BỘ GIÁO DỤC VA DAO TAO _TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆ
NGUYỄN XUÂN THÀNH - VŨ THỊ HỒN
NGUYỄN THỊ MINH - HỒNG HẢI
Chủ biên và hiệu dính: PGS.TS S.Ng Kuan |
Trang 3
66609 | BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO — 51
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP I HÀ NỘI
NGUYÊN XUÂN THÀNH - VŨ THỊ HỒN
NGUYÊN THỊ MINH - HỒNG HẢI
Chủ biên và hiệu đính: PGS.TS Nguyễn Xuân Thành
GIÁO TRÌNH
Trang 463 - 630
Trang 5LỜI NĨI ĐẦU
Theo quyết định của Bộ Giáo dục và Đào tạo, từ khố học 2004 - 2005 khung chương trình đào tạo các mơn học khối Nơng - Lâm - Ngư cho bac dai hoc va cao dang sẽ được điều chỉnh
Số trình thực hành mơn học sẽ được bổ sung để nâng cao tay nghề, đáp ứng nhu cầu
xã hội sau khi sinh viên ra trường
Giáo trình thực tập vi sinh vật được biên soạn dùng làm tài liệu học thực tập cho
sinh viên khối Nơng - Lâm - Ngư, nhất là các ngành Nơng học, Bảo vệ thực vật, Khoa học Mơi trường, Khoa học đất, Nơng hố Thổ nhưỡng, Lâm nghiệp, Di truyền, Chọn giống, Cơng nghệ lên men, Thuỷ nơng cải tạo đất
Trong quá trình biên soạn, chúng tơi đã cố gắng viết ngắn gọn, dễ hiểu và cĩ tính
khoa học hiện đại, nhưng do điều kiện học thực hành chưa cho phép, các bài thực hành
phải cĩ tính khả thi cao, do đĩ rất cĩ thể cịn chưa được hồn hảo và chưa tiếp cận được các thành tựu khoa học, nên giáo trình khơng tránh khỏi thiếu sĩt, mong được sự gĩp ý
của các bạn đọc để giáo trình hồn thiện hơn
Trang 7Bài I
TRANG THIẾT BỊ CẦN THIẾT NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT
VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT
Mục đích, yêu cầu:
+ Biết được những trang thiết bị, máy mĩc và dụng cụ cần thiết của phịng nghiên
cứu vi sinh vật
+ Biết sử dụng và vận hành một số máy mĩc thơng dụng của phịng nghiên cứu vi
sinh vat
+ Thấy rõ được tầm quan trọng của cơng tác tiêu độc, khử trùng
+ Nắm vững phương pháp sử dụng kính hiển vi để quan sát hình thái các vi sinh vật
+ Phân biệt các dạng hình thái của vị sinh vật Nội dung thực hành:
+ Giới thiệu những trang thiết bị cần thiết để nghiên cứu vi sinh vat
+ Giới thiệu các dụng cụ và nguyên liệu cần thiết để nghiên cứu vi sinh vậi: duis
cụ lọc, khử trùng, dụng cụ quang học, dụng cụ đo lường
+ Thực hành sử dụng kính hiển vi dé quan sát hình thái nhuộm màu các loại vị sinh vật
I MAY MOC
Máy mĩc trong phịng thí nghiệm dùng để nghiên cứu về vi sinh vật cĩ nhiều loại, nhưng cĩ một số loại rất cần thiết, phải dùng thường xuyên, do đĩ cần hiểu biết va nam vững nguyên lý và cách sử dụng của từng loại máy
1 Tủ nudi cay vi sinh vat
Tủ ấm là thiết bị quan trọng dùng trong cơng tác nghiên cứu vị sinh vật, vì nhiệt độ
trong tủ cĩ thể thay đổi từ 0°- 80”C tuỳ theo ý muốn của người nghiên cứu và nhiệt độ trong tủ sau khi đã được xác định thì luơn luơn ở trạng thái ổn định trong suốt thời gian
nuơi cấy :
1.1 Cấu tạo:
Cấu tao vỏ tủ ấm đều cĩ 2 lớp, lớp trong là kim loại dẫn nhiệt để giữ nhiệt độ bên
Trang 8Trong tủ cĩ mắc bộ phận cảm nhiệt để báo nhiệt độ lên xuống cho ro-le hoat dong
Phần ngồi tủ nuơi cĩ lắp một hệ thống máy tự động điều chỉnh nhiệt độ Ngồi
tủ cĩ 2 núm điều chỉnh nhiệt độ: núm diều chỉnh nhiệt độ lớn và núm điều chỉnh
nhiệt độ nhỏ, cĩ cơng tắc đĩng mở mạch điện và nhiệt kế theo dõi nhiệt độ cắm trên
nĩc tủ ấm
1.2 Cách sử dụng:
Sau khi đĩng mạch điện, xoay núm điều chỉnh nhiệt độ lớn cho kim chỉ tới nhiệt độ cần thiết, thí dụ để ở 28C, sau đĩ phải điều chỉnh kim ở núm điều chỉnh nhiệt độ nhỏ về số 0 Nhiệt độ trong tủ ấm tăng dần và đạt tới nhiệt độ trong phạm vi đã xác định Nếu như nhiệt độ trong tủ tăng cao hoặc thấp hơn nhiệt độ xác định một vài độ thì phải dùng - núm điều chỉnh nhiệt độ nhỏ để điều chỉnh giảm hay tăng một vài độ trên bảng chia độ
Theo dõi nhiệt kế cắm trên tủ ấm, nếu thấy cĩ sự tăng giảm thì lại điều chỉnh lần nữa
cho tới khi đạt yêu cầu
Khi đang cĩ điện đốt nĩng thì đèn đỏ bật sáng, khi nhiệt độ đã đạt yẻu cầu rồi thì
bộ phận cảm nhiệt làm việc và báo cho role điều chỉnh hoạt động, mạch bị ngắt, đèn
xanh bật sáng, đèn đỏ tắt Quá trình tiếp diễn liên tục như vậy trong suốt thời gian tủ làm
việc để duy trì nhiệt độ
1.3 Khi sử dụng máy cần chú ý những điểm sau đây:
+ Phải nối tủ với dây đất và kiểm tra điện thế của máy với điện thế ở nơi đặt máy xem cĩ giống nhau khơng, trường hợp khơng giống nhau phải dùng biến thế
+ Khi sử dụng tủ ấm lần đầu tiên thì phải kiểm tra bộ phận điều chỉnh nhiệt độ xem cĩ chính xác khơng, nhiệt độ trong tủ cĩ đều khơng?
