thực hiện các thí nghiệm trong giáo trình thực tập hóa sinh học (tn364)

Mục tiêu của môn học là nghiên cứu, tìm hiểu thành phần, cấu tạo, chức năng và bản chất hóa học của các chất và các quá trình chuyển hóa trong cơ thể sống.Môn Thực tập hóa sinh học được

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

THỰC HIỆN CÁC THÍ NGHIỆM TRONG GIÁO TRÌNH THỰC TẬP HÓA SINH HỌC

(TN364)

Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Ts ĐÁI THỊ XUÂN TRANG NGUYỄN NGỌC HUỲNH

VÕ THỊ TÚ ANH MSSV: 3092341

Lớp: SINH HỌC K35

Cần Thơ, 2013

đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô khoa Khoa Học Tự Nhiên nhất là quý thầy cô thuộc Bộ môn Sinh học đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em suốt khóa học

Xin gửi lời cảm ơn đến thầy Phạm Quốc Nhiên và cán bộ phòng thí nghiệm Hóa – Khoa Khoa Học Tự Nhiên – Trường Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn tập thể lớp Sinh Học K35 đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Xin cảm ơn gia đình, đặc biệt là mẹ, đã lo cho con ăn học và luôn là nguồn động lực và động viên quý báu để con có thể vượt mọi khó khăn học tập tốt

Em xin chúc quý Thầy Cô cùng các bạn sinh viên thành công và dồi dào sức khỏe và công tác tốt

Cần Thơ, ngày 20 tháng 05 năm 2013

Nguyễn Ngọc Huỳnh

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam kết Luận văn này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu của bản thân tôi Các số liệu và kết quả có được trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Nguyễn Ngọc Huỳnh

