình định mức có dung

tí«ch 25ml, hịa ta n dầu cá clorofom và đưa th ể tích dung

dịịch lên 25ml, lắc Từ dung dịch hút lm l cho vào

sẽ xu ất hiện, thêm 4ml SbC1.3 bão hòa clorofom, lắc nhẹ, sau 10 giây đo độ hấp th ụ ánh sáng vùng đỏ (dùng SbCl3 bâo hòa clorofom cho ống đốỉ chứng)

Xây dựng đồ thị chuẩn vitamin A: Cho 10ml dầu cá tiêu chuẩn có nồng độ 5.000 đv/ml vào bình định mức dung tích 50ml, bơ sung thêm clorofom để đạt thê tích 50ml, lắc đểu Từ dung dịch (1.000 đv/ml) lấy thể tích 100, 200, 300, 400 500|il cho theo thứ tự tương ứng vào ông nghiệm đánh số I, II, III, IV V, bổ sung clorofom vào ơng cho tích cuối lm l, sau thêm an h iđ rit axetic, SbCl3 và đo m ật độ quang học Vẽ đồ thị tương quan m ật độ quang học nồng độ vitamin A

Chương 7

Hocmon

Ngàv hocmon coi chất nhóm tê b o tạo để tác động lên nhóm tê bào khác cốìch điểu hịa liên kết trao đổi ch ất thể Tuy vậy, cáich tác động hocmon đến trao đổi ch ất khác với chê

táuc động enzim vitam in, chúng không tham gia vào

t h n h phần p h ân tử enzim vitam in Khác với e n zim , hocmon không tham gia trực tiếp vào phản ứng h ó a học, mà vai trị điểu hịa alosteric, nghía làm thiay đổi cấu hình khơng gian p h ân tử

Hocmon có chất hóa học rấ t khác n h a u hoạt động n ổ n g độ r ấ t thấp, cần lượng nhỏ ( M - 10 '7 M) thiể tác dụng sinh lý

Trong thể người động vật, hocmon tạo bơi m ột loạt mô đặc biệt như: tuyến giáp trạn g , tuyến thượng thiận, tuyến tụy, tuyến yên (hypophys), tuyến sinh dục H-ocmon động v ật có tính đặc hiệu rõ rệt

Theo ch ất hóa học, hocmon động v ật chia th àn h

bíĩi nhóm:

- Hocmon dẫn xuâ't colesterol (hocmon steroit) - Hocmon dẫn x u ất axit am in

Thực vật có khả tổng hợp hocmorn Cac hocmon thực vật điển hình ch ất điều hòa nội sinh, co vai trị quan trọng nhiều q trình sơng thực vật như: sinh

trưởng, phân chia, biệt hoá tế bào, q trình chín, lão ho;á nơ

Tuy nhiên hocmon thực vật có tính đặc hiệu tác d ụ n g thâp, hocmon tham gia nhiều trình sinh lý, thường C) ú c

dụng trái ngược làm tăng tác dụng hocmon klhá:.

Các hocmon thực v ật phân th àn h nhóm : - Dẫn x u ấ t indol

- Giberelin (có câu trúc tetratecpen) - Xitokinin (có cấu trúc gần với adenin) - Dẫn suất axit abxixic.

- Etilen (được hình thành trình trao đổi metionin).

Dưới giói thiệu số ph ản ứng định tính củia

sơ" đại diện nhóm hocmon nói phương p h p íịnh

lượng chúng.

7.1 Hocmon động vật

7.1.1 Hocmon steroit

Ở động v ật người, hocmon steroit tạo r;a < vỏ

tuyến thượng thận tuyến sinh dục.

a) Các phẩn úng định tính coctizon

Coctizon glicococticoit tạo vỏ tuyến tỉhiợng

thận Nó có vai trị quan trọng điểu hịa trao đổi sacairi và

protein.

Nhò có m ặt của các nhóm cacbonyl, coctizon có thê phản

ứ ng với phenylhidrazin tạo th n h hidrazon ozazon, khử c i r f thành Cu*:

CH9OH

I

N guyên liệu va hóa chát: Chê phẩm coctizon - axetat

Chuẩn bị dung dịch phenylhidrazin: hòa tan 0,1 gam phenylhidrazin vào 100ml hỗn hợp H2S đặc nước làm lạnh, tỷ lệ 1:1 theo thể tích (dung dịch chuẩn bị trước khi diàng).

M etanol, thuốc thử Fehling (dùng định tính đưịng k h , xem mục 3.1.1.b)

Cách làm:

- Phản ứng với ph en ylh id zin su n p h a t

Hòa tan lm g coctizon - axetat vào lm l metanol, thêm vào ô n g nghiệm 5ml dung dịch phenylhidrazin su n p h at đun hỗn hựp nồi cách thủy Qua vài phút, màu vàng xuất sự t o th n h phenylhidrazon sau ozazon, nhờ nhóm caicbonyl coctizon.

- P hản ứng với thuốc th F ehling

Nguyên liệu hóa chất: C hế phẩm deoxicocticosteron -

axetat, H2S đặc, clorofom.

Cách làm: Hòa tan 2mg chê phẩm deoxicocticosteron -

axetat vào ml H2S đặc, thêm vào hỗn hợp l,5 m l nước, lác

m ạnh, bổ sung l,5m l nước lại lắc m ạnh Hỗn hợp ống nghiệm có màu tím đỏ Làm lạnh hỗn hợp thêm 3ml clorofom lắc đều; lốp hỗn hợp có màu vàng, cịn lớp

trên có màu xanh lục.

7.1.2 Hocmon peptit protein

ở động vật, hocmon tạo tuyến yên và tuyến tụy, chúng tham gia vào q trình trao đơi saearit, điểu hòa lượng đường huyết.

Các phẩn útig định tính insulin

Insulin protein kiểm, có khôi lượng p h ân tử thấp

(5800 dalton) gồm 51 gổc axit amin, có tác dụng điều hịa, làm

giảm lượng glucozd máu.