+ Thường xuyên theo dõi sự thay đổi của đèn đỏ, đèn xanh, bình thường đèn thay đổi 1 - 2 lần trong một phút nếu cĩ bất thường phải tắt điện và kiểm tra lại ngay
+ Theo dõi nhiệt độ biến đối trên nhiệt kế để điều chỉnh cho thích hợp với yêu
cảu Nếu nhiệt độ chênh lệch ít thì điều chỉnh bằng núm bên trái (núm điều chỉnh nhỏ), cịn nhiệt độ chênh lệch nhiều (theo đơn vị độ) thì điều chỉnh núm bên phải (núm điều chỉnh lớn)
+ Cửa tủ luơn luơn phải đĩng kín, trừ khi nào lấy hoặc cho nguyên liệu vào nuơi
cấy nhưng cũng khơng được mở cửa tủ rộng và lâu
+ Luơn luên phải đảm bảo cho tủ ấm được khơ ráo, sạch sẽ, phải cho tủ hoạt động
thường xuyên, nhất là những hơm trời ẩm Khi làm đổ các chất dịch nuơi cấy hoặc làm bẩn trong tủ, phải lau chùi và sát trùng ngay
Trang 92 Tủ sấy khơ 2.I Cơng dụng:
Dùng tủ sấy khơ để tiêu khử trùng các dụng cụ thủy tỉnh, đồ sứ như: ống nghiệm, ống tiêm, ống hút, hộp lồng, cốc, phễu, cối chây sứ các đồ kim khí như
dao, kéo, cặp sắt, cịn cao su và mơi trường nuơi cấy khơng được dùng tủ sấy khơ để ' khử trùng
Nguyên lý cấu tạo của tủ sấy khơ cũng gần giống như tủ ấm, chỉ khác là nhiệt độ khi sử dụng tương đối cao, tủ sấy khơ cĩ thể dùng nguồn sinh nhiệt là từ điện, than, hoặc hơi đốt
2.2 Cách sử dụng tủ sấy khơ:
Các dụng cụ phải rửa sạch, để khơ, bao gĩi cẩn thận trước khi cho vào tủ, sau khi sắp xếp các dụng cụ vào trong tủ rồi đĩng kín cửa Đĩng mạch điện hoặc đốt
nhiên liệu, nhiệt độ trong tủ sẽ từ từ lên cao, chú ý theo đõi nhiệt kế cắm trên tủ khi
nhiệt độ đạt tới mức yêu cầu 170°C - 18§0°C thì điều chỉnh việc cung cấp nguồn nhiệt
để duy trì nhiệt độ này trong 30 phút Sau đĩ cắt mạch điện hay cắt nguồn nhiệt, chờ
nhiệt độ hạ dần xuống 50 - 60°C về mùa hè và 30 - 40°C về mùa đơng thì mới được
mở cửa tủ để lấy đồ hấp sấy ra Dụng cụ hấp sấy lấy ra phải để trên giá gõ trên giấy
hoặc vải, khơng được để ở trên gạch men, trên sàn gạch hoặc sàn xi măng vì dụng cụ
đang nĩng gặp lạnh sẽ dễ vỡ
3 Nơi hấp hơi nước cao áp
3.1 Nguyên lý:
Nồi hấp hơi nước cao áp (autoclave) làm bằng kim loại chịu được nhiệt độ cao (ít
nhất là 135") cĩ thể dùng điện, dùng củi hoặc dùng than đun cho nước sơi, hơi nước sẽ nén đần lại ở trong nồi và nếu tiếp tục để cho nước sơi thì áp lực trong nồi sẽ tăng dần, áp lực càng tăng thì nhiệt độ của hơi nước trong nồi càng cao, như vậy giữa nhiệt độ t' của hơi nước và áp lực P của nĩ cĩ liên quan với nhau, nhưng khơng phải theo một tỷ lệ đường thắng (xem bảng ])
Khi áp lực kế chỉ số 0 cĩ nghĩa là: áp lực P trong nồi hấp = áp lực P khơng khí, vậy khi áp lực kế chỉ ¡kg/cm” thì chính là chỉ hiệu số giữa áp lực bên trong với áp lực khơng khí tồn tại trong nồi
ˆ Ikpg/cm = P (rong nồi) - P (khơng khí trong nồi)
Do đĩ áp lực P trong nồi khơng phù hợp với P áp lực kế hay nĩi một cách khác, nhiệt độ trong nồi khơng tương ứng với nhiệt độ của áp lực kế Vì vậy muốn cho nhiệt
Trang 10Bảng 1 So sánh mối liên quan giữa áp lực ghi trên áp kế của nồi hấp biểu thị bằng
atmosphere và nhiệt độ trong nồi đã loại hết khơng khí
Áp lực | Nhiệt độ | Áplực | Nhiệt độ | Áplực | Nhiệt độ | Áplực | Nhiệt độ
(atm) CC) (atm) CC) (atm) CC) (atm) CC)
0,0 100,0 0,5 112,5 1,0 121,0 1,5 127,0 0,1 102,5 0,6 114,5 1,1 129,9 1,6 128,0 0,2 105,0 0,7 116, 1,2 124,0 1,7 129,0 0,3 107,5 0,8 117,0 1,3 125,0 1,8 130,0 0,4 110,0 0,9 119,0 1,4 126,0 1,9 131,0 2,0 132,0
Để loại bỏ hết khơng khí trong nồi ra, cĩ 2 cách:
a) Đĩng khĩa thốt hơi để tăng áp lực trong nồi lên đến khoảng 0,3 atm, rồi xả cho
thốt hết hơi ra, sau đĩ khĩa lại và cho tăng áp lực
b) Mở khĩa thốt hơi và đun cho đến khi hơi nước bắt đầu thốt ra thành một luồng
hơi trắng khá mạnh, khá đều thì đĩng lại và cho tăng áp lực
Lỗ thơng hơi Đường xả
~» Nơi ngưng tụ hơi nước
Trang 113.2 Cách sử dụng nồi hấp cao áp:
- Đổ nước vào nồi hấp với lượng vừa đủ (xem ở vạch ngang ghi trên một ống thủy tinh lắp bên ngồi nồi hấp)
- Các dụng cụ đem hấp phải được bao gĩi kỹ, đối với các bình và ống mơi trường cĩ
nút bơng phải bọc bằng giấy dầu để tránh hơi nước đọng làm ướt nút
- Khi sắp xếp dụng cụ vào nồi hấp khơng nên để sát nhau quá, để vật nặng xuống
