GIÁO TRÌNH THỰC HÀNH HÓA SINH HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM - o0o - GIÁO TRÌNH THỰC HÀNH HĨA SINH HỌC LƯU HÀNH NỘI BỘ Thành phố Hồ Chí Minh, 2019 Thực Hành Hóa Sinh Học QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Để đảm bảo hiệu an toàn làm việc phịng thí nghiệm sinh viên phải thực nghiêm túc quy tắc sau: I Nội dung phịng thí nghiệm Điều 1: Sinh viên có nhiệm vụ làm đầy đủ thí nghiệm theo chương trình qui định, phải chuẩn bị đầy đủ lý thuyết trước vào làm thực hành Điều 2: Phải đến phịng thí nghiệm qui định Khơng rời phịng thí nghiệm không phép giáo viên phụ trách Điều 3: Khi làm việc phải giữ trật tự, cấm ăn uống, hút thuốc phịng thí nghiệm Điều 4: Khi sử dụng Hóa chất dễ cháy, dễ nổ, dụng cụ dễ vỡ, đắt tiền phải tuyệt đối tuân thủ theo dẫn giáo viên Điều 5: Cần có ý thức tiết kiệm Hóa chất, tránh gây đổ vỡ dụng cụ Khi đổ vỡ dụng cụ phải báo với giáo viên bồi hồn đầy đủ Điều 6: Khơng di chuyển Hóa chất khỏi chỗ qui định, khơng làm thí nghiệm ngồi bàn qui định Điều 7: Trước mở Hóa chất phải lau nắp cổ chai Điều 8: Dụng cụ dùng để lấy Hóa chất phải thật dùng xong phải rửa Không dùng lẫn dụng cụ lấy Hóa chất cho loại hóa chất khác Điều 9: Cẩn thận làm thí nghiệm, phải trung thực, khách quan báo cáo kết Điều 10: Giữ nơi làm việc, rửa dụng cụ lau chùi ngăn nắp nơi làm việc, bàn giao đầy đủ cho nhân viên phịng thí nghiệm trước Phân công trực nhật buổi thí nghiệm để đơn đốc giữ vệ sinh trật tự Điều 11: Phải thực qui định phòng cháy chữa cháy Điều 12: Khi phải tắt đèn, quạt, ngắt cầu dao điện kiểm tra vịi nước II Quy tắc làm việc với hóa chất độc, dễ nổ, dễ cháy Đa số chất hữu độc hại cần phải nắm vững quy tắc chống độc, chống nổ cháy làm việc với chất hữu Hóa chất phải chứa chai, lọ có nút đậy, dán nhãn Khi cầm chai Hóa chất không xách cố chai mà phải bê đáy chai Sử dụng chất KCN, NaCH, HCN, (CH3)2SO4, CH3NH2, Cl2, NO2… phải đeo găng tay, mặt nạ, kính bảo hiểm phải làm tủ hút không tắt máy tủ cịn khí độc Sử dụng Na, K… phải dùng bình kẹp sắt, lau khơ giấy lọc dùng rượu butylic hay amylic để hủy Na, K dư Brơm chứa bình dầy, màu tối có nút nhám, rót brơm phải tiến hành tủ hút, đeo kính bảo hiểm găng tay Mỗi lần lấy brôm không 10mL, cho vào bình phản ứng phải dùng phuể nhỏ giọt thử độ kín Khi làm việc với H2SO4 đặc phải rót cẩn thận qua phễu tủ hút Pha lỗng axit (acid) H2SO4 phải bình chịu nhiệt rót từ từ axit (acid) vào nước khuấy Trang Thực Hành Hóa Sinh Học Bao đổ axit (bazơ) vào nước pha lỗng Khơng dùng miệng để hút axit (bazơ) Không hút pipette cịn hóa chất lọ Sử dụng chất dễ cháy bezen, enter, axeton, etylacetat, cacbondusunfua, ether dầu hỏa phải để xa lửa, khơng đun nóng trục tiếp lửa mà phải dùng bếp cách thủy III Sơ cứu phịng thí nghiệm Bỏng axit (acid) đặc phải rửa vết bỏng vòi nước lạnh từ – phút, dùng tẩm KMnO4 3% bơi nhẹ lên vết bỏng, dùng natricacbonat lỗng (1%) rửa vết bỏng Bỏng kiềm đặc tiến hành thay nước dung dịch axit axêtic (acetic acid) 1% Khi bị Hóa chất bắn vào mắt phải rửa mắt dòng nước NaCl 1% chảy liên tục đưa đến bệnh viện Bỏng vật nóng (thủy tinh, kim loại) phải bơi dung dịch KMnO4 3% bơi mỡ chống bỏng Bỏng P bôi chỗ bỏng dung dịch CuSO4 2% Trường hợp uống phải acid phải súc miệng uống nước lạnh có MgO Trường hợp uống phải bazơ phải