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ 1

LỜI CAM KẾT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT viii

TÓM TẮT x

PHẦN I: GIỚI THIỆU 1

PHẦN II: NỘI DUNG xii

Bài 1: Carbohydrate xii

1 Cơ sở lí thuyết xii

1.1 Carbohydrate xii

1.2 Glycogen xii

1.3 Nguyên tắc thí nghiệm xiv

2 Nội dung bài thực hành xiv

2.1 Phương tiện, phương pháp thí nghiệm xiv

2.1.1 Mẫu vật xiv

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị xiv

2.2 Tiến trình thí nghiệm xiv

2.2.1 Chiết xuất glycogen xiv

2.2.2 Kiểm tra dịch glycogen chiết xuất và xác định thành phần cấu tạo xv

3 Kết quả và thảo luận xv

Bài 2: Lipid xviii

1 Cơ sở lý thuyết xviii

1.1 Sơ lược về lipid xviii

1.2 Lecithin xviii

1.3 Nguyên tắc thí nghiệm xix

2 Nội dung bài thực hành xx

2.1 Phương tiện, phương pháp xx

2.1.1 Mẫu vật xx

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị xx

2.2 Tiến trình thí nghiệm xx

2.2.1 Chiết xuất lecithin xx

2.2.2 Xác định thành phần cấu tạo xxi

3 Kết quả và thảo luận xxi

Bài 3: Xác định hoạt tính của enzyme amylase xxv

1 Cơ sở lý thuyết xxv

1.1 Sơ lược về enzyme xxv

1.2 Enzyme amylase xxv

1.3 Nguyên tắc thí nghiệm xxvi

2 Nội dung bài thực hành xxvi

2.1 Phương tiện, phương pháp xxvi

2.1.1 Mẫu vật xxvi

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị xxvii

2.2 Tiến trình thí nghiệm xxvii

2.2.1 Trích amylase và tinh khiết hóa xxvii

2.2.2 Xác định hoạt tính amylase xxvii

3 Kết quả và thảo luận xxviii

Bài 4: Phản ứng oxy hóa – khử xxix

1 Cơ sở lý thuyết: xxix

1.1Phản ứng oxy hóa khử sinh học xxix

1.1.1 Gốc tự do xxix

1.1.2 Chất chống oxy hóa xxx

1.2DPPH và Trolox xxx

1.2.1 DPPH xxx

1.2.2 Trolox xxx

1.3Nguyên tắc thí nghiệm xxxi

2.Nội dung bài thực hành xxxii

2.1 Phương tiện và phương pháp xxxii

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị xxxii

2.1.2 Tiến trình thí nghiệm xxxii

3.Kết quả và thảo luận xxxii

Bài 5: Định lượng Vitamin C bằng phương pháp Muri xxxv

1.Cơ sở lý thuyết xxxv

1.1 Vitamin C xxxv

1.2 Nguyên tắc thí nghiệm xxxvi

2 Nội dung bài thực hành xxxvii

2.1 Phương tiện, phương pháp xxxvii

2.1.1 Mẫu vật xxxvii

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị xxxvii

2.1.3 Tiến trình thí nghiệm xxxvii

3 Kết quả và thảo luận xxxix

PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ xlii

1 Kết luận xlii

2 Đề nghị xlii

TÀI LIỆU THAM KHẢO xliii

PHỤ LỤC xlv

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Giá trị OD sau 3 lần thực hiện thí nghiệm xác định hoạt tính amylase 19 Bảng 2: Giá trị OD và khả năng chống oxy hóa trung bình của trolox 23 Bảng 3: Thể tích 2,6 diclorophenol indophenol (ml) sau các lần định phân 29 Bảng 4: Khối lượng vitamin C có trong mẫu vật 29

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Cấu trúc glycogen xiii

Hình 2 Cấu trúc glycogen và amylopectin xiii

Hình 3: Phản ứng màu của glycogen với iod xvi

Hình 4: Màu phản ứng Fehling của glycogen xvi

Hình 5: Màu phản ứng Fehling của dịch thủy phân glycogen xvii

Hình 6: Công thức cấu tạo của lecithin xix

Hình 7: Phản ứng thủy phân lecithin xxii

Hình 8: Giọt mỡ trên bề mặt dung dịch thủy phân lecithin xxii

Hình 9: Tinh thể choline periodide dưới kính hiển vi (vật kính E20) xxiii

Hình 10: Phản ứng tạo acrolein của glycerol trong dịch thủy phân lecithin (bên trái), và glycerol nguyên chất (bên phải) xxiv

Hình 11: Phương trình phản ứng giữa phosphoric acid xxiv

Hình 12: Cấu trúc phân tử của trolox (a) và -tocopherol (b) xxxi

Hình 13: Độ hấp thụ quang phổ trong thí nghiệm xxxiii

Hình 14: Khả năng làm sạch DPPH của trolox ở các nồng độ được đo ở bước sóng 517nm xxxiv

Hình 15: Dạng gốc tự do (1) và dạng sau khi phản ứng (2) của DPPH xxxv

Hình 16: Dạng khử và oxy hóa của vitamin C (acid ascorbic) xxxvi Hình 17: Phản ứng oxy hóa khử giữa ascorbic acid và 2,6 DCIP xli

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

OD: optical density

ROS: reactive oxygen species

RNS: reactive nitrogen species

RSS: reactive sulfua species

DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid

TÓM TẮT

Hóa sinh học là môn học nghiên cứu về sự sống dưới gốc độ phân tử, đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp kiến thức nền tảng cho sinh viên về lĩnh vực hóa sinh, môn thực tập hóa sinh không những giúp cũng cố kiến thức mà còn rèn luyện cho sinh viên kỹ năng thực hành và hướng đến nghiên cứu khoa học sau này Đề tài tập trung thực hiện các thí nghiệm trong giáo trình thực tập hóa sinh học (TN364) nhằm hoàn thiện giáo trình hơn Có 5 bài thí nghiệm đã được thực hiện, thuộc các mảng kiến thức về carbohydrate, lipid, enzyme, vitamin và phản ứng oxy hóa khử