dưới, vật nhẹ lên trên
- Đậy nắp, khĩa chặt các ốc theo từng đơi đối xứng nhau để khỏi vênh; khỏi hở, khi '
tháo khĩa cũng phải làm như vậy
- Mở mạch điện hoặc đốt nhiên liệu để đun sơi nước trong nồi, trong khi hấp phải
luơn luơn cĩ mặt để theo dõi kim chỉ áp lực trên đồng hồ áp lực kế Loại hết khơng khí
trong nồi theo 2 phương pháp đã nêu trên Khi đạt tới mức cần thiết thì xoay núm điện hoặc điều chỉnh nguồn nhiệt để duy trì áp lực khơng đổi trong một khoảng thời gian cần thiết FTuỳ từng mơi trường nuơi cấy khác nhau mà khử trùng ở các chế độ nhiệt khác nhau Nếu mơi trường cĩ đường, khơng được khử trùng ở trên 0,7 atm, vì nếu khử trùng ở nhiệt độ cao đường sẽ bị cháy Người ta thường khử trùng 6 ap luc | atm và giữ trong
khoảng 20 phút thì nha bào của một số loại vi khuẩn cũng sẽ bị tiêu diệt
- Khi đạt tới thời gian cần thiết thì ngất điện hoặc rút hết nhiên liệu ra và đợi cho kim chỉ áp lực hạ xuống số 0, nhiệt độ trong nồi giảm hẳn rồi mới được mở nắp lấy dụng
cụ đã khử trùng ra Chú ý tránh hạ áp lực đột ngột bằng cách mở van xì hơi ra quá mạnh
sẽ làm rạn nứt hoặc vỡ dụng cụ Cũng khơng nên để nồi hấp nguội lạnh mới lấy dụng cụ ra, vì lúc này nắp nồi sẽ mút chặt vào miếng đệm cao su rất khĩ mở
- Các dụng cụ lấy ra khơng được để ở nền gạch men, nền đá, nền xi măng (vì dụng
cụ đang nĩng gặp lạnh sẽ vỡ, nứt)
4 Tủ lạnh
Tủ lạnh là một thiết bị quan trọng dùng để giữ giống vi khuẩn, virus và bảo quản
các loại huyết thanh, các loại vacxin, các mơi trường dung để nuơi cấy
Tủ lạnh 0°- 4°C dùng để giữ giống vi khuẩn
Tủ lạnh -15°C đến -30”C dùng để giữ giống virus
5 May ly tam 5.1 Cong dung:
Trang 12- Làm trong một chất lỏng chứa nhiều phần tử đặc vần đục - Tách hồng cầu riêng với huyết tương
May ly tâm thơng thường cĩ: một trục quay trịn, về phía trên của trục cĩ một hình
sao để nhận các ống chứa chất lỏng cần ly tâm Các ống này được mĩc vào sao bằng một ' cái quai Khi quay các ống sẽ dãn ra thăng gĩc với trục quay đứng và các hạt lắng xuống
theo đường trục của ống và dồn về phía đáy Với kiểu máy này, tốc độ quay tối đa là
4500 - 6000 vịng trong một phút
Các máy ly tâm gần đây cĩ bộ phận thăng bằng tự động, cĩ máy để thời gian tự
động, cĩ đồng hồ chỉ tốc độ v.v muốn ly tâm chỉ cần vận các nút theo ý muốn 6 Những thiết bị cần thiết khác
- Máy hút chân khơng
- Máy đếm khuẩn lạc
- Máy đo pH hay hộp đo pH - Máy cất nước
- Máy đếm tế bào
- Máy lắc
- Phịng hoặc buồng vơ trùng
II CAC DUNG CU CAN THIET
1 Dung cu quang hoc
- Kinh hién vi quang hoc
- Kinh hién vi chup anh - Dén soi kinh hién vi - Tu quang nén den
- Thước đo vật kính và thước đo thị kính
- Lúp hai mắt đeo trán
- Máy chiếu - Máy Overhead
- Máy ảnh - Man hinh ti vi
Trang 13- Đèn tử ngoại diệt trùng 2 Dụng cụ đo lường
- Cân kỹ thuật
- Cân tiểu ly cĩ lồng kính - Cân tiểu ly xách tay
- Cân bàn
- Cân phân tích điện
- Nhiệt kế treo tường và các loại nhiệt kế đo nhiệt độ khác
- Đồng hồ điện đếm phút
- Máy đếm khuẩn lạc
3 Các loại mơi trường nuơi cấy vi sinh vật
Muốn cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển cần phải nuơi chúng trong các mơi trường thích hợp, mơi trường là những chất dinh dưỡng cần thiết được phối hợp theo yêu cầu sinh trưởng và phát dục của vi sinh vật đối với điều kiện và hồn cảnh sống của chúng Tuỳ từng giống VSV khác nhau, mà cĩ mơi trường nuơi cấy chuyên tính khác
nhau (Xem sách Mơi trường nuơi cấy VSV Nguyễn Lân Dũng Tập 1,2,3; NXB Nơng
nghiệp 1978, và các sách chuyên khảo về vi sinh vật Nguyễn Đường Giáo trình thực
tap VSV DHNNI, 1991)
4 Cac loai dung cu khac
- Buồng cấy hoặc tủ cấy vơ trùng - Các đèn tử ngoại diệt trùng
- Các loại dụng cụ thủy tinh: phiến kính, hộp lồng, ống nghiệm, các lọ, bình, phễu, cốc đong, ống tiêm, ống hút, đèn cồn
- Các loại dụng cụ kim loại: dao mổ các loại, kéo tháng, kéo cong, cặp sắt thang,
que cấy, đèn xì, hộp tiêu độc, cưa xương
- Các loại dụng cụ đồ men, sứ: khay men, cối chày sứ, xoong nồi để pha chế mơi
trường
- Các loại dụng cụ cao su, vải, bơng, băng: găng tay để mổ và để rửa dụng cụ, ủng,
bơng thấm nước, bơng khơng thấm nước, vai gac, vai loc, vai man