súc miệng uống nước lạnh có axit axêtic (axetic acid) 1% Ngộ độc khí Clo, brơm đưa chỗ thống khí lành Ngộ độc asen, thủy ngân, muối xianua… phải nhanh chóng đưa đến bệnh viện 10 Bị đứt tay phải lau máu, sát trùng cồn hay dung dịch KMnO4 3% cầm máu dung dịch FeCl3 băng lại 11 Khi bị cháy quần áo người với diện tích lớn tuyệt đối khơng chạy chỗ gió phải nằm xuống mà lăn để dập tắt lửa, diện tích cháy bé dùng nước, giẻ lau để dập tắt Trang Thực Hành Hóa Sinh Học NỘI DUNG THỰC HÀNH Buổi BÀI THỰC HÀNH 4 6 10 NỘI DUNG Trang Định tính amino acid phản ứng ninhydrin Xác định amino acid phương pháp sắc ký mỏng Tìm điểm đẳng điện protein phương pháp tạo pH khác Xác định hàm lượng protein thô Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt lực enzyme α-amylase Xác định hoạt tính enzyme bromelin Định lượng đường khử phương pháp DNS Xác định lipide tổng Xác định số acid peroxid chất béo Ôn tập - Kiểm tra kết thúc môn 11 15 17 20 23 27 Trang Thực Hành Hóa Sinh Học Bài ĐỊNH TÍNH AMINO ACID BẰNG PHẢN ỨNG NINHYDRIN Lý thuyết Tất α-amino acid tạo phức màu với thuốc thử Ninhydrin theo chế sau: Khi đun nóng, amino acid tác dụng với Ninhydrin để tạo thành carbonic (CO2), ammonia (NH3), Aldehyde (-CHO) tương ứng có mạch carbon ngắn amino acid Carbon Ninhydrin bị khử Amino acid Ninhydrin Ninhydrin bị khử Sau Ninhydrin bị khử kết hợp với NH3 vừa tạo thành tiếp tục phản ứng với phân tử Ninhydrin thứ hai tạo thành hợp chất màu xanh tím có độ hấp thu quang học bước sóng 570nm Các α-amino acid tạo phức màu xanh tím với Ninhydrin, amono acid khác tạo màu xanh tím với Ninhydrin khơng tạo CO2 Các Prolin Oxyprolin tác dụng với Ninhydrin lại tạo phức màu vàng không tạo NH3 Các protein, peptide, muối ammonium ammonia tạo màu xanh tím với thuốc thử ninhydrin, muốn xác định riêng amino acid cần phải loại bỏ hợp chất khỏi dung dịch Thực hành 2.1 Dụng cụ- hóa chất +Dụng cụ:  Ống nghiệm  Giá đỡ ống nghiệm : : Trang Thực Hành Hóa Sinh Học  Đèn cồn  Pipette 1mL  Bóp cao su : : :  Becher 100 mL :  Ống nhỏ giọt : +Hóa chất: - Dung dịch Glycine 0,02% (NH2CH2COOH hay C2H5O2N) - Dung dịch Protein trứng - Thuốc thử Ninhydrin 0,1% (C9H6O4) 2.2 Tiến hành Lấy hai ống nghiệm đánh số thứ tự Ống Glycine 0,02% (mL) Protein trứng (mL) Ninhydrin 0,1% (giọt) 5 Đun nóng hai ống nghiệm phút đèn cồn đun cách thủy nhiệt độ 70C phút Yêu cầu Quan sát xuất màu ống nghiệm Giái thích kết + Câu hỏi mở rộng: Nêu phương pháp định tính amino acid khác mà em biết Viết phương trình phản ứng giải thích tượng Trang Thực Hành Hóa Sinh Học Bài XÁC ĐỊNH AMINO ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG Lý thuyết Tùy thuộc vào cấu tạo hóa học mà amino acid có khả hịa tan dung môi khác nhau, chịu lực tác động trọng trường khác Dựa theo tính chất tách hỗn hợp amino acid tùy theo hệ số phân bố chúng hai pha lỏng pha rắn hệ thống sắc ký Dung môi hữu (pha động) tác dụng lực mao quản chạy qua giá mang cellulose silica gel (pha tĩnh) có chứa hỗn hợp amino acid hịa tan amino acid phụ thuộc vào tính hịa tan loại amino acid loại dung mơi hữu Như vậy, dung môi hữu di chuyển liên tục qua chất mang (có cấu trúc rỗng tạo nên lực mao quản) làm cho amino acid di chuyển từ vạch xuất phát điểm kết thúc với vận tốc khác Cùng thời gian di chuyển gía mang dung mơi hữu