Hóa chất: Dung dịch insu lin (trong ampul), NaOH ,1%, CH3COOH, thuốc thử phản ứng biure, thuốc thử Folin

Cách làm:

- Phản ứng với NaOH

Cho vào ống nghiệm 10-15 giọt dung dịch in su lin, thêm vào ông nghiệm giọt dung dịch NaOH , 1% đến xuất hiện kết tủa trắng Kết tủa hòa tan lại thêm axit axetic vào hỗn hợp đến pH = 2,5 - 3,5.

- Các p h ả n ứng nhận biết chất protein insulin

Làm phản ứng biure, phản ứng với thuốc thử Folin (xem phần protein, mục 1.3.1 1.4.2.b).

102

Oại diện nhóm tiroxin adrenalin Các hocnon tạo ỏ tuyến giáp trạ n g vỏ tuyến

thượig thận.

riroxin tống hợp ỏ tuyến giáp trạng, adrenalin (lược tạo vỏ thượng thận

7.1.3 Hocmon lả dẫn xuât axit amin

riroxin có chứa phân tử bốn ngun tử iơt Khi bị oxi hóa, iro x in tạo th n h axit tetraiơtaxetic có vai trị xúc tác qiá trìn h oxi hóa

Adrenalin (cịn gọi epinephrin) có tác dụng kích thích q trình p h ân giải glicogen làm tăng lượng đường máu

Adrenalin dễ dàng bị oxi hóa mơi trường tru n g tính kiàm, tạo th n h sản phẩm tham gia tích cực vào q trìn h oxi hóa tro n g thể

Adrenalin có tính khử, có khả năn g khử sơ" ion kim

loại t i hóa trị cao xuống dạng hóa trị thấp

Tiroxin

OH

a) Phản úng tiroxin

Nhận biết tiroxin b àn g cách th ủ y phân tách axit iôthiđrtc (HI), chuyên th àn h dạng iôt tự do, iơt hịa tan clorofom, clorofom có m àu tím đặc trưng

Ngun liệu hóa chất: C hế phẩm tireodin chứa tiroxm

được chuẩn bị sau: tuyến giáp trạng đại gia súc như

trâu, bò sau tách ra, loại mõ, sấy khô nghiền nhỏ;

H N 03đặc, KIO3 1%, clorofom

Cách làm: Cho vào ông nghiệm khoảng 0,5g tireodin, thêm

10 giọt HNO3 đặc Tiến hành thủy phân cách đun cẩn thận

(tránh tạo bọt) 1-2 phút Sau thêm vào hỗn hợp 20 giọt

KIO3 1%, lắc làm lạnh KIO3 oxi hóa HI giải phóng iỏt

tự do:

5HI + KIO3 + HNO3 = KNO3 + 3H20 + 3I2

Thêm vào ông nghiệm l-2m l clorofom lắc mạnh Sau

để lắng, lớp clorofom (phía dưới) có màu tím (do iơt tạo nên).

b) Các phản ứng định tính adrenalin

Nguyên liệu hóa c h ấ t: Dung dịch adrenalin (trong

ampul), FeClo 3%, NH4OH 10%, KIO3 1%, CH3COOH

H3PO410%

Thuốc thử diazo (gồm axit sunphanilic 1%, N aN 02 5%, Na2C 10% chuẩn bị riêng rẽ).

Cách m:

- Phản ứng với FeCl3

- P hản ứng với kali iođat

Cho vào ống nghiệm 0,5m l adrenalin, thêm vào lm l

K Ỉ O 1%, 10 giọt C H3COOH H3P 04 10% đun nhẹ hỗn

hạp đến 60-65°C, hỗn hợp có m àu tím đỏ - P hản ứng với thuốc th diazo

Cho vào ông nghiệm lm l dung dịch axit sunphanilic, lm l N a N 5%, ml dung dịch adrenalin lm l Na2C 10%, lắc đêu, dung dịch có màu đỏ.

c) Định lượng adrenalin

Phương pháp dựa việc xác định m ật độ quang học của sản phẩm (màu xanh xuất hiện) adrenalin tác dụng với thuôc thử Folin.

N guyên liệu hóa chất: Dung dịch ch uẩn adrenalin có

nồng độ 0,04m g/m l (được chuẩn bị bình đựng mức có dung

tích 25ml) Na2C 03 10%, thuốc th Folin (xem p h ần phụ lục)

Dụng cụ thiết bị: bình định mức (V = 25ml), máy so màu

quang điện.

Cách làm : L ấy ống nghiệm , cho vào ống I: 0,5ml dung

(ỉịeh adrenalin chuẩn (0,04mg/ml), ống II: 0,5m l dung dịch nghiên cứu (dung dịch adrenalin chưa biết nồng độ) Sau đó thêm vào ơng ml N a2C 10% 0,25m l thuốc thử Folin (tã pha loãng hai lần, lắc Màu xanh xuâ't đạt cường (tộ cực đại sau phút Thêm vào ống 2,25m l N a2C 10% và (to màu dung dịch m áy so m àu quang điện, dùng kính lọc màu đỏ Làm ống đốì chứng với nước cat

Tính kết quả:

trong đó:

c - Nồng độ adrenalin dịch chuẩn.

c„- Nồng độ adrenalin dịch mẫu nghiên cứu.

E - M ật độ quang học dung dịch adrenalin chuẩn. Ex- M ật độ quang học dịch nghiên cứu.

Trong trường hợp cần th iết tính hàm lượng

adrenalin lOOg mẫu (mg%)

7.2 Hocmon thực vật

7.2.1 Các hocmon dẫn xuất indol

Nhóm hocmon thường gọi auxin hocmon sinh trưởng Đại diện quan trọng nhóm axit p - indolaxetic (IAA) Trong thực vật LAA có th ể tồn dạng tự dạng liên kết vối glucozơ peptit; IAA có thể cịn gặp axit indolpiruvic (IPA) số dẫn xuất khác.