Trang 14- Các loại giống vi khuẩn và virus, các loại kháng huyết thanh để chẩn đốn, các
loại khuẩn tố để chẩn đốn
II SỬ DỤNG KÍNH HIEN VI DE QUAN SAT HINH THAI VI SINH VẬT
Kính hiển vi là một dụng cụ quang học rất cần thiết để nghiên cứu hình thái vi sinh
vật và nghiên cứu những vật hết sức nhỏ mà mắt thường khơng thể nhìn thấy được, cĩ nhiều loại kính hiển vi khác nhau, nhưng đều nhằm mục đích nghiên cứu quan sát rõ hơn, chi tiết hơn về hình thái, cấu tạo của các vi sinh vật
Ww SE) ©) ©© © © 2© ® 1 Đế kính § Thị kính 2 Đèn chiếu 9 Ống kính 3 Bộ tụ quang kính 10 Cơng tắc
4 Vịng bảo hiểm 11 Thân kính
5 Khay kính | 12 Oc so cap
6 Vat kinh 13 Oc vi cap
Trang 15Kính hiển vi quang học gồm cĩ 2 bộ phận chính: Bộ phận cơ và và bộ phận quang kính
1 Bộ phận cơ
1.1 Chân kính hay đế kính:
Dùng để đỡ kính hiển vi, nĩ là chỗ dựa vững chắc cho kính hiển vi luơn ở trạng thái
cân bằng
1.2 Thân kính:
Nối liền với chân kính bằng một bản lẻ, đĩ là một bộ phận cĩ hình cong đỡ thân
kính, ở trụ kính cĩ ốc điều chỉnh lớn (ốc sơ cấp) và cĩ tác dụng gắn tồn bộ các bộ phận của kính hiển vi
1.3 Ống kính:
Là một ống kim khí rỗng hình trụ lắp trên trụ kính, đầu trên của ống kính lắp thị kính, phía dưới của ống kính là một bàn xoay cĩ lỗ dùng để lắp các vật kính, cĩ tác dụng
chuyển vật ảnh từ vật kính phĩng đại lần 1 tới thị kính phĩng đại lần 2 1.4 Khay kính hay đĩa kính:
Cĩ thể là hình vuơng hay hình trịn, là nơi đặt phiến kính để xem, ở giữa cĩ lỗ thấu
quang để ánh sáng cĩ thể chiếu vào phiến kính, trên khay kính cĩ hai cái kẹp phiến kính
cho vững hoặc cĩ thêm một bộ phận gọi là xa để di chuyển tiêu bản theo hai chiều khác
nhau, từ trái sang phải, từ trước ra sau và ngược lại Ngồi ra khay kính cịn cĩ thể di chuyển theo các chiều bằng cách vặn hai ốc ở hai bên khay kính và gắn với bộ phận đo
(thước đo)
1.5 Ốc điều chỉnh:
Gồm cĩ ốc điều chỉnh lớn (ốc sơ cấp) và ốc điều chỉnh nhỏ (6c vi cap) Oc so cap
dùng để điều chỉnh tiêu điểm, ốc vi cấp để điều chỉnh cho vật ảnh rõ nét hơn (chỉ sử
dụng ốc vi cấp khi đã tìm thấy vật ảnh), đầu ốc cĩ khắc, mỗi khác tương đương với sự di chuyển là 1/100mm
2 Bộ phận quang kính
2.1 Gương phản chiếu (kính phản quang)
Đặt ở phía dưới khay kính gồm cĩ hai mặt, một mặt pháng và một mặt lõm, dùng để lấy ánh sáng, cĩ thể được đặt ở phần đế kính đối với kính hiển vi đùng điện
2.2 Tụ quang kính
Trang 162.3 Bộ phận chắn sáng
Là một phiến kính hữu cơ đặt ở phía dưới tụ quang kính cĩ thể mở rộng hay hẹp
dùng để điều hịa ánh sáng lên tiêu bản
2.4 Vật kính
Vật kính là một hệ thống quang học rất quan trọng và phức tạp, gồm một số thấu kính, nĩ trực tiếp phĩng đại ảnh thật của tiêu bản (ảnh của vật xem), khả năng phĩng đại của vật kính phụ thuộc vào tiêu cự tức là phụ thuộc vào bán kính cong của thấu kính; thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phĩng đại càng lớn Vật kính khi dùng được lắp vào ban quay ở phía dưới ống kính Cĩ hai loại vật kính:
+ Vật kính khơ: là vật kính cĩ số bội giác thấp x8; x20; x40; x60 dùng để xem tươi,
xem vi khuẩn di động, khuẩn lạc, ký sinh trùng, hoặc xem các tiêu bản tổ chức
+ Vật kính dầu: là vật kính cĩ số bội giác cao x 90; x100; x 120 nĩ cĩ một vịng -
đen ở đầu vật kính để phân biệt với vật kính thơ
Vật kính khơ và vật kính dầu khác nhau ở chất mà ánh sáng phải đi qua tiêu bản
(phiến kính) và vật kính Ở vật kính khơ, chất đi qua là khơng khí mà chỉ số khúc xạ
(chiết suất) của khơng khí là n = 1 rất khác với chỉ số khúc xạ của thủy tinh n = 1,52, do
đĩ các tia sáng khi ra khỏi tiêu bản sẽ bị phản xạ và phần ngồi của chùm ánh sáng
khơng lọt được vào vật kính
Như trên đã nĩi, độ phĩng đại càng lớn thì thấu kính cĩ đường kính phải càng nhỏ, cho nên khi sử dụng vật kính cĩ độ phĩng đại lớn thì chỉ cĩ một phần tia sáng rất nhỏ lọt vào thấu kính của vật kính, vì vậy ảnh nhận được sẽ khơng rõ lắm Để tránh điều này, người ta dùng một loại dầu bạch hương (huile de cèdre) cĩ chỉ số khúc xạ n =1,51 xấp xi với chỉ số khúc xạ của thủy tinh n = 1,52 đặt vào giữa tiêu bản và vật kính Lúc này thủy tỉnh và dầu bạch hương là một mơi trường gần như đồng nhất, nên ánh sáng khi đi qua thủy tinh sẽ khơng bị khúc xạ mà chiếu thẳng vào vật kính Cần lưu ý rằng vật kính cĩ độ phĩng đại càng lớn thì trường quan sát càng nhỏ và khoảng cách giữa vật ' kính và vật cần quan sát quan sát càng nhỏ, vì vậy để xem vật ảnh được phải sử dụng vật