cơ, amino acid khác có chiều dài khoảng cách khác Hình 2.1: Mơ hình chạy sắc ký Thực hành 2.1 Sắc ký giấy Cellulose Thin Layer Chromatography (TLC) 2.1.1 Dụng cụ-hóa chất a Dụng cụ:       Giấy sắc ký Bồn sắc ký Giá mang Micropipette Bình phun sắc ký Máy sấy tóc b Hóa chất Trang Thực Hành Hóa Sinh Học  Dung môi TLC gồm Butanol: Nước: Acid acetic = 5:5:1    Dung dịch Ninhydrin 0,1% mẫu amino acid chuẩn (10mg/mL nước) Mẫu amino acid thí nghiệm (10mg/mL nước) 2.1.2 Cách tiến hành Dùng bút chì vẽ đường thẳng làm vạch xuất phát cách mép sắc ký giá mang 1,5cm vạch đích đến cách vạch xuất phát 10cm Tiếp tục vẽ dấu chấm tròn lên vạch xuất phát đánh dấu vị trí tương ứng mẫu amino acid Dùng micropipettete chấm dung dịch amino acid lên giấy sắc ký vị trí đánh dấu vạch xuất phát Dùng máy sấy tóc sấy giọt dung dịch amino acid vừa chấm, không cho dung dịch loang khỏi vòng tròn Chấm khoảng lần cho mẫu Cho dung môi chạy sắc ký vào bồn cho ngập qua mép sắc ký khoảng cm Đặt sắc ký vào bồn, đậy nắp kín lại để n đến dung mơi chạy đến vạch đích Lấy sắc ký ra, đặt vào tủ Hotte 15 phút để đuổi hết dung môi Phun ninhydrin lên sắc ký Dùng máy sấy tóc sấy khơ quan sát vệt màu xuất giấy sắc ký Xác định amino acid có mẫu cách so sánh vị trí vệt màu sắc ký đồ mẫu với sắc ký đồ dung dịch amino acid chuẩn 2.2 Sắc ký Fluorescent Silica 2.2.1 Dụng cụ-hóa chất + Dụng cụ:     Bản sắc ký silica (giá mang thủy tinh có nhuộm Fluorescent) Bồn sắc ký Micropipette Máy sấy tóc + Hóa chất  Dung mơi sắc ký gồm CHCl3: ethanol = 98:2  Ethyl acetate  Mẫu amino acid chuẩn (10mg/mL ethyl acetate)  Mẫu amino acid thí nghiệm (10mg/mL ethyl acetate) 2.2.2 Cách tiến hành: Kích hoạt sắc ký Fluorescent silica gel cách sấy 15 phút nhiệt độ 1050C Dùng bút chì vẽ đường thẳng làm vạch xuất phát cách mép sắc ký giá mang 0,5 cm vạch đích đến cách vạch xuất phát cm Tiếp tục vẽ dấu chấm tròn lên vạch xuất phát đánh dấu vị trí tương ứng mẫu amino acid Dùng micropipettete hút μL (hoặc giọt) dung dịch amino acid cho lên sắc ký vị trí đánh dấu vạch xuất phát Trang Thực Hành Hóa Sinh Học Cho dung mơi chạy sắc ký vào bồn sắc ký cho ngập qua mép sắc ký khoảng cm Đặt sắc ký vào bồn, đậy nắp kín lại để yên đến dung mơi chạy đến vạch đích Lấy sắc ký ra, đặt vào tủ Hotte 15-20 phút để đuổi hết dung mơi (hoặc dùng máy sấy tóc đuổi hết dung môi) Lưu ý: Trường hợp sắc ký tẩm Fluorescent phun ninhydin sấy sắc ký giấy Xác định amino acid có mẫu cách so sánh vị trí vệt màu sắc ký đồ mẫu với sắc ký đồ dung dịch amino acid chuẩn buồng chiếu UV 3.Yêu cầu Thực xác định mẫu amino acid theo hướng dẫn Giải thích kết nêu ý nghĩa bước tiến hành Câu hỏi mở rộng: Trình bày chế tác dụng màu Ninhydrin lên amino acid Tại phải kích hoạt sắc ký Fluorescent silica trước chạy sắc ký? Giới thiệu nêu nguyên tác số phương pháp tách chiết amino acid khác mà bạn biết Trang Thực Hành Hóa Sinh Học Bài TÌM ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO pH KHÁC NHAU Lý thuyết Tại pH môi trường làm cho phân tử amino acid protein có tổng số điện tích dương với tổng số điện tích âm hay nói cách khác tổng điện tích chúng pH gọi điểm đẳng điện (pHi) amino acid hay protein Tại pHi protein có khuynh hướng không di động điện trường dễ dàng kết tụ lại với tạo thành tủa protein Phản ứng kết tủa