PHẦN I: GIỚI THIỆU

Hóa sinh học là một môn học nghiên cứu về sự sống dưới gốc độ phân tử Mục tiêu của môn học là nghiên cứu, tìm hiểu thành phần, cấu tạo, chức năng và bản chất hóa học của các chất và các quá trình chuyển hóa trong cơ thể sống.Môn Thực tập hóa sinh học được giảng dạy giúp sinh viên củng cố phần kiến thức lý thuyết đã được học và nắm vững các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong phòng thí nghiệm hóa sinh, qua đó giúp sinh viên bước đầu tiếp cận các kỹ thuật cơ bản và áp dụng để thực hiện một đề tài nghiên cứu hoàn chỉnh hay áp dụng vào thực tiễn trong một số lĩnh vực có liên quan

Từ học kì 1 năm học 2011-2012 bộ môn Sinh học thuộc Khoa Khoa Học Tự Nhiên bắt đầu giảng dạy môn Thực tập hóa sinh học, tuy nhiên giáo trình chưa

được hoàn chỉnh Do đó, việc “Thực hiện các thí nghiệm trong giáo trình thực tập hóa sinh học (TN364)” để hoàn thiện giáo trình là rất cần thiết nhằm đạt được

chất lượng tốt nhất trong giảng dạy

Nội dung giáo trình vẫn đi vào tìm hiểu những hợp chất quan trọng của tế bào và cơ thể sống như carbohydrate, lipid, protein, vitamin

Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm việc thực hiện những thí nghiệm thuộc các bài:

- Carbohydrate: chiết xuất glycogen từ động vật và xác định thành phần cấu tạo

- Lipid: chiết xuất lecithin từ lòng đỏ trứng và xác định thành phần cấu tạo

- Xác định hoạt tính của enzyme amylase: trích và tinh khiết hóa amylase mầm

lúa và xác định hoạt tính

- Phản ứng oxy hóa - khử: khảo sát khả năng chống oxy hóa của trolox

- Định lượng vitamin C bằng phương pháp Muri

PHẦN II: NỘI DUNG

Nội dung của nghiên cứu bao gồm 5 đơn vị bài, lần lượt được trình bày sau đây:

(Phạm Thị Trân Châu et al., 2010).

Thông thường người ta chia carbohydrate thành 2 nhóm lớn là monosaccharide và polysaccharide (bao gồm từ 2 gốc monosaccharide trở lên) Một trong những polysaccharide quan trọng được biết đến nhiều đó là glycogen

1.2 Glycogen

Glycogen là một polysaccharide phân nhánh, tương tự như amylopectin, là polymer của các -D-Glucopyranose, kết hợp với nhau qua liên kết (14) glycoside, liên kết (16) glycoside ở điểm phân nhánh, nhưng mức độ phân

nhánh nhiều hơn amylopectin ở khoảng cách 8 - 12 gốc (Phạm Thị Trân Châu et al., 2010)

CH2OH O

Hình 2 Cấu trúc glycogen và amylopectin

Nguồn: Phạm Thị Trân Châu et al., (2010)

Vai trò của glycogen trong cơ thể là dự trữ năng lượng, glycogen giúp dự trữ glucose cho cơ thể, khi đói hàm lượng glycogen giảm nhanh chóng, có thể bị

sử dụng toàn bộ, nhưng cũng có thể nhanh chóng được tổng hợp lại từ các carbohydrate mới được hấp thụ vào

Glycogen có trong hầu hết các tế bào động vật và có trong một số nguyên sinh động vật và tảo Ở người và các động vật có xương sống khác, glycogen tập

trung chủ yếu trong gan, trong tế bào mô cơ (Phạm Thị Trân Châu et al., 2010)

Do đó, trong thí nghiệm này gan động vật được chọn làm nguyên liệu để chiết xuất glycogen

Liên kết (14) glycoside

Liên kết (16) glycoside

1.3 Nguyên tắc thí nghiệm

Nguyên tắc của thí nghiệm chiết xuất glycogen là sau khi phá hủy mô gan hoặc cơ bằng môi trường kiềm mạnh và nhiệt độ cao, glycogen sẽ được giải phóng Sau khi được kết tủa bằng alcol ở nhiệt độ lạnh, glycogen được hòa tan bằng nước cất nóng 60 (Nguyễn Nghiêm Luật, 2003)