kính cĩ độ phĩng đại nhỏ trước, sau đĩ mới sử dụng vật kính cĩ độ phĩng đại lớn
Tiêu điểm
Trang 172.5 Thị kính
Thị kính gồm cĩ hai thấu kính lắp vào hai đầu của một cái ống nhỏ lắp trên đầu ống kính, một thấu kính hướng về mắt người xem và một thấu kính hướng về vật quan sát,
kính trên là kính phĩng đại ảnh thật do vật kính thu được, kính dưới là kính thị trường làm sáng tỏ thị trường do đĩ mà ta nhìn thấy rõ ảnh được phĩng đại Tác dụng của thị kính là phĩng đại vật ảnh lần 2, sau khi ảnh được vật kính phĩng đại lần thứ nhất Ảnh được thị kính phĩng đại là ảnh ảo
Thị kính cĩ độ phĩng đại càng cao thì khoảng cách giữa hai thấu kính càng ngắn (tiêu , cự của thị kính càng ngắn) và ngược lại Thị kính thường cĩ 4 số: xŠ ; x7 ; x10; x15
Muốn biết độ phĩng đại của vật quan sát (độ phĩng đại của kính hiển vi), người ta nhân độ phĩng đại của vật kính với độ phĩng đại của thị kính Ví dụ dùng vật kính đầu x90 và thị kính x15 thì độ phĩng đại của vật quan sát hay độ phĩng đại của kính hiển vi sẽ là: 90 x 15 = 1350
3 Cách sử dụng kính hiển vi 3.1 Kiểm tra kính hiển vi
Đặt kính vào vị trí làm việc, cắm điện hoặc dùng ánh sáng trắng, đặt kính trên bàn cho ngay ngắn, ở tư thế cĩ lợi nhất cho người quan sát Khi quan sát tiêu bản cần sử
dụng cả 2 mắt, mắt trái dùng quan sát, mất phải dùng để ghi chép hoặc vẽ, khơng nên nheo một mắt lại để xem, vì như thế rất đễ mỏi mệt và đau đầu Cần luyện tập để cĩ thể
xem được cả hai mắt
3.2 Quan sát tiêu bản tươi với vật kính khơ
Khơng dùng tụ quang kính và bộ phận chắn sĩng, nhất là đối với vật kính cĩ số bội giác thấp (x8), khi nguồn sáng hẹp thì dùng gương phẳng với vật kính số bội giác thấp, dùng gương lõm với vật kính cĩ bội số giác cao (x40), khi nguồn sáng rộng thì dùng
gương nào cũng được Hạ thấp tột cùng tụ quang kính và ít mở bộ phận chắn sáng
3.3 Quan sát tiêu bản nhuộm với vật kính dầu
Luơn luơn sử dụng tụ quang kính, nâng cao tụ quang cho sát vào tiêu bản Khi sử
dụng tụ quang kính cần chú ý mấy điểm:
Đặt phiến kính lên khay kính và cố định, dùng vật kính cĩ số bội giác thấp để cĩ
ảnh trong thị trường trước Hạ thấp vật kính cho sát gần tiêu bản (khi hạ vật kính mắt nhìn ngồi để tránh đè mạnh làm vỡ tiêu bản) Theo dõi trong ống kính, rồi từ từ vặn ốc sơ cấp lên, đến khi trơng thấy ảnh (thường cĩ hình chớp) thì ngừng vặn ốc sơ cấp và bắt đầu sử dụng ốc vi cấp, vặn hết sức chậm, đến khi trơng thấy rõ ảnh thì thơi (cĩ thé van tới hộc văn lui) Sau khi đã điều chỉnh tiêu điểm với vật kính số bội giác thấp thì quay
vat kinh thap ra, nhỏ một giọt dầu bạch hương vào tiêu bản, nhỏ vào chỗ cần xem,
khơng để lan rộng ra, xoay vật kính dầu vào, và văn vật kính dầu sát xuống tiêu bản đè
Trang 18lên giọt dầu, chú ý mắt nhìn ngồi để đừng vặn sát quá sẽ đè vỡ phiến kính đến khi thấy chớp, tức là ảnh đã trơng thấy nhưng chưa thấy rõ, lúc này sử dụng ốc vi cấp cho đến khi trơng rõ ảnh trong thị trường
4 Cách bảo quản kính hiển vi
+ Khi lấy kính từ trong hộp kính hiển vi ra, dùng tay phải nắm chắc, kéo kính ra
theo hướng nằm ngang, khơng để đụng vào thành hộp, sau đĩ dùng tay trái đỡ chân kính để mang đi (bao giờ cũng phải dùng 2 tay mang đi) Nếu mang đi xa phải cố định chắc
chắn để tránh bị lỏng
+ Khơng được sờ tay vào đầu vật kính và thị kính, nếu bẩn cĩ thể dùng vải mềm hoặc giấy lau kính để lau Vật kính dầu dùng xong lấy vải mền mịn hay giấy lau sạch dầu bạch hương ở đầu vật kính, sau đĩ tầm xylen vào vải mềm mịn hay giấy lau cho hết đầu (xylen cĩ tác dụng làm tan dầu bạch hương) Cuối cùng lau lại một lần nữa bằng vải mềm, mịn hay giấy mềm
Trang 19Bài 2
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM, ĐO KÍCH THƯỚC VÀ ĐẾM TẾ BÀO
VI SINH VẬT
Mục đích, yêu cầu:
+ Biết chuẩn bị và thực hành làm tiêu bản vi sinh vật từ các mẫu vật
+ Nắm vững phương pháp nhuộm đơn, nhuộm kép và phương pháp nhuộm Gram