protein điểm đẳng điện diễn nhanh chóng mơi trường bổ sung thêm dung môi hữu alcol, aceton… hay polyphenol (tanin) nhân tố có tác dụng loại nước tạo nên phức chất không tan với base dị vòng Điểm đẳng điện đặc trưng cho loại amino acid protein như: +Điểm đẳng điện amino acid: Asp (D) 2,77 Glu (E) 3,22 Ser (S) 5,68 Val (V) 5,96 Ala (A) 6,02 Lys (K) 9,74 Arg (R) 10,76 +Điểm đẳng điện protein: Albumine trứng 4,6 Caseine 4,7 Gelatine 4,9 Globuline 5,2 Albumine huyết 4,9 Trong tiến hành xác định điểm đẳng điện Albumin trứng 2.Thực hành 2.1 Dụng cụ-hóa chất +Dụng cụ:  Ống nghiệm :  Giá đỡ ống nghiệm :  Pipette mL :  Bóp cao su :  Becher 100 mL :  Bình định mức 100 mL : +Hóa chất:  Dung dịch protein trứng 5%  Dung dịch Sodium phosphate 0,2M (Na2HPO4.12H2O)  Dung dịch Acid citric 0,1M (C6H8O7.H2O)  Cồn 96 2.2 Phương pháp tiến hành Lấy ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1-3 STT Dung dịch Na2HPO4 0,2M (mL) 0,34 0,48 0,66 Dung dịch C6H8O7 0,1M (mL) 0,66 0,52 0,34 pH đạt 3,7 4,7 5,7 Lắc ống để dung dịch đệm có độ pH tương ứng Trang Thực Hành Hóa Sinh Học Bài ẢNH HƯỞNG CỦA pH MÔI TRƯỜNG ĐẾN HOẠT LỰC ENZYME α-AMYLASE Lý thuyết Mỗi enzyme hoạt động tốt pH môi trường xác định (pH opt), pH thấp cao pHopt enzyme làm giảm hoạt lực enzyme Trong điều kiện khơng có chất ức chế chất kích hoạt, pHopt α-amylase đại mạch 5,8 Trong khảo sát khả hoạt động α-amylase pH khác Thực hành 2.1 Dụng cụ hóa chất 2.1.1 Dụng cụ - Ống nghiệm =25 mm - Becher 250ml - Pipette 10 mL - Pipette mL - Pipette mL - Bóp cao su - Ống nhỏ giọt - Mặt kính đồng hồ - Phễu lọc - Erlen 250 ml - Cối chày sứ 2.1.2 Hóa chất: : : : : : : : : : : : - Dịch chiết -amylase đại mạch (malt) - Giấy lọc - Ethanol - Dung dịch sodium phosphate dibasic 0,2M (Na2HPO4.12H2O) - Dung dịch acid citric 0,1M (C6H8O7.H2O) - Dung dịch Tinh bột 0,2% dung dịch muối NaCl 0,1% - Thuốc thử Lugol Phương pháp tiến hành: Cân 5g lúa nảy mầm vào cối với 10 ml nước cất, nghiền nước Để yên 15 phút, đem lọc Lấy 5ml nước lọc thêm vào 20ml cồn tuyệt đối Khuấy đều, ta thấy amylase protein kết tủa Để lắng, đổ phần nước bên qua giấy lọc Chất kết tủa lắng đáy, cho thêm 3ml cồn tuyệt đối vào, lắc vào dễ lắng Cho phần dịch qua giấy lọc giữ chất trầm lại Rửa lần với cồn tuyệt đối Sau kỳ rửa chót, đổ tất kết tủa lên giấy lọc Trang 15 Thực Hành Hóa Sinh Học Khi tất cồn chảy qua hết, để ống nghiệm phễu để giấy lọc 10ml nước cất hịa tan độ kết tủa Ta có dung dịch amylase (và vài protein khác) Lấy ống nghiệm đánh số từ 1-7 Tiến hành thêm hóa chất theo bảng sau: Ống nghiệm Na2HPO4 0,2M (mL) C6H8O7 0,1M (mL) 9,34 10,30 11,14 12,08 13,22 14,54 16,46 10,66 9,70 8,86 7,92 6,78 5,46 3,54 đạt Tinh bột 0,2% (mL) Dịch chiết enzyme (mL) 4,6 5,0 5,4 5,8 6,2 6,6 7,0 5 5 5 1 1 1 pH Màu với Lugol Nhỏ giọt thuốc thử Lugol lên mặt kính đồng hồ, phút nhỏ dung dịch ống lên giọt thuốc thử Lugol Dùng đũa thủy tinh khuấy quan sát màu chúng Khi dung dịch ống âm tính với Lugol (tức khơng cịn xuất màu xanh tím) nhỏ giọt Lugol vào tất ống nghiệm 3.Yêu cầu: Quan sát màu ống Giải thích tượng kết luận pH đẳng điện α-amylase Câu hỏi mở rộng Trình bày yếu tố tác động lên hoạt tính Enzyme Trình bày mối tương quan yếu tố tác động lên hoạt tính enzyme Trang 16 Thực Hành Hóa Sinh Học Bài KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE Lý thuyết Cho Protease tác dụng với Casein Hemoglobin, sau ức chế Enzyme TriCloAcetic acid (TCA) để dừng phản ứng, xác định sản phẩm tạo thành phản ứng màu với thuốc thử Folin Biểu diễn hoạt tính đơn vị hoạt độ Một đơn vị hoạt độ lượng enzyme phút 300C phân giải lượng protein tương đương với mol tyrosine Thực hành 2.1 Dụng cụ-hóa chất 2.1.1 Dụng cụ - Ống nghiệm : 15 - Phễu lọc : - Becher 250ml : - Pipette 10 mL : - Pipette mL : - Bóp cao su : - Ống nhỏ giọt : - Bình tia : 2.1.2 Hóa chất – vật liệu - Thuốc thử Folin (pha loãng lần) Na2CO3 6% NaOH 0,5N TCA 5% Casein 1% dung dịch đệm phosphat 1/15M pH 8,0 Dung dịch Tyrosine chuẩn 1mM (0,09g tyrosine 500mL dd HCl 0,2N) - Vải lọc 2.1.3 Nguyên liệu Chọn trái dứa xanh tươi, gọt bỏ lớp vỏ ngoài, cắt nhỏ xay nát Lọc qua vải vắt nước Nước dứa đem ly tâm 6.000 vòng/phút 10 phút Lấy dịch bên có chứa enzyme Bromeline 2.3 Thực hành 2.3.1 Dựng đường chuẩn Tyrosine: Thực theo bảng sau: Dung dịch hóa chất Dung dịch Tyrosine chuẩn (mL) 0,2 0,4 Ống nghiệm 0,6 0,8 Trang 17 Thực Hành Hóa Sinh Học Lượng Tyrosine tương ứng 0,2 0,4 0,6 0,8 (µM) Dung dịch HCl 0,2N (mL) 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung dịch NaOH 0,5N (mL) 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin pha loãng (mL) 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm 5,0 10 2.3.2 Xác định lượng Tyrosine dung dịch nghiên cứu Hóa chất Ống nghiệm Thử thật (1) Dung dịch Casein 1% (mL) Dung dịch TCA 5% (mL) Dung dịch enzyme mẫu (mL) Lắc giữ 35,50C 10 phút Dung dịch TCA 5% (mL) 10 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên Thử không (2) 10 Lấy ống nghiệm mới, sạch, đánh dấu A B Cho vào ống A 5mL dịch lọc từ ống nghiệm cho vào ống B 5mL dịch lọc từ ống nghiệm Thêm vào ống 10mL NaOH 0,5N 3mL thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo OD bước sóng 660nm Tính ΔOD = ODT-OD0 Dựa vào đồ thị chuẩn suy µM Tyrosine 2.3.4 Kết quả: Hoạt độ Enzyme Protease tính theo công thức: Hoạt độ P = MTyro sin V  L (UI) t mv Với: V : Tổng thể tích hỗn hợp ống nghiệm (mL) v : Thể tích dịch lọc đem phân tích (mL) t : Thời gian thủy phân (phút) m : Khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L : Độ pha lỗng mẫu enzyme µM Tyrosine: Lượng µM Tyrosine v (mL) suy từ đường chuẩn 3.Yêu cầu Dựng đường chuẩn Tyrosine Xác định hoạt độ Bromelin giải thích kết Câu hỏi mở rộng Nêu ý nghĩa đường chuẩn phương pháp xác định hoạt độ enzyme Có cách xác định khác phương pháp xác định hoạt độ enzyme mà khơng dùng đường chuẩn Trang 18 Thực Hành Hóa Sinh Học Giải thích phản ứng màu Folin sản phẩm thủy phân Protease Trình bày yếu tố ảnh hưởng lên phương pháp xác định hoạt độ enzyme Trang 19 Thực Hành Hóa Sinh Học Bài ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNS LÝ THUYẾT Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử acid dinitrosasylic tính đường khử mẫu nghiên cứu DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT Ống nghiệm có nắp: Becker 250ml: Pipet 10ml: Đũa thủy tinh: Pipet 1ml: Bình tia: Bình định mức 100ml: Bình định mức 250 ml: Cối chày sứ: Cuvet: Phễu thủy tinh: Ống đong 100ml: Bóp cao su: Lưới amiăng: Nồi: Bếp điện: Thuốc thử acid ditrosalisylic(DNS):Cân 1g DNS pha 20ml NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất 30g muối Sodium potasium tartrate, đun cách thủy cho tan định mức tới 100ml Dung dịch glucose mẫu (500ppm): cân 0,5g D-glucose pha nước cất thành lit Dung dịch glucose mẫu (50ppm): hút 10ml dung dịch chuẩn glucose 500ppm cho vào bình định mức, thêm nước cất, định mức 100ml, lắc THỰC HÀNH 3.1 Cách tiến hành Cân khoảng 4-6 gam táo hay mận, nghiền nhỏ, tiến hành trính ly 40ml cồn 90 độ cách chưng cách thủy cho sôi khoảng 10 phút becker 250ml Gạn phần dịch suốt trích ly qua becher khác (becher thứ 2), thêm 40ml cồn 80 độ Trang 20 Thực Hành Hóa Sinh Học vào bã táo hay mận (phần lại becher đầu) tiến hành trên, làm lần để đảm bảo lượng đường trích ly hồn tồn Sau đó, tiến hành khơ tồn dịch trích ly becker thứ (của lần trích ly) Khi dịch khơ 30ml dừng lại, cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cho đủ, lắc Hút 10ml dung dịch sau định mức cho vào bình định mức 100ml thêm nước cho đủ 100ml lắc Đây dung dịch chuẩn bị tạo phức để đo độ hấp thu Nếu hàm lượng đường mẫu định mức (pha loãng) lần Lập đường chuẩn với dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 50ppm tiến hành tạo phức màu cho mẫu theo bảng sau: Ống nghiệm Chuẩn Glucose 50ppm Dịch xác định Dung dịch DNS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 M1 M2 2 0.5 0.5 Đậy nắp ống nghiệm, chưng cách thủy sôi Nước cất 9.5 8.5 7.5 6.5 5.5 7.5 7.5 Chú ý: Sau cho thuốc thử DNS vào tiến hành chưng cách thủy cho sơi đến có màu nâu đỏ (chuyển toàn ống nghiệm vào becker 250ml chưng cách thủy) sau để nguội thêm nước cất cho đủ 10ml bảng Tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 530nm Một số ý đo: Nếu màu phức đo đậm hay nhạt giảm hay tăng thể tích chuẩn cho phù hợp bổ sung thể tích cịn lại nước cất cho đủ 10 ml, pha chuẩn có nồng độ thấp hay cao Nếu độ hấp thu mẫu nằm đường chuẩn tăng hay giảm lượng mẫu cho giá trị đo nằm đường chuẩn 3.2 Tính kết Từ số liệu thu lập đường chuẩn: y = ax, từ tìm Cx Cơng thức hàm lượng đường khử tính sau: Trang 21 Thực Hành Hóa Sinh Học ppmbd  C x  Vdo Vdm Vdm1   Vxd2 Vxd1 m bd  C %bd  C x  Vdo Vdm Vdm1 100    Vxd2 Vxd1 m bd 106 Trong đó: Vđo thể tích dung dịch phức đo, 10 ml Vxd1 Vxd2 thể tích đem xác định lần 2, 10 ml, ml Vdm1 Vdm2 thể tích định mức lần 2, 100 ml, 100 ml mbd khối lượng mẫu đem xác định Yêu cầu Báo cáo giải thích kết Câu hỏi mở rộng Trình bày vài trị DNS thí nghiệm Nêu ứng dụng khác DNS ngành công nghiệp Nêu vai trị đường khử cơng nghiệp chế biến Trang 22 Thực Hành Hóa Sinh Học Bài XÁC ĐỊNH LIPIDE TỔNG Lý thuyết: Lipide ester rượu đa chức acid béo (loại acid béo có khối lượng phân tử lớn, có gốc acid photphoric nhóm base chứa nitogen) Lipide nhóm hợp chất hữu cơ, phân tử có chứa nhóm ester acid béo (loại acid béo có khối lượng phân tử lớn) Các lipide không tan nước rượu, tan dung môi hữu Nguyên liệu giàu lipide sau làm khô, trích ly lipide khỏi nguyên liệu ether etylic ether dầu hỏa Soxhlet, xác định khối lượng chất béo trích ly hai cách: tính lượng mẫu sau trích ly chất béo đuổi dung môi để thu trực tiếp chất béo trích ly khỏi mẫu, cân khối lượng 2.Thực hành: 2.1 Hóa chất: 2g mẫu, 150mL ether etylic ether dầu hỏa, aceton, giấy lọc 2.2 Dụng cụ: - Thiết bị Soxhlet: Becher 100mL: Đũa thủy tinh: 2.3 Phương pháp tiến hành:  Chuẩn bị mẫu: - Cân xác khoảng 