Trong thí nghiệm này kali hydroxide (KOH) được sử dụng như là yếu tố kiềm mạnh để phá hủy mô gan, phù hợp với điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm Hóa chất này cũng đã được sử dụng nhiều để chiết xuất glycogen trong

một số nghiên cứu Nutter (1940), Seifter et al (1949), Aklujkar et al (2008)

2 Nội dung bài thực hành

2.1 Phương tiện, phương pháp thí nghiệm

2.1.1 Mẫu vật

Gan heo tươi

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị

Hóa chất: Dụng cụ, thiết bị:

Kali hydroxide 30% Cối, chày sứ

Sodium sulphate bão hòa Đèn cồn

Acid sunfuric 5N Bếp, cân phân tích

Dung dịch Lugol Ống nghiệm, giá ống nghiệm

Các thành phần thuốc thử Fehling Cốc thủy tinh, kẹp ống nghiệm

Natri hydroxide 5N Micropipette

2.2 Tiến trình thí nghiệm

2.2.1 Chiết xuất glycogen

Gan tươi được cân bằng cân phân tích vừa đủ 4 g, được nghiền nhuyễn trong cối sứ và được cho vào ống nghiệm Sau khi 6 ml dung dịch KOH 30% được thêm vào, hỗn hợp được đun sôi trên ngọn lửa đèn cồn, vừa đun vừa lắc cho đến khi tổ chức gan tan hết trong dung dịch KOH, các bước này nhằm tạo môi trường kiềm và nhiệt độ cao để glycogen được giải phóng Sau khi được làm lạnh trong nước đá 10 phút, hỗn hợp tiếp tục được thêm vào 0,4 ml dung dịch Na2SO4

bão hòa và lắc đều có vai trò tăng hiệu suất của quá trình tủa glycogen Hỗn hợp

sau đó được cho thêm 10 ml ethanol 96, lắc đều và được đặt trong nước đá 5 phút nhằm tạo điều kiện tủa glycogen Sau khi ly tâm (3000 vòng/phút trong 5 phút), phần tủa được sử dụng Tủa được rửa bằng cách cho vào 6 ml ethanol 96, sau đó ly tâm lại Việc rửa tủa được lặp lại lần 2 Cuối cùng phần tủa glycogen được hòa tan bằng 6 ml nước cất nóng 60C Quy trình này dựa theo tài liệu của Nguyễn Nghiêm Luật (2003) và đã được điều chỉnh để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.

2.2.2 Kiểm tra dịch glycogen chiết xuất và xác định thành phần cấu tạo

Dịch glycogen sau khi chiết ra được kiểm tra và xác định thành phần cấu tạo bằng những thí nghiệm được trình bày như sau:

- Phản ứng với iod: 10 giọt dịch glycogen chiết xuất cùng với 1 giọt dung dịch

H2SO4 5N được cho vào ống nghiệm, lắc đều, thêm 2 giọt dung dịch Lugol và lắc đều

- Phản ứng Fehling: 1 ml thuốc thử Fehling, 10 giọt dịch glycogen chiết xuất

được cho vào ống nghiệm, lắc đều Sau đó đun sôi cách thủy trong 5 phút

- Xác định thành phần cấu tạo:1,5 ml dịch glycogen chiết xuất và 1,5 ml dung dịch H2SO4 5N được cho vào ống nghiệm Sau khi được lắc đều và đun sôi cách thủy trong 30 phút dịch thủy phân được trung hòa bằng NaOH 5N

Thuốc thử Fehling 1 ml và dịch thủy phân đã trung hòa 20 giọt được cho vào ống nghiệm Sau đó được lắc đều và đun sôi trên đèn cồn trong 5 phút

3 Kết quả và thảo luận

- Phản ứng với iod

Lugol là dung dịch có chứa iod thường được dùng làm thuốc thử định tính

các polysaccharide Cách pha dung dịch Lugol được trình bày ở phần phụ lục

glycogen khi kết hợp với iod cho màu đỏ nâu (Phạm Thị Trân Châu et al., 2010)