+ Biết nhận dạng hình thái vi sinh vật và phân biệt vi khuẩn Gram dương, Gram âm
+ Nắm vững phương pháp đếm số lượng vi sinh vật từ các mơi trường nuơi cấy + Biết sử dụng thước đo vật kính và thước đo thị kính để đo kích thước của vi sinh vật
Nội dung thực hành:
+ Phương pháp làm tiêu bản vi sinh vật (phương pháp cố định tiêu bản)
+ Pha chế thuốc nhuộm và các phương pháp nhuộm: nhuộm đơn, nhuộm kép hay
nhuộm Gram
+ Quan sát một số tiêu bản hình thái vi sinh vật: cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn
+ Phương pháp đếm số lượng vi sinh vật (đếm khuẩn lạc trên đĩa mơi trường thạch bằng và đếm số lượng trên mơi trường dịch thể bằng buồng đếm hồng cầu)
+ Phương pháp đo kích thước tế bào vi sinh vật
I PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TIÊU BẢN VÀ NHUỘM TẾ BÀO VI SINH VẬT
1 Mục đích của cố định tiêu bản và nhuộm tế bào VSV
Tế bào vi sinh vật gần như là khơng mầu, do đĩ quan sát bằng phương pháp xem trực tiếp rất khĩ, vì vậy cần phải làm tiêu bản rồi đem nhuộm mầu Nhuộm vi sinh vật cĩ
4 mục đích:
- Để nghiên cứu hình thái, cấu tạo đặc biệt của vi sinh vật như giáp mơ, nha bào
- Để phân loại vi sinh vật căn cứ vào tính chất bắt mầu Gram, tính chất kháng cồn,
kháng toan
- Để dễ phân biệt và quan sát được các vi cấu tạo trong tế bào VSV
Trang 202 Phương pháp làm tiêu bản vi sinh vật để nhuộm
2.1 Chuẩn bị phiến kính
- Chọn phiến kính trong, sạch, khơng mờ, khơng cĩ dầu mỡ, đã được ngâm trong
cồn, khi dùng lau khơ bằng vải mềm và hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn
- Khoanh diện phết vi sinh vật bằng cách dùng bút chì mỡ khoanh một vịng ở mật dưới phiến hình
2.2 Phết mẫu vật
- Nếu lấy mẫu vật là vi sinh vật từ ống canh trùng dịch thể thì sau khi đã khử trùng
que cấy và để nguội, lấy một giọt mơi trường nhỏ lên phiến kín chỗ đã khoanh trịn bằng bút chì mỡ, rồi dàn mỏng ra trong diện đã khoanh
Cần chú ý thao tác khi lấy vi sinh vật để phết kính: tay phải cầm que cấy, nung đỏ
que cấy bạch kim và đưa tồn bộ phần kim khí của que cấy qua ngọn lửa đèn cồn 2 - 3
lần, làm trước khi lấy vi sinh vật và sau khi đã phết kính xong; tay trái cầm ống mơi trường để vào lịng bàn tay và cầm nghiêng ống bằng 5 ngĩn tay Dùng ngĩn tay út của bàn tay phải mở nút bơng, sau khi đã quay nút bơng một vịng trong miệng ống cho trơn (kẹp nút bơng vào giữa ngĩn tay út và bàn tay, hay giữa ngĩn tay út và ngĩn tay đeo
nhãn) hơ ống mơi trường trên ngọn lửa đèn cồn, và đầu ống nghiệm luơn luơn để sát
ngọn lửa đèn đèn cồn, cho que cấy vào sâu trong ống mơi trường lấy ra một giọt mơi trường, rút que cấy ra, hơ miệng ống nghiệm và đĩng nút bơng lại, cho ống nghiệm vào giá, sau đĩ cầm phiến kính đã chuẩn bị sắn, muốn cầm phiến kính cho vững thì ngĩn tay cái giữ một cạnh đài của phiến kính, ba ngĩn tiếp giữ cạnh đối diện, ngĩn út để ở mặt - dưới phiến kính, giữ cho phiến kính khơng cử động trong khi phết
- Nếu là vi sinh vật từ canh trùng đặc (mơi trường thạch) thì dùng que cấy bạch kim lấy một ít vi sinh vật ở một khuẩn lạc, (khơng nên lấy nhiều vi sinh vật vì phết dày quá sẽ khĩ xem và khĩ phân biệt hình thái của vi sinh vật) Đặt que cấy lên phiến kính đã cĩ sẵn một giọt nước cất hay nước sinh lý hoặc nước thịt vơ trùng để làm huyễn dịch vi sinh
vật, trộn đều vi sinh vật trong giọt nước rồi dàn mỏng ra
- Nếu dùng máu để phiết kính thì cĩ thể lấy máu ở tĩnh mạch rìa tai (đối với động
vật sống) hoặc máu tim (đối với động vật mổ khám) Đặt giọt máu lên phiến kính, rồi
dùng đầu một phiến kính khác, cĩ cạnh nhãn và thẳng hoặc cạnh của một lá kính đặt nghiêng một gĩc 30 - 45° với phiến kính để giọt máu lan khắp cạnh rồi đẩy nhẹ và đều
tới đầu kia của tiêu bản, máu theo phiến kính chứ khơng phải bị phiến kính đẩy đi, tiêu bản tốt nếu máu được dàn đều trên phiến kính thành một lớp mỏng
- Nếu dùng phủ tạng lách, gan, thận, hạch, phổi thì cắt một miếng nhỏ, thấm bớt,
nước bằng bơng hay giấy thấm, rồi chấm nhẹ trên phiến kính độ 3 - 4 chỗ, khơng đè
mạnh trên phiến kính, chỉ thấm nhẹ nhàng, hoặc cĩ thể kéo lướt nhẹ miếng phủ tạng trên `
Trang 21- Nếu dùng đờm mủ, tủy xương phết kính thì lấy que cấy lấy đờm ở chỗ cĩ nhiều