Nguồn nguyên liệu giàu IAA phần non hạt của cây (như hạt ngô).

COOH

COOH CO

H

A xit p-indolaxetic (IAA)

H

Có th ế phân biệt n h an h chóng IAA chê phẩm nhờ JAA có p h át huỳnh quang ánh sáng tử ngoại

hoặc qua sản phẩm có màu IAA phản ứng với sơ' thuốc

th hóa học Cũng kiểm tra hoạt tính IAA thử nghiệm sinh học

n) Thu nhận auxin tơng sơ có chứa IAA từ hạt ngô

H ạt ngô sau phơi khô nghiền nhỏ 100 gam bột (tược ngâm với axeton 50% nhiệt độ thấp (0-4°C) Sau lọc thu lấy dung dịch lọc Rửa chất bột (bã lại) 200-300ml axeton 50%, lọc, thu lấy dung dịch Đô chung clung dịch lọc với kết tủa protein từ dung dịch cách th ê m tinh thể NaCl vào dung dịch theo tỷ lệ 20 gam NaCl/100ml dung dịch Tiếp theo, tách lớp axeton khỏi dung dịch mi nhị phễu chiết tiếp tục chiết auxin từ dung dịch muối b ằ n g cách lắc vài lần với axeton 100% (mỗi lần 50 - 100ml axẽton) Đố chung tất nước chiết axeton với nhau, lọc cho bay tr ê n nồi cách thủy (<50°C) Lắc vài lần hỗn hợp chất lỏng lại với ete etylic, th u gộp nưỏc chiết ete Dung dịch th u sau loại ete nồi cách thủy chế phẩm auxin có chứa IAA dùng cho th í nghiệm

b) Các phản útig màu IAA

- P h ả n ứng X ankovski

IAA tác dụng vỏi thuốc thử X anpe Xankovski (gọi tắ t

thuốc thử Xanpe) tạo th n h sản ph ẩm m àu đỏ Với thuốc thử

này axit imdolpiruvic (IPA) cho sản phẩm m àu m ận chín Có thể ứ ng dụng phản ứng để định lượng auxin

HC1 35% H2S 35%; trước dùng trộn lm l FeCl3 0,5M

với 50ml HC1 35% H2S 35%.

Cách làm: Lấy ông nghiệm, cho vào ông I: lm l IAA, ống

II (ông đối chứng); lm l nưốc cất Thêm vào ông 2ml thuốic thử Xanpe, lắc Dung dịch có màu đỏ sau khoảng 30 phút (tể ỏ nhiệt độ phòng Nếu mẫu thử IPA dung dịch có màu mận chín, cịn chế phẩm auxin tổng sổ* màu từ đỏ tới mận chín.*

- P hản ứng Eclich

N guyên liệu hóa chất: Thuốc thử Eclich (dung dịch p-

đim etylam inobenzanđehit 1% HC1 IN); chế phẩm LAA

hoặc auxin tổng số

Cách làm : Lấy ống nghiệm Cho vào ống I: lm l auxin,

Ống II (ống đôỉ chứng); lm l nước cất Thêm vào ống 2ml

thuốc thử Eclich, lắc Dung dịch có màu đỏ tía sau khoảng 10 phút để nhiệt độ phòng Phản ứng nhạy phản ứng với thuốc thử Xanpe, màu hỗn hợp nhạt dần sau 10 phút trở đi.

c) Định lượng IAA bàng phương pháp hóa học

N guyên tắc: Phương pháp dựa trê n việc xác định cưòng (tộ

m àu đỏ sản phẩm tạo thành IAA tác dụng với thuốc thử Xanpe phản ứng Xankovski Sản phẩm có khả năng hấp thụ m ạnh ánh sáng bưốc sóng 530nm

Nguyên liệu hóa chất: Mẫu nghiên cứu chứa IAA; Dung dịch IAA chuẩn gốc (0,01%); Thuốc thử Xanpe (xem phẩn 7.2 l.b).

Cách làm: Lấy ông nghiệm Cho vào ống I: lm l dung dịch mẫu nghiên cứu, vào ông II (ông đôi chứng); lm l nước cất Thêm vào ông 2ml thuốc thử Xanpe Lắc đều, để nhiệt độ phòng 30 ;>hút Khi thời gian hết, xác định cưòng độ m àu máy

quang phố bước sóng 530nm máy so m àu VỚ I kính

lọc màu lục Đổì chiếu giá trị m ật độ quang học mẫu thí nghiệm với đồ thị chuẩn để tính hàm lượng IAA lm l dung dịch nghiên cứu, từ tín h hàm lượng % IAA nguyên liệu

Dựng đồ thị chuẩn IAA: Từ dung dịch IAA chuẩn gốc, chuin bị dung dịch IAA có nồng độ pha loãng khác nh au chứ* lượng IAA tương ứng là: 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 |ig/ml Tiến h àn h p h ả n ứng m àu với dung dịch chuẩn với m ẫu ngh ên cứu Dựng đồ thị biểu diễn tương quan m ật độ q u aig học nồng độ IAA

7.2.2 Gibereíin

Giberelin nhóm chất điều tiết sinh trưởng thường có m ặt trorg Giberelin tác động không giống auxin thường titơrg tác với auxin tự nhiên n h â n tạo Đại diện quan trọrg nhóm axit giberelic (GA3) Axit giberelic tương đổi lễ tan nước, có nhiều p h ận p h t triển ciiacây (như h t nảy mầm)

o

c h3 o^ o h c h2

Có thể nhận biết axit giberelic nhị có khả năng

p h át huỳnh quang màu vàng n h ạt ánh đèn tử ngoại Cũng xác định hoạt tính GA3 thử nghiệm sinh học

a) Chiết giberelin từ mô thực vật

- Phương pháp th ứ nh ấ t

Nghiền lk g mô thực vật (hạt lúa nảy mầm) ngâm với

1,5 lít hỗn hợp axeton / nước (theo tỷ lệ thể tích 85/15) 24 giò 0°c Sau lọc hỗn hợp, thu lấy dịch lọc trộn dịch lọc