2g nguyên liệu nghiền nhỏ - Làm khô nguyên liệu cách sấy nguyên liệu tủ sấy nhiệt độ 100 – 1050C (với sữa khoảng 1000C) đến khối lượng khơng đổi, để nguội bình hút ẩm Ghi nhận khối lượng nguyên liệu sấy khơ hồn tồn - Đồng thời cắt mảnh giấy lọc kích thước 8x10cm, gấp thành bao nhỏ, sấy nhiệt độ 1050C tủ sấy đến khối lượng không đổi, để nguội bình hút ẩm, cân bao giấy Ghi nhận khối lượng giấy sấy khơ hồn tồn - Cho mẫu vào bao giấy, tránh rơi rớt  Chuẩn bị dụng cụ: - Rửa dụng cụ, tráng lại aceton phần bình đun, bình chiết ống xi phông thiết bị Soxhlet - Sấy khô tủ sấy nhiệt độ 1050C Trang 23 Thực Hành Hóa Sinh Học - Lau phần dụng cụ tiếp xúc với nguyên liệu miếng giấy lọc có tẩm ether (lau lần miếng giấy lọc khác nhau) 2b 2a Sơ đồ máy Soxhlet Các phận máy - Bình đun - Bình chiết 2a - Xifon dẫn dung môi lên hệ thống sinh hàn 2b - Xifon dẫn dung môi xuống bình đun - Hệ thống sinh hàn - Nồi cách thủy  - Chuẩn bị mẫu thiết bị Soxhlet: Đặt bình đun lên nồi cách thủy Lắp bình chiết khớp với miệng bình đun Đặt bao mẫu vào đáy bình chiết Trang 24 Thực Hành Hóa Sinh Học Đặt phễu thủy tinh lên miệng ống sinh hàn Lắp hệ thống dẫn nước ống sinh hàn Cho nước chảy vào kiểm tra hoạt động hệ thống sinh hàn, tạm thời tắt nước - Cho ether vào qua phễu thủy tinh, cho ether đủ ngập mẫu chiếm khoảng 2/3 dung tích bình đun - Kiểm tra lại độ kín tồn hệ thống  Quá trình chiết rút lipide thiết bị Soxhlet: - Cho gói mẫu vào ống trụ, ý gói mẫu phải có bề rộng nhỏ đường kính ống trụ chiều dài ngắn chiều cao ống chảy tràn Nước sinh hàn phải mạnh Có thể làm nút bơng gịn phía phễu ống sinh hàn - Bật bếp cách thủy nhiệt độ 45 – 500C - Mở nước hệ thống sinh hàn - Ether sôi, chuyển thành dạng hơi, theo siphon dẫn lên bình chiết, bay vào ống dẫn sinh hàn, gặp lạnh, ngưng tụ lại rơi vào bình chiết, hịa tan lipide nguyên liệu bình chiết - Khi mức ether có chứa lipide bình chiết dâng lên, ngập siphon dẫn dung mơi xuống bình đun, ether chảy xuống bình đun Tại ether đun sơi, chuyển thành dạng hơi, theo siphon dẫn dung mơi lên bình chiết, bay vào ống sinh hàn, ngưng tụ lại rơi vào bình chiết Quá trình lặp lặp lại - Kiểm tra nguyên liệu chiết hết Lipide cách sau: o Ether ống trụ không màu o Lấy vài giọt dung môi ống trụ nhỏ vào miếng giấy lọc Nếu vết loang dung môi sau khô không phân biệt giấy trắng coi trích ly hết lipide o Lấy vài giọt dung môi nhỏ miếng thủy tinh, bay hết dung mơi khơng cịn đọng lại vết chất béo coi trích hết Lipide 2.4 Kết - 2.4.1 Xác định lipide đồng thời nhiều mẫu nguyên liệu: - - Tháo bình chiết, gắp mẫu đũa thủy tinh, đặt lên becher, để tủ hút cho bay hết ether Để tủ sấy, sấy nhiệt độ 1050C giờ, để nguội bình hút ẩm, cân bao giấy có chứa mẫu Tính kết quả: Hàm lượng lipide có nguyên liệu: % lipide  B  C   100 G Với: G: Khối lượng mẫu đem phân tích (g) B: Khối lượng bao giấy có chứa mẫu độ khô tuyệt đối (khối lượng giấy khô tuyệt đối + khối lượng mẫu khô tuyệt đối) (g) C: Khối lượng bao giấy có chứa mẫu chiết rút lipide độ khô tuyệt đối (g) 2.4.2 Xác định lipide mẫu nguyên liệu: - Lắp hệ thống chưng cất thu hồi ether Trang 25 Thực Hành Hóa Sinh Học - - Khi cịn cặn lipide ether bình cầu, ta đun cách thủy nhẹ để đuổi ether Khi ether bay hết, cho vào tủ sấy, 100 – 1050C Để nguội 30 phút bình hút ẩm Cân xác