mủ nhất, rồi dàn mỏng ra trên phiến kính, nếu mủ khơ thì trước khi dàn, nhỏ một giọt nước sinh lý vơ trùng trên phiến kính, tủy xương cũng làm như thế
2.3 Sấy khơ tiêu bản Cĩ 2 cách:
- Để tự khơ ở nhiệt độ phịng thí nghiệm
- Hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn, khơng để sát tiêu bản vào ngọn lửa, nĩng quá thân vi
sinh vật sẽ co quấp lại, protit trong nguyên sinh chất đơng nhanh, ảnh hưởng đến hình thái
2.4 Cố định tiêu bản
+ Cố định tiêu bản cĩ 3 mục đích:
- Giết chết vi sinh vật để việc sử dụng khơng gây nguy hiểm
- Lam cho vi sinh vật gắn chặt vào phiến kính, khi rửa nước khơng bị trơi đi
- Lam cho vi sinh vật bắt mầu tốt hơn (protit chết bắt màu tốt hơn protit sống) Cĩ thể cố định bằng những phương pháp sau đây:
+ Cố định bằng nhiệt độ: hơ phiến kính trên ngọn đèn cồn bằng cách đưa đi, đưa lại
3 - 4 lần, nếu hơ nĩng quá sẽ làm biến dạng hình thái vi khuẩn + Cố định bằng chất hĩa học:
- Nhỏ vài giọt cồn nguyên chất hay cồn 96” 5 - 10 phút
- Nhỏ vài giọt cồn mêtylic 2-_ 3 phút
- Ngâm tiêu bản vào axêton 5 phút
+ Cố định bằng hơi foocmalin: 3 - 5 phút 3 Phương pháp nhuộm tiêu bản
3.1 Thuốc nhuộm đơn và các phương pháp nhuộm đơn 3.1.1 Dung dich fucxin (fuchsine) trong axit phénic:
+ Chuẩn bị thuốc nhuộm
Fucxin kiém lg
Cén nguyén chat hay 96°10 ml Axit phénic két tinh 5g
Trang 22Nghiên fucxin với 5ml cồn trong cối sạch, quấy đều, đổ 2/3 lượng nước vào, đồ từ
từ, quấy đều, xong cho axit phênic vào, quấy đều cho vào lọ kín để 24 giờ, được một ngày, đem lọc qua giấy, tráng cốc bằng 1/3 nước cất và 1/2 cồn cịn lại, dung dịch này là
dung dịch ƒ¿cxin đặc, khi dùng nhuộm đơn hoặc nhuộm Gram thi dem pha lỗng dung
dich này gấp 10 lần với dung dịch axit phênic 5%:
Dung dich fucxin 10 ml Dung dich axit phénic 5% 90 ml + Phương pháp nhuộm đơn
a) Nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản đã cố định để 1 - 2 phút, cĩ khi đến 10 phút tùy theo loại thuốc nhuộm
b) Rửa nước, để vịi nước từ từ chảy xuống một đầu phiến kính cầm hơi nghiêng đến khi nước trong là được
c) Thấm khơ bằng giấy thấm hay bằng hơi nĩng
đ) Quan sát trên kính hiển vi
3.1.2 Dung dich xanh mêtylen trong axit phénic:
+ Chuẩn bị thuốc nhuộm
Xanh mêtylen lg
Axit phénic két tinh lg
Cồn nguyên chất 100° 10 ml
Nước cất 10 ml
Cach pha giong nhu fucxin 6 trén ,
+ Phương pháp nhuộm cũng giống nhuộm ƒ¿cxin
3.2 Phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép)
3.2.1 Phuong pháp nhuộm Gram:
+ Chuẩn bị thuốc nhuộm
a) Dung dịch tím gentian trong axit phênic
Tím gentian lg
Cén 96° 10 g
Axit phénic két tinh 5g
Trang 23b) Dung dịch fucxin trong axit phênic
Fucxin kiểm lg
Con 96° 10 g
Axit phénic két tinh 5g
Nước cất I0g
Cách pha 2 dung dịch này giống như dung dịch fucxin nĩi trên c) Pha dung dịch lugol
lơđua kali lg
lốt tinh thé 0,52
Nước cất 150 ml
Nghiền iơđua kali với một ít nước cất, sau đĩ cho iốt đã tán nhỏ vào lắc cho tan hết,
cuối cùng cho đủ nước cất, lắc đều, để 24 giờ rồi đem lọc Đựng vào chai mầu Khơng nên pha nhiều vì đễ bị biến chất
d) Pha dung dich tay mầu cồn axêtơn
Con nguyén chat 5 phan
Axéton 1 phan
Nếu khơng cĩ axêtơn thì dùng cồn nguyên chất hoặc 90° cũng được + Phương pháp nhuộm Gram
1) Nhỏ dung dịch tím genxian lên tiêu bản 1 - 2 phút 2) Rửa nước nhanh, vấy khơ nước
3) Nhỏ dung dịch lugol để 1 phút (tiêu bản cĩ mầu nâu đen)
4) Rửa nước nhanh, vay khơ nước
5) Nhỏ cồn axêtơn từ đầu phiến kính, nghiêng phiến kính cho cồn chảy qua chỗ
phét vi sinh vat
6) Rửa nước nhanh
7) Nhỏ dung dịch fucxin lỗng để 1 phút 8) Rửa nước
9) Thấm khơ - hơ khơ - rồi xem kính
Trang 24Cần chú ý: bước tẩy mầu bằng cồn axêtơn rất quan trọng Nếu tẩy khơng kỹ thì
dễ nhầm lẫn vi khuẩn Gram âm với vi khuẩn Gram dương và ngược lại, nếu tẩy lâu quá thì vi khuẩn Gram dương mất mầu tím cho nên khi nhuộm màu đỏ fucxin thì nĩ
bat mau do
Quan sát trên kính hiển vi nhận thấy: hồng cầu nhuộm mầu nâu hồng, nhân bạch cầu nhuộm màu tím Vị sinh vật nhuộm mầu tím
Lam kính sạch Khoanh 1 vịng Lấy giống Dàn đều dịch
————| trịn bảng bút |——————mờ| VSV trong vịng viết kính từ ống giồnE | trịn với HạO VT