vói 100 gam than hoạt tĩnh Lắc hỗn hợp máy lắc vài

giờ, sau thu lấy than hấp phụ giberelin cách lọc hỏn

hợp qua phễu Buchner Chiết rút giberelin từ bột than vài lần

bằng etylaxetat (mỗi lần 50 - 100ml) Sau lọc, nước chiết

ety lax etat được cho bay tới lúc thể tích cịn lại 10 - 15ml

C hế phẩm thu dùng cho thử nghiệm tiếp theo. - Phương pháp thứ hai

Nghiền lk g mô thực v ật ngâm với lít nước cất

chỉnh pH tới 3,5 HC1 vài giò Sau gạn bỏ nước, chiết giberelin etylaxetat cách ngâm mơ dung mơi qua đêm nhiệt độ 0°c Sau lọc, nưóc chiết etylaxetat để bay (trong chân không nồi cách thủy

(<50°C) th ể tích cịn lại 10 - 15ml C hế phẩm thu

được dùng cho thí nghiệm tiếp theo.

b) Tách giberelin nhận biết GAP bàng sác ký giấy

Nguyên liệu hóa chất: chê phẩm giberelin (xem mục 7.2.2 a); giấy sắc ký W atm an số 1; dung môi chạy sắc ký (n- b u tan ol: amoni hiđroxit 1,5N, tỉ lệ 3:1 theo th ể tích; axit Slunfuric 70%

D ụng cụ thiết bị: bình sắc ký loại nhỏ (bocal kích thưỏc X õOcm); đèn tử ngoại (loại để khử trùng)

Cách m : c ắ t giấy W atm an sô' th n h dải có chiều rộng 2<cm, chiều dài 45cm Đánh dấu điểm xuất p h át giấy c h ấm lên 0,1 nil chê phẩm giberelin (chia làm nhiểu lần) D ùng phương pháp sắc ký lèn: đổ vào bình sắc ký 50 - 60ml

chung mơi, treo gìắy bình nhờ móc xun qua n ú t cho

híệ thơng cân vài Sau cách đẩy móc xuống ta n h úng đầu giấy vào dung môi Quá trìn h sắc ký kết th ú c dung môi ngấm lên gần tới mép giấy Tiếp lấy giấy ra, hong khơ (có thê sấy luồng khí nóng) Khi gi khơ, p h u n giấy dung dịch axit sunfuric, soi diưới đèn tử ngoại, chỗ có phát huỳnh quang màu vàng nhạt là a)KÌt giberelic

c) Xác định hoạt tính giberelin thử nghiệm sinh học

Hoạt động giberelin n h ậ n biết nhò tác dụng tăn g si nh trương p h ậ n xử lý giberelin

Nguyên liệu hoá chất: dung dịch axit giberelic (GA3) giberelin đó, vối nồng độ lO^ig/ml có chứa T\ween-20 (chất làm tăng độ bám dính) vối nồng độ 0,01%; h t gỉtơng đậu côve hay h t giông dưa chuột

trên mầm chưa bắt đầu kéo dài Ta nhỏ GA3 (hoặc một giberelin khác) trực tiếp lên chồi Sau 48 giờ tiến hành đo độ dài trụ mầm so sánh với đối chứng (nỉững cây không xử lý giberelin).

Thử nghiệm tương tự tiến hành với dưa chuột.

c ác chất thực vật thứ sinh

Ở thực vật, protein, sacarit, lipit, vitam in cịn có n h ữ n g hợp chất khác gọi chất thực vật thứ sinh. N hóm hợp chất thường có m ặt thực vật với hàm lượng th ấ p , chúng có vai trị quan trọng trao đổi chất ở cẵ*y Một sô" chất thực vật thứ sinh tích tụ thực vật v i hàm lượng đáng kể (như ankaloit, cao su, tinh dầu), gây nên kiiểu trao đôi chất đặc trưng lồi Nhiểu chất thuộc nìhóm này, ỏ mức độ đáng kể, định phẩm chất thực phẩm vià m ùi vị sản phẩm khác ch ế biến từ thực vật Nhiều c h ấ t dùng công nghiệp y học.

Thuộc nhóm chất thực vật thứ sinh kể đến: glicozit, amkaloit, tanin, tinh dậu, cao su

8 Glicozit

Glicozit hdp chất hữu phức tạp cấu tạo từ Siacarit chất sacarit gọi aglicon Sự kết hợp

h-ai th àn h phần thường thực nhị nhóm - OH g ’licozit thành phần sacarit Thành phần sacarit có th ể là iìrionosacarit (như glucozơ acbutin có trúc đào, và tìrong nhiều glicozit khác) oligosacarit.

Glicozit acbutin trúc đào gồm có hiđroquinon

glucozơ kết hợp với liên kết P- glicozit:

OH

8.1.1 Định tính glicozit acbutin trúc đào

Acbutin

Glicozit có th ể thủy phân acbutaz, enzim cũng có trúc đào, tạo thành glucozơ hiđroquinon:

OH

Có thể' nhận biết acbutin nhờ màu phức châ't giũa acbutin vói sơ" hóa chất F e S hay FeCl3; nhờ thành phần glucozơ sau cho enzim thủy phân acbutin.

Nguyên liệu hóa chất: Lá trúc đào, F e S tinh thể, FeCl3 5%, HC1 10%, NaO H 10%, dung dịch Fehling (xem mục l.a ).