Hình 3: Phản ứng màu của glycogen với iod

- Phản ứng Fehling

Do glycogen là một polysacharide không có tính khử nên sẽ không cho phản ứng với thuốc thử Fehling Màu của dung dịch vẫn là màu của thuốc thử Fehling (Hình 4)

Hình 4: Màu phản ứng Fehling của glycogen

- Xác định thành phần cấu tạo

Dung dịch glycogen tinh khiết không có tính khử, nhưng sau khi thủy phân tạo thành các thành phần có tính khử Trong môi trường acid, dưới tác dụng của nhiệt độ, các liên kết glycoside trong phân tử polysacchride bị thủy phân, làm cho phân tử polysaccharide bị phân tách nhỏ dần và khi quá trình thủy phân hoàn thành, phân tử polysaccharide bị thủy phân hoàn toàn thành các thành phần cấu tạo nên chúng là glucose (Nguyễn Nghiêm Luật, 2003) Do đó, dịch thủy phân glycogen cho phản ứng với thuốc thử Fehling, dung dịch có màu đỏ gạch đặc trưng của kết tủa oxid đồng (I), Cu2O (Hình 5)

Thuốc thử Fehling là hỗn hợp (1:1) của hai dung dịch: dung dịch đồng sulfate gọi là Fehling A và dung dịch kiềm của muối Seignette (kali natri tartrate) gọi là Fehling B

Khi trộn hai dung dịch Fehling lại với nhau thì xảy ra phản ứng gồm hai giai đoạn Đầu tiên tạo thành kết tủa đồng hydroxide [Cu(OH)2] màu xanh da trời:

CuSO4 + 2NaOH  Cu(OH)2 + Na2SO4

Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối kali natri tartrate tạo thành muối phức hòa tan, dung dịch có màu xanh thẵm

Hình 5: Màu phản ứng Fehling của dịch thủy phân glycogen

Đồng hydroxide Kali natri tartrate Đồng tartrate

Glucose Đồng tartrate Acid gluconic Oxid đồng (I)

Bài 2: Lipid

1 Cơ sở lý thuyết

1.1 Sơ lược về lipid

Lipid là hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên và trong cơ thể động vật,

thực vật và vi sinh vật Lipid có đặc tính không hoà tan trong nước, chỉ hoà tan

trong các dung môi hữu cơ như chloroform, benzen, cồn, acetone nhưng không

phải mọi lipid đều hoà tan như nhau trong tất cả các dung môi nói trên, mà mỗi

lipid hoà tan trong dung môi tương ứng của mình, nhờ đặc tính này người ta có

thể phân tích riêng từng loại Về mặt hoá học lipid là những este giữa alcol và

acid béo (Trần Tố et al., 2008)

Lipid đối với cơ thể sinh vật có nhiều chức năng quan trọng như: Dự trữ

năng lượng, cấu tạo màng tế bào, là dung môi hoà tan vitamin, bảo vệ cơ học,

Dựa vào thành phần hoá học người ta chia lipid ra làm 2 lớp:

- Lớp lipid đơn giản: là những este của alcol và acid béo

- Lớp lipid phức tạp: ngoài alcol và acid béo còn có chứa các dẫn xuất phospho,

azot, sulfua Một lipid phức tạp quan trọng và phổ biến là lecithin (Trần Tố et

al., 2008)

1.2 Lecithin

Lecithin còn được gọi là phosphatidylcholine, là một diester của acid

phosphoric Một phía acid phosphoric liên kết với glycerol, phía kia liên kết với

cholin, có công thức cấu tạo được trình bày trong Hình 6 (Đỗ Quý Hai et al.,

2004)

H

H3CO

P

O OO

Hình 6: Công thức cấu tạo của lecithin

Qua cấu tạo ta nhận thấy lecithin gồm 2 phần:

- Phần phân cực bao gồm acid phosphoric và base nitrogen ưa nước

- Phần không phân cực bao gồm các gốc acid béo, glycerol kị nước

Lecithin có mặt phổ biến trong tế bào sống, đặc biệt là trong lòng đỏ, trong

hồng cầu, tinh trùng, (Nguyễn Quang Vinh et al., 2007)