Tính kết quả: Hàm lượng lipide thơ ngun liệu tính theo cơng thức: % lipide  (m1  m2 ) x 100 G Trong đó: m1 : Khối lượng bình cầu có chứa lipide (g) m2 : Khối lượng bình cầu khơng (g) G : Khối lượng ngun liệu (g) 3.Yêu cầu Báo cáo giải thích kết Câu hỏi mở rộng Trình bày nguyên tắc vận hành hệ thống Soxhlet ứng dụng hệ thống thí nghiệm sản xuất Trang 26 Thực Hành Hóa Sinh Học Bài XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ SỐ ACID VÀ PEROXID CỦA CHẤT BÉO Xác định số acid 1.1 Lý thuyết: Định nghĩa: Chỉ số acid lượng mg KOH cần thiết để trung hòa acid tự chứa 1g chất cần thử Nguyên lý: Dùng NaOH 0,1N để trung hòa acid tự chất cần thử, với phenolphthalein làm thị màu 1.2 Thực hành: 1.2.1 Dụng cụ: - Buret 25mL Giá đỡ buret Erlen 250mL Cốc 100mL Ống đong 50mL Pipette 5mL 1.2.2 Hóa chất: - Cồn 96 Ether trung tính NaOH 0,1N Phenolphthalein 1% 1.2.3 Phương pháp tiến hành: Cân 5g dầu mỡ, hòa tan 50mL hỗn hợp gồm 25mL cồn 25mL ether trung tính Chuẩn độ NaOH 0,1N có màu hồng bền vững với Phenolphthalein sau 30 giây Đối với loại tinh dầu có nhiều ester dễ bị xà phịng hóa, ta sử dụng dung dịch NaOH 0,05N để chuẩn độ 1.2.4 Kết quả: Chỉ số acid A = Trong đó: 5,61 / 2,805 a / a’ b 5,61.a = 2,805 a′ b b : số mg KOH tương ứng với 1mL NaOH 0,1N / 0,05N : số mL NaOH 0,1N / 0,05N sử dụng định lượng : trọng lượng chất thử để định lượng (g) Trang 27 Thực Hành Hóa Sinh Học Sự hóa chất béo – Chỉ số Peroxide 2.1 Lý thuyết Khi có mặt O2 khơng khí, acid béo có thành phần dầu mỡ acid béo khơng no dễ dàng bị hóa phần tạo thành peroxide Hiện tượng xảy làm dầu mỡ bị ôi hay bị khô Việc xác định số peroxide dựa vào phản ứng sau: Lượng Iodine phóng thích chuẩn độ dung dịch natrithiosunfat: Na2S2O3 + I2 → 2NaI+ Na2S4O6 2.2 Dụng cụ - hóa chất 2.2.1 Dụng cụ - Erlen 250mL Erlen nút nhám 250 ml Bóp cao su Ống đong Buret 25mL Becher 100mL 2.2.2 Hóa chất - EDTA 5% Cloroform Acid acetic Dung dịch KI bão hòa (59,8g KI/100mL) Na2S2O3 0,002N Chỉ thị hồ tinh bột 1% 2.3 Thực hành - Cho vào erlen khoảng 100mL dầu thực vật Ở erlen bổ sung thêm 5mL EDTA 5% (cho dịng khí qua erlen này, dùng máy bơm) Sau thời gian giờ, lấy 5mL dung dịch dầu đem xác định số peroxide Thêm vào 30mL hỗn hợp Cloroform – Acid acetic tỉ lệ 1:2 Lắc Thêm tiếp 1mL dung dịch KI bão hòa Đậy nắp Lắc hỗn hợp cẩn thận phút (thỉnh thoảng mở nắp), để yên phút bóng tối Thêm vào hỗn hợp khoảng 50mL nước cất Định phân iod dung dịch Na2S2O3 0,002N với vài giọt thị hồ tinh bột 1% dung dịch màu xanh tím hồn tồn Nếu lượng Na2S2O3 0,002N dùng nhiều chuẩn độ lại với dung dịch Na2S2O3 0,1N Trang 28 Thực Hành Hóa Sinh Học - Đồng thời làm thí nghiệm kiểm chứng khơng có chất béo Nếu chuẩn độ mẫu trắng vượt q 0,1mL Na2S2O3 0,1N phải pha lại hóa chất 2.4.Kết quả: Chỉ số peroxide biểu thị số milimol peroxide 1kg chất khử PoV= Với: 0,05: V: v: p: 500: 0,05  (V  v)  1000 p  500 Số milimol peroxide tương ứng với 1mL Na2S2O3 chuẩn (1N) Số mL Na2S2O3 0,002N dùng để chuẩn độ mẫu thử Số mL Na2S2O3 0,002N dùng để chuẩn độ mẫu trắng Trọng lượng mẫu thử dùng để định lượng chuyển từ dung dịch 0,002N sang dung dịch 1N 2.5.Yêu cầu Báo cáo giải thích kết Câu hỏi mở rộng Trình bày mối nguy hiểm hóa chất béo cơng nghệ sản xuất dinh dưỡng cộng đồng Nêu phương pháp phịng chống hóa chất béo Trang 29