Dụng cụ thiết bị: Cối chày sứ, cốc (V= 50-100m l), phễu, bếp điện, tủ ấm (37- 40°C).

o —CH—CH—CH—CH—CH—CHyOH

I

ÓH OH

Cách làm: Nghiền nhỏ trúc đào, cân gam cho vào côc, t hỏm vào 10ml nước sôi, lắc vài phút, vừa lắc vừa đun lọc ngay cịn nóng Làm nguội dung dịch tới nhiệt độ phòng. Dung dịch lọc dược sử dụng đê làm p h ả n ứng sau:

- Phản ứng với FeSO]

Lấy lm l dung dịch lọc cho vào ông nghiệm, thêm vào và] tinh thể F e S Quan sát chuyển màu Sản phẩm phản ứng cuối dạng kết tủ a màu tím bẩn (gần đen)

- P hản ứng với FeCl3

Lấy lm l dung dịch lọc cho vào ôVig nghiệm, thêm 1-2 giọt PeCl3 Q uan s t màu (gần xanh chàm)

Các phản ứng chửng tỏ có acbutin trúc đào.

b) Thủy phân acbutin bàng acbutaz

C ân gam trúc đào cho vào cối sứ, n ghiền nhỏ, cho thêm

10ml nước cất, khuấy chuyển vào cơc dung tích 50-100ml, đặt vào tủ ấm 37-40°C giờ, sau lấy lọc thu

lấy dung dịch Cho vào ông nghiệm 5ml dung dịch lọc, nhỏ giọt HC1 đến m ất màu xanh T ru n g hòa hỗn hợp

NaOH (thử giấy quỳ), lọc thu dung dịch trong.

Làm phản ứng với dung dịch Fehling: cho vào dung dịch lọc 2ml dung dịch Fehling, đun sôi phút Quan sá t hình thành

kêt tủ a đáy ông nghiệm

8.1.2 Glicozit đào (Prunus persica L Batsch)

Trong lá đào có glicozit am igdalin gồm phần aglicon là

anđehit benzoic kết hợp với axit xianhiđric, phần sacarit là

một đisacarit cấu tạo từ hai phân tử Ị3-D-glucozơ nốì V'6i nhau bằng liên k ết P -1,6 -glicozit:

OH

CH2OH o c h 2 - C - H

CN

HO HO

OH OH

Disacarit Agliccn

Amigdalin

Dưới tác dụng enzim, am igdalin bị thủy phân thành anđehit benzoic, axit xianhiđric P- D - glucozơ.

CHnOH

Trong enzim thủy phân am igdalin (glucosơidíiz, prunaz, oxinitridaz) khơng hoạt động, tĩomg môi trường nước nhiệt độ 35-40°C phản ứng thủy phân glicozit xảy m ạnh.

Có th ể nhận biết glicozit qua axit xianhiđric đượic giải phóng q trình thủy phân nhờ sô' phản ửntg màu đặc trưng.

Nguyên liệu: Chuẩn bị dung dịch chiết đào.

Cân 50 gam đào, thái nhỏ cho vào cốì sứ với ít nước, giã dập (làm nhanh để tránh bay HCN), cho vào bình

cất có chứa lOOml nước, lắp máy để cất C ất r)0ml (nước cất đào) Lắc m ạn h dung dịch thu được, lọc qua

giấy lọc thấm ướt nước cất Giữ dung dịch lọc lọ màu, nút kín (nên đựng đầy lọ).

a) Định tính axit xianhiđric (HCN)

Trong mơi trường kiềm, có các ion Fe2\ F e 3*, axit

xianhiđric tạo thành phức cha't feric feroxianua có màu xanh nưóc nước biển; axit xianhiđric tác dụng với axit picric mơi trường kiềm, tạo thành dẫn xuất có màu đỏ.

Hóa ch ấ t: NaOH 10%, F e S tinh thể, FeCl3 5%, HC1 10%, íixit picric bão hịa Giấy picro - sơđê (cách chuẩn bị: xem phụ

lục).

Cách làm:

- P hản ứng tạo thành feric feroxianua

Cho vào ống nghiệm 2ml d ung dịch chiết đào, thêm vào

2-3 giọt NaOH 10% vài h t F e S Đun sôi, cho thêm giọt

dung dịch FeCl3 Nhỏ giọt HC1 để axit hóa Dung dịch chuyển thành màu xanh nước biển, để lâu kết tủa lắng xucmg

đáy ông nghiệm

- P hản ứng với a xit picric

Cho vào Ống nghiệm 2ml dung dịch chiết đào, thêm vào

2-3 giọt NaOH 10%, lắc đều, thêm giọt axit picric, lắc nhẹ, để

một lúc, quan sát màu

Nguyên tắc: Dùng A gN tác dụng với HCN môi

trường kiểm dựa vào lượng AgNO.) đả tác dụng, tính lượng

HCN có mẫu.

Khi cho NH 4OH vào dung dịch nưốc cất đào, HCN chuyển thành NH4CN A g N thêm vào tác dụng với N H 4CN để tạo thành muối kép bạc amoni xianua hịa tíin

trong NH4OH:

AgNOa + NH4CN = [Ag(CN)2]NH4 + NH4 NO3

Lượng A g N dư thừa dung dịch tạo thành AgCN

cũng tan NH4OH

[Ag(CN)2]N H + A g N 3= NH NO3 + 2AgCN.

Nhưng có I2 (dưới dạng KI) lượng A g N thừa sẽ tạo thành A gl kết tủa màu vàng nhạt không tan NH4OH. Do dùng KI làm thuốíc thử chuẩn độ dung dịch A g N 3, dung dịch vẩn đục dấu hiệu phản ứng ciã kết thúc.

Nguyên liệu hóa chất'. Dung dịch chiết đào (xem cách chuẩn bị phần trên), NaOH 1%, NH 4OH đặc, KI 20%, A g N 3 0 , 1N (dùng dung dịch chuẩn)

Cách làm: Cho 25ml dung dịch chiết đào vào bình nón dung tích 250ml, thêm 75ral nước cất 10 giọt NaOH 10% <lể thủy phân amigdalin Lắc đểu, cho thêm 10ml N H 4OH, 10 giọt KI 20% chuẩn độ A g N đến dung dịch bắt đồu hơi đục.

lm l A g N 0,1 N tương đương vói 0,0054g HCN Tính

lượng HCN chứa 100ml nước cất đào, từ tính hàm

lượng HCN nguyên liệu.