Cơ thể động vật phần nhiều chứa α - lecithin Khi phân lập ra, lecithin là chất kết tinh trắng, thể sáp, ra ngoài không khí dễ hoá sẫm vì acid béo không bão

hoà bị oxy hoá (Trần Tố et al., 2008)

Về mặt ứng dụng, lecithin được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm như sản xuất chocolate, maragin đóng vai trò là chất chống oxy hóa (Trần

Tố et al., 2008)

1.3 Nguyên tắc thí nghiệm

Lecithin hòa tan tốt trong ethanol nóng nhưng không tan trong acetone Vì vậy dễ nhận được lecithin khi dùng ethanol nóng để chiết lecithin khỏi nguyên

liệu, kết tủa lecithin bằng acetone (Nguyễn Quang Vinh et al., 2007)

Lòng đỏ trứng là một nguồn phong phú phospholipid, chiếm khoảng 10% trọng lượng tươi của lòng đỏ trứng, tương đương với khoảng 22% tổng chất rắn của lòng đỏ trứng gà (Palacios et al., 2005)

Hai thành phần chính của lecithin lòng đỏ trứng là phosphatidylcholine (80,5%) và phosphatidylethanolamine (11,7%) (Palacios et al., 2005) Lecithin

lòng đỏ trứng cũng chứa một lượng nhỏ lysophosphatidylcholine, sphingomyelin,

và các chất béo trung tính Theo một số tài liệu, lecithin lòng đỏ trứng chủ yếu được chiết xuất bằng các dung môi như diethyl ether, hexane, chloroform, và ethanol Tuy nhiên, một trong số các dung môi này ảnh hưởng đến vấn đề sức khỏe và môi trường Ethanol là dung môi được sử dụng nhiều vì phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm thông thường (Palacios et al., 2005)

2 Nội dung bài thực hành

2.1 Phương tiện, phương pháp

Các thành phần thuốc thử Fehling Kính hiển vi, lame kính

2.2 Tiến trình thí nghiệm

2.2.1 Chiết xuất lecithin

Để bắt đầu thí nghiệm, một lòng đỏ trứng và 40 ml ethanol 95nóng được cho vào cốc thủy tinh và khuấy đều bằng đũa thủy tinh trong 5-10 phút Lecithin

và các lipid khác tan trong ethanol còn protein sẽ bị kết tủa Sau đó, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc và dịch lọc được cô lại trên bếp điện, để ethanol được bốc hơi cho đến khi dịch sánh lại Tiếp theo đó, 10 ml acetone được thêm vào để kết tủa lecithin vì lecithin không tan trong acetone còn các lipid khác tan Tủa được gạn lấy và hòa tan trong 20 ml ethanol nóng, ta được dung dịch lecithin

2.2.2 Xác định thành phần cấu tạo

Hỗn hợp gồm 1,5 ml dịch chiết lecithin và 1,5 ml H2SO4 10% được cho vào ống nghiệm Sau đó, đun sôi cách thủy trong 20 phút, ta được dịch thủy phân lecithin

- Nhận biết choline

Trung hòa 4 giọt dịch thủy phân lecithin với 4 giọt NaOH 10% Nhỏ 1 giọt dung dịch đã trung hòa trên lên một miếng kính mang vật; sau đó, thêm 1 giọt dung dịch iod, đậy kính đậy vật lại và quan sát dưới kính hiển vi quang học (vật kính E20)

- Nhận biết acrolein bằng mùi mỡ cháy

Mười giọt dịch thủy phân lecithin được cho vào ống nghiệm và đun sôi cách thủy để bốc hơi dung dịch Ống đối chứng được thực hiện tương tự bằng cách thay dung dịch thủy phân lecithin bằng 4 giọt glycerol chuẩn Sau đó, 200 mg kali hydrogen sulfate (KHSO4) được cho vào ống nghiệm và đun đến khi có khói trắng bốc lên

- Nhận biết acid phosphoric

Dịch thủy phân lecithin 10 giọt và dung dịch molypden 3 giọt được cho vào ống nghiệm và đun trên ngọn lửa đèn cồn