A nkaloit nhữ n g hợp chất hữu cơ có chửa nitơ, nguồn gổc th ực vật, đa số có n h â n vịng, nhiều mang tính kiểm, có th ể t ạ<0 muối với axit

Ankaloit thường có tác dụng sinh lý mạnh thể người và

độing vật, đa sô chất độc

Trong cây, ankaloit dạng muôi với axit có mặt trong

cấ c nỏ chúng hòa ta n dung dịch nưốc

N ế u cho an k alo it dạng muối tác dụng với kiềm th u an.kf.loit ỏ dạng tự không tan nước, lại tan trong ilu.nf mơi hữu Tính chất ứng dụng để tách ankaloit ra kiỏi nguyên liệu thực vật.

8.2.1 Một sơ phản úmg định tính

Các ankaloit bị kết tủa sô thuôc thử như: thc thử

Míayar, thuốc thử Valser, tanin bão hịa v.v , dùng

Iih ữug thuốc thử để p h t ankaloit Tuy nhiên, p h ả n ứng khơng đặc hiệu, nghĩa có ankaloit nhtất định có kết tủ a, thử nghiệm có kết tủ a chưa thể kếit Uận chắn có ankaloit

Dưới giới th iệu hai p h ản ứng ankaloit cho kết tủ a (*ó màu đặc trưng, p h ản ứng D ragendorf ph ản ứng vói íixiit ohotphomolipđic

Hóa chất: HC1 1%; CH3COOH đặc; KI

C huẩn bị thuốc th Dragendorf: P h a dung dịch hỗn hợp gốc gồim: a) d u n g dịch bism ut n itr a t axit (cân 0,85g bism ut

Iiifcrat hòa tan 40ml nước, thêm 10ml CH3COOH đặc, lắc

ctềiu) b) d u n g dịch kali iơđua (cân 20g KI hịa ta n 50ml nưrớc S au trộn lẫn hai dung dịch a b với n h au ta

dung dịch gốc Lây 20ml dung dịch gốc này, thêm lOOml tước

' 20ml CH3COOH đặc, lắc đểu, nhận dung dịch thuốc thử

để sử dụng

Dung dịch axit photphomolipđic 1% (lg axit hòa tan tiong lOOml nước).

Dụng cụ: Bình cầu bình nón dung tích 100ml, nồi (ách

thủy (100°C).

Cách làm: C hiết ankaloit từ nguyên liệu thực vật: Cín 1

gam nguyên liệu tươi (lá ớt), cắt nhỏ, cho vào bình cầu lo ặ c bình nón, thêm vào 25m l HC1 1%, đun nồi cách thủy đang sôi phút Đ ể nguội, lọc qua giấy lọc, thu lấy dung

dịch đế làm phản ứng định tính.

- Phản ứng Dragendorf

Trong mơi trưịng axit nhiều ankaloit cho kết tủa nà u

đỏ da cam đỏ gạch với thuốc thử Dragendorf có chứa ka li iơdua bismut nitrat.

Cho vào Ống nghiệm lm l dung dịch chiết ankaloit, nhiỏ

từng giọt thuốc thử, quan sát tạo thành kết tủa.

- Phản ứng với axit photphomolipđic

Ankaloit tác dụng với axit photphomolipđic cho kết tủta

màu vàng, sau chuyển thành màu xanh màu lục d) Siự

khử axỉt molipdic.

Cho vào ống nghiệm lm l dung dịch chiết ankaloit tiêỉtn từng giọtaxit photphomolipđic 1%, quan sát kết tủa.

8.2.2 Định lượng ankaloit

Đê chiết rút ankalơit khỏi nguyên liệu, trước hết cần kìêr.1 hóa ngun liệu đế đẩy ankaloit d ạn g tự rú t

ankàỉoit dung mơi hữu cơ. Sau có th ể cho bay dung

môi cân trực tiếp lượng ankaloit tách ra, chuÂn độ ankaloit tách axit dựa vào lượng axit đa đê chuẩn độ tính lượng ankaloit

Định lượng ankaloit cà độc dược

N guyên tắc: Ankaloit có cà độc dược đẩy

bhnỉ NH4OH Sau rút ankaloit dung mơi hữu cơ: ete

và clorbm T ru n g hòa ankaloit H.>S04 Đo lượng H2S thừ? có th ể tính lượng ankaloit

N guyên liệu hóa chất: Lá cà độc dược tươi, ete etylic;

clorofom, N H 4OH 4%; N H 4OH 50%, H2S IN; H2S 0.02N,

NaCH 0,02N, thị metyl đỏ 0,2%, H 2S 10%

D ụng cụ: Bình nón (V=100ml), phễu*chiết (V=100ml), nồi cách thủy, microburet

Cách làm : Cân xác lOg cà độc dược, th nhỏ cho vào bình nón, th êm vào 50ml hỗn hợp ete - clorofom (10ml

clorcfom + 40m l ete) để yên phút Sau thêm 5ml NH 4OH 4%, iậ y nút để yên giờ, lắc nhẹ Lấy dung dịch ra, chuyển dung dịch từ bình vào phễu chiết có chứa sẵn 20ml nước cất 6ml H2S IN, rửa bã bình bằng hồn hợp ete - clorofom vài lần, lần 10ml Các dung dịch rửa

này đổ gộp vào phễu chiết Lắc m n h hỗn hợp

ph ễt chiết cho để rút ankaloit thành dạng tan axit. Đ ể jên phễu cho hỗn hợp lắng thành lốp Tách lấy riêng lớp

axit Rửa lại lớp ete - clorofom lại H2S 10% (rửa

lần nỗi lần 10ml) lại thu lấy lớp axit Dồn dung dịch axit lại \à kiểm hóa trở lại 20-22ml N H 4OH 50% Lại rút

Dồn dung dịch clorofom vào bình nón cho ba> hơi trên nồi cách thủy Sau khô, thêm vào cặn 3ml ete, tiep tực cơ đến cạn Cuối hịa tan cặn 20ml H2S 0,02N.