3 Kết quả và thảo luận

Lecithin có thể bị thuỷ phân bằng acid, kiềm hay enzyme Khi thuỷ phân lecithin bằng acid tất cả liên kết ester đều bị cắt đứt Khi thuỷ phân lecithin bằng kiềm sản phẩm tạo ra gồm acid béo ở dạng muối, glycerophosphate và choline; nhưng choline bị phân hủy để cho trimetylamin Với kiềm nhẹ chỉ có thể cắt liên kết ester giữa rượu và acid béo Lecithin bị thuỷ phân bằng enzyme lecithinase tác động lên các liên kết ester khác nhau phụ thuộc vào 4 loại enzyme lecithinase

A, B, C hoặc D (Đỗ Quý Hai et al., 2004)

Lecithin sau khi được thủy phân bằng H2SO4 sẽ cho ra các thành phần: choline, acid phosphoric, acid béo và glycerol (Nguyễn Nghiêm Luật, 2003) Phản ứng thủy phân lecithin bằng H2SO4 được trình bày trong Hình 7

Hình 7: Phản ứng thủy phân lecithin

Sau khi dung dịch thủy phân lecithin nguội, trên bề mặt xuất hiện những giọt mỡ, điều này cho thấy trong thành phần lecithin có chứa acid béo Theo Trần

Tố et al., (2008), các acid béo thường gặp trong lecithin lòng đỏ trứng là

palmitic, oleic, linoleic, arachidic

Hình 8: Giọt mỡ trên bề mặt dung dịch thủy phân lecithin

- Nhận biết Choline

Trong thí nghiệm nhận biết choline, dưới kính hiển vi ta thấy có tinh thể dạng mãnh cắt màu nâu, đó là tinh thể choline periodide (Hình 9) Điều này chứng tỏ trong dịch thủy phân có chứa choline (Nguyễn Nghiêm Luật, 2003)

Giọt mỡ

Lecithin

Glycerol

Acid béo Acid phosphoric

Choline

Hình 9: Tinh thể choline periodide dưới kính hiển vi (vật kính E20)

- Nhận biết glycerol

Khi đun nóng với chất khử nước, gốc glycerol trong phân tử lecithin chuyển thành glycerol tự do Sau đó glycerol bị mất nước và tạo thành aldehyde không

no là aldehyde acrilic (acrolein), chất này có mùi khét đặc trưng, dễ nhận biết

(Nguyễn Quang Vinh et al., 2007)

CH2OHCHOH

CH2OH

to

KHSO4

CHOCH

(Nguyễn Quang Vinh et al., 2007)

Ở thí nghiệm này, sau khi đun, ống đối chứng xuất hiện hợp chất màu nâu, hiện tượng xảy ra tương tự với ống chứa dịch thủy phân lecithin, sau khi đun với KHSO4, glycerol được tạo ra sau đó sẽ bị mất 2 phân tử H2O, biến thành acrolein Sau khi có khói trắng bốc lên, phản ứng tạo nên chất có màu nâu được nhận biết

bằng mùi khét đặc trưng, đó chính là acrolein (Nguyễn Quang Vinh et al., 2007)

Điều này chứng tỏ thành phần lecithin có chứa gốc glycerol (Hình 10)

Hình 10: Phản ứng tạo acrolein của glycerol trong dịch thủy phân

lecithin (bên trái), và glycerol nguyên chất (bên phải)

- Nhận biết acid phosphoric:

Theo Nguyễn Nghiêm Luật (2003), H3PO4 tác dụng với ammonium molypdate và acid nitric sẽ tạo thành ammonium phosphomolypdate có màu vàng chanh

Ở thí nghiệm nhận biết phosphoric acid, sau khi dịch thủy phân lecithin

được đun với dung dịch molypden, dung dịch dần dần chuyển sang màu vàng chanh Phản ứng này được thể hiện bằng phương trình ở Hình 11

Hình 11: Phương trình phản ứng giữa phosphoric acid

và ammonium molypdate

Amonium

molypdate

Ammonium phosphomolypdate