Tiếp theo chuẩn độ lượng H2S thừa dung dịch lằng NaOH ,02N, dùng m etyl đỏ làm thị.

Dựa vào lượng H2S thừa, tính lượng H2S tác cụng vói ankaloit chiết từ mẫu.

lm l H2S ,02N tương ứng với 0,005784g ankaloit Eo (ỉó có thể tính được tỷ lệ phần trăm ankaloit có nguyên liệu theo công thức sau:

M ft MV5784 inn

trong đó:

M - số ml H2S ,02N tác dụng với ạnkaloit.

8.3 Các hợp chất phenol

Tạo hợp chất phenol nét đặc trưng t ế bào thực vật.

Các hợp ch ất phenol chia th n h nhóm lớn là:

Các hợp chất phenol tương đối dơn giản gọi là

các monome như: axit galic (có thành phần

tanin thủy phân), hay hợp c h ấ t flavonoit có catechin.

Các hợp chất phức tạp thường gọi hớp chất poliphenol; đại diện biết nhiều thuộc nhóm tanin hay chât chát, ch ất có khả thuộc da, tức lậ làm kết tủ a protein da, tạo th àn h phức chất không tan.

Xác định catechỉn búp chè

Catechin hợp chât phenol tương đơi đơn giản thuộc nhóm flavonoit, có hoạt tính vitamin p, dễ dàng bị oxi hóa có xu huống polime hóa Catechin chất tiền thân tạo nên tanin ngưng tụ Catechin phố biến thực vật, đặc biệt có nhiều búp chè (đạt tới 30% trọng lượng khô) Hàm

lượng catechin sô' chất lượng giá trị sinh học quan

trọng hàng loạt thực phẩm như: chè, rượu nho, rượu vang, niíớc

Dưới giới thiệu cách xác định nhanh hàm lượng catechin chè phương pháp so màu.

Cơ sở phương pháp p h ả n ứng catechin với vanilin môi trường axit tạo thành sản phẩm màu đỏ tím. Cưịng độ màu tỷ lệ th u ậ n với hàm lượng catechin mẫu có thể đo nhờ máy so màu hay máy quang phổ Đồ thị

chuẩn dựng theo chê phẩm catechin tổng số

Dụng cụ thiết bị: Bình nón (V=500ml), ông sinh hàn,

phễu chiết, bình định mức 100ml, nồi cách thủy, máy quang phô

hoặc máy so màu quang điện.

Cách làm : Lá chè tươi cố định nước

p h ú t sấy khô 70°c 1 gam chè cô định

trên nghiền cối sứ, sau chuyển vào bình định mxic 100ml, thêm vào 80m l nước sơi đặt vào nồi cách thủy đang sôi C hiết rút catechin 40 phút, lắc nhẹ Sau đó bình làm nguội đến nhiệt độ phịng, dẫn nước đến vạch mức, trộn lọc qua giấy lọc Từ dung dịch lọc thu lây lm l cho vào bình định mức có dung tích 50ml, thêm nước đỉ'n vạch mức lắc trộn Cho vào ống nghiệm lm l dung dịch pha loãng trên, thêm 4ml thuốc thử vanilin, lắc đều, sau 5

phút đo cường độ màu máy so màu máy quang phơ ỏ

bưốc sóng 508nm (chú ý dùng cuvet so màu có nắp đậy) Song

song với ống thí nghiệm làm ống kiểm tra, thay lm l mẫu

lm l nưốc cất Từ số đọc th u được, dựa vào đồ thị chuẩn để tính

ra hàm lượng catechin.

Đồ thị chuẩn catechin xây dựng sau: Mẩu chuẩn

là ch ế phẩm catechin tổng sô' Pha dung dịch catechin chuẩn

chứa 100|ig/ml, từ dung dịch gốc chuẩn bị dung dịch pha loãng chứa 10, 15, 20, 25 50|ig/ml làm tiếp tục với m ẫu th í nghiệm Làm ống đốỉ chứng với nước cất Có dựng đồ thị chuẩn lập bảng biểu diễn tương quan mật độ quang học hàm lượng catechin.

Chuẩn bị ch ế phẩm catechin tổng sô':

Cho 10 gam búp chè (đã cô' định nghiền nhỏ đã nêu trên) vào bình nón dung tích 500m l, thêm vào 150ml etanol 80%, lắp ống sinh hàn ngược chiết rút 40°c 20 phút nồi cách thủy Lọc dung dịch chiết qua giấy lọc, bã được chiết lại lần lần 75ml etanol 80% 20

phút Gộp dung dịch chiết lại cô đặc đên 50ml ỏ 30-40°C cách thủy chân không Tiêp theo xử lý dưng dịch có dặc thu clorofom (3 - lần, lần 50ml) phễu chiết để loại bỏ cafein, sắc tô sản phẩm khác Gộp phần dung dịch thu xử lý tiếp e ty lax etat phễu chiết (5 lần, lần khoảng 100ml) Sau thêm vào phần dung dịch chiết etylax etat N a 2S kh an để loại nước, lọc, thu dung dịch đem cô trê n nồi cách thủ y 30-40°C chân khơng, đến cịn khoảng 10ml thêm vào 2()ml nuớc, lắc nhẹ, tiếp đến cạn

Chê phẩm khô th u chiếm khoảng 25% lượng

Phụ lục %

1 Một số chắt thị màu để đo pH

Giới Sự đổi màu

Chất thị màu hạn

thay đổi pH

Môi trường

axit

Môi trường

kiềm

Dung dịch cần pha

1 Metyl da cam 3,1-4,4 Đỏ Da cam 0,1% H20

2 Bromophenol xanh

3,0-4,6 Vàng Xanh 0,1% H20

3 Công gô đỏ 3,0-5,2 Tím Đỏ 0,1% H20

4 Metyl đỏ 4,4-6,3 Đỏ Vàng 0,1% H20

5 Giấy qùy 5,8-8,0 Đỏ Xanh

6 Đỏ trung tính 6,8-8,0 Đỏ Vàng 0,1% etanol 60%

7 Timol xanh 8,0-9,6 Vàng Xanh 0,1% H20

8 Phenolphtalein 8,0-9,8 Khơng

màu

Tím đỏ 0,1% etanol

50%

9 Timolphtaleỉn 9,3-10,5 Không

màu

Xanh 0,1% etanol

2 Chuẩn bị dung dịch Folin (để xác định protein)

Hòa tail 100g n atri volframat (Na2W |.2 H 90), 25g n a tri m olipđat (Na2M o 2H20 ) vào 800ml nước cất Thêm vào 50ml axit h o n c 85% 100ml HC1 đặc Lắp ông sinh h n ngược va (tun hỗn hợp 10 giị Sau thêm vào hỗn hợp 150g Lj2S 4, 50ml nước vài giọt brom, đun 15 p h ú t khơng có ơng sinh h n để loại bỏ brôm thừa Sau ỉàm nguội dung dịch, lấy 5ml chu ẩn độ dung dịch NaOH chuẩn 0,1N Dựa k ết chuẩn độ, bô sung nưỏc để dung dịch có nồng độ cuối 2N, lọc dung dịch có k ết tủa, giữ dung dịch

trong lọ m àu Trước dùng thuốc th cần pha lỗng gắp đơi

b n g nước

3 Chuẩn bị giấy Picrô - sôđê

C ắ t b ăn g giấy lọc sạch, ngâm vào dung dịch axit picric

1% 15-20 phút, sau lấy hong khơ, ngâm lại vào dung

dịch N a 9C ? 1% 5-10 phút Lấy hong khô

giây picrơ - sơđê Có thê cắt th n h băng nhỏ giừ hộp để

4 Bảng chuyển đổi lượng đồng thành lượng đường (mg) theo phương pháp Bectrand

Đồng (mg)

Glucozơ (mg)

Đổng (mg)

Glucozơ (mg)

Đồng (mg)

GIUC)ZƠ

(mj)

1,1 0,50 10,6 5,05 15,2 7,-5

1,5 0,68 10,8 5,15 15,4 7 /5

2,0 0,90 11,0 5,25 15,6 7.Í5

2,5 1,13 11,2 5,35 15,8 7,(5

3.0 1,36 11.4 5,45 16,0 7,75

3,5 1,59 11,6 5,55 16,2 7,t5

4.0 1,81 11.8 5,65 16,4 7.S5

4,4 2,00 12,0 5,75 16,6 8,(5

5,0 2,27 12,2 5,85 16,8 8, 5

5,5 2,50 12,4 5,95 17,0 8,i5

6,0 2,75 12,6 6,05 17,2 8,15

6,6 3,05 12,8 6,15 17,4 8 / 5

7,0 3,25 13,0 6,25 17,6 8,‘5

7,2 3,35 13,2 6,35 17,8 8,15

7.4 3,45 13,4 6,45 18,0 8,'5

7,8 3,65 13,6 6,55 18,2 8,15

8,2 3,85 13,8 6,65 18,4 8,15

8,6 4,05 14,0 6,75 18,6 9,15

9,0 4,25 14,2 6,85 18,8 9, 5

9,5 4,50 14,4 6,95 19,0 9,25

10,0 4,75 14,6 7,05 19,2 9,-.5

10,2 4,85 14,8 7,15 19,4 9 /5

Tài liệu tham khảo chính

1 Phạm Trân Châu, Đào Kim Nhung, Nguyễn Quô'c Khang,

1977 Thực tập nhỏ sinh hóa học, Trường ĐHTH Hà Nội

‘2 Phạm Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường,

1997 Thực hành Hoá sinh học, N hà Xuất Giáo dục, Hà Nội

3 Goodwin,T.w and Mercer, E.I, 1987 Introduction to P lant

Biochemistry, 2nd Edition, Pergamon Press, New York

4 Grinkevic, N.I 1983 Chimitzeski anilys lecarstvennoic

rastenii, Izd "Vưsaia skola”, Moskva (tiếng Nga)

5 Nelson, D.L.and Cox, M.M 2000 Lehninger Principles of

Biochemistry, Worth Publishers, New York

6 Philipovich, U.B., Egorova, T.A., Xevastianova, G.A., 1975

Praticum po obsci biochimii, Provesenhie, Moskva (tiếng Nga)

7 Shapiro, D.K 1976 Practicum po biologicheskoi chimii,

Vưseisaia Skola, Minsk (tiếng Nga)

8 Stryer, L 1995 Biochemistry, W.H F reem an and

Company, New York

9 Walker, J.M 1996 The protein protocols Handbook,

H um ana Press, Totowa New Jersey

10 William, B.L and Wilson, K., 1975 Biologists Guide to

NHÀ XUẤT IỈẢN ĐỌI HỌC QUỐC GM Hồ NỘI• • •

16 I làng Chuối - Hai Bà Trưng - Hà Nội

Điên thoai: (04) 9724852; (04) 9724770 Fax: (04) 9714899

C hiu trá c h n h iê m x u ả t bản:

Giám đốc: PHÙNG QUỐC BẢO

Tông biên tập: NGUYẺN b t h n h

C hiu tr c h n h iê m nôi d un g:

Hội dồng nghiệm thu giáo trình

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

Người nhận xét: GS TS NGUYEN QUỐC KHANG PGS TS NGUYỄN VÃN MÙI

Biên tập: QUỐC THANG

Biên tập tái bản: Q u ố c THANG

Trinh bày bia: NGỌC ANH

THỰC TẠP HOA SINH HỌC _ _ _ — - — ầ,

Mà SỐ: 1K-96 ĐH2007

In 1.000 cuốn, khổ 14,5 X 20,5 cm Công ty c ổ phán KOV

Sô xuất bản: 381 - 2007/CXB/41 - 64/ĐHQGHN, ngày 25/5/2007

Quyết dịnh xuất số: 610 KH/XB