Nhỏ cồn 967 Nhỏ thuốc Nhỏ thuốc trong 30 giây |®———————| nhuộm lugol để |4———————— nhuộm tím
Rửa nước VT 1-2 phút Rửa nước VT | genxian dé 1-2 Hong khơ Hong khơ
: Nếu TB VSV bắt mầu tim > Gram duong
Rửa nước đê khơ soi kính
Nếu TB VSV bắt mầu hồng => Gram 4m
3.2.2 Cơ chế bắt màu
Cĩ 2 giả thiết giải thích về tính bắt màu của vi khuẩn - Giả thiết về cấu tạo tế bào
Vi khuẩn Gram dương trong tế bào cĩ những chất đặc biệt mà vi khuẩn Gram âm
khơng cĩ đĩ là: Protein kiểm, muối Mg- nucleic; hai chất này tác dụng với thuốc nhuộm
tím genxian và lugol cĩ chứa lot sẽ tạo thành hợp chất bền vững proteinrebonuclenat : mageiodparasanilin Chat nay khơng bị hồ tan bởi cồn
- Giả thiết về cấu tạo màng tế bào
Vi khuan Gram âm cấu trúc màng cĩ tính thấm mạnh hơn do đĩ cồn cĩ thể thấm sâu vào trong và tẩy thuốc nhuộm tím genxian và lugol, sau đĩ lơi các thuốc nhuộm này ra
ngồi và vì vậy khi nhuộm thuốc nhuộm fucxine cĩ mầu hồng vi khuẩn đã bắt mầu hồng
Trang 25Il DEM SO LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT
Đếm số lượng và đo kích thước tế bào vi sinh vật cĩ tầm quan trọng trong cơng tác
nghiên cứu về vi sinh vật
1 Mục đích của việc đếm số lượng vi sinh vật
- Để biết số lượng vi sinh vật trong 1ml canh khuẩn
- Để so sánh 2 mơi trường trong việc nuơi dưỡng vị sinh vat
- Để tiêm một số lượng nhất định vi khuẩn vào một động vật thí nghiệm
- Để tìm liều tối thiểu chí tử (liều LD„) của vi sinh vật đối với một động vật thí
nghiệm
Trong cơng tác nuơi cấy, phân lập, giám định giống, nuơi dưỡng thuần vi sinh vật thì việc xác định kích thước vi sinh vật cũng rất cần thiết
2 Phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật
Cĩ 2 phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật
- Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu
- Phương pháp đếm gián tiếp trên đĩa thạch
2.1 Phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng cầu
Dùng phương pháp này cho biết cả số vi sinh vật sống và số vị sinh vật chết trong một canh trùng
2.1.1 Chuẩn bị
- Pha lỗng canh trùng: tùy theo số lượng vi sinh vật nhiều hay ít mà pha lỗng thành các hệ số 10, 100, 1000, 10.000
- Dùng buồng đếm hồng cầu (Gơ-ri-a-ep) cĩ khắc: 0,00 mm10 x 1/400 mm?
- Đậy lá kính mỏng lên chỗ cĩ khác ở giữa buồng đếm
- Đưa buồng đếm đặt lên khay kính hiển vi, rồi tìm những ơ vuơng nhỏ trong buồng đếm bằng vật kính số 8
- Để yên buồng đếm, xoay vật kính ra, dùng ống hút Pasteur hút canh trùng đã pha
lỗng và nhỏ vào khoảng giữa lá kính với buồng đếm Để yên vài phút nếu khơng thấy
cĩ bọt khí ở khu vực buồng đếm, thì cĩ thể bắt đầu đếm
Trang 26- Vi sinh vật hiện lên trong buồng đếm như những chấm đen hoặc trong sáng, cĩ chuyển động phân tử, đếm lần lượt số vi sinh vật trong 16 ơ vuơng nhỏ của một ơ vuơng
to và đếm tất cả 5 ơ vuơng to tức là đếm (16 x 5) = 80 ơ vuơng nhỏ Buồng đếm hồng cầu 2.1.2 Phương pháp tính số lượng VSV
Lấy tổng số vi sinh vật đếm được trong 80 ơ vuơng nhỏ, chia cho 80 để tính số bình qn tế bào vi sinh vật đếm được trong 1 ơ vuơng nhỏ Diện tích phần kính cĩ khắc là Imm’, trong đĩ cĩ tất cả 25 ơ vuơng to, mỗi ơ vuơng to cĩ 16 ơ vuơng nhỏ như vậy cĩ
tất cả 400 ơ vuơng nhỏ (25 x 16) Vậy diện tích một ơ vuơng nhỏ ta đếm là 1/400mm”
Khoảng cách của kính cĩ khắc đến kính mỏng 14 0,1mm Nhu vậy số tế bào vi sinh vật đếm được trong một ơ vuơng nhỏ, chính là số tế bào vi sinh vật cĩ trong 1/4000mỶ canh trùng Do đĩ muốn tính số lượng tế bào vi sinh vật trong 1m] canh trùng (lcm” = 1000mm) thì nhân nĩ với 1000 Nếu canh trùng pha lỗng với hệ số bao nhiêu thì lại nhân với hệ số pha lỗng đĩ
Cĩ thể tĩm tắt cơng thức tính như sau:
Số lượng tế bào Số vi sinh vật Hệ số
vị sinh vật trong] = bình quân ở một x 4000 x I000 x | pha lỗng
ml canh tring 6 nho
2.2 Phương pháp đếm trên đĩa thạch
Dùng phương pháp này chỉ cho biết số vi sinh vật sống trong mơi trường
Số lượng vi sinh vật được tính gián tiếp theo một cơng thức tính dựa trên số khuẩn lạc đếm được khi cấy chúng trên đĩa thạch pê¡r:
2.2.1 Các bước chuẩn bị
- Pha lỗng canh trùng định đếm từ hệ số thấp đến hệ số cao từ 1/10, 1/100, 1/1000,
1/10.000, 1/100.000 :
Trang 27dùng que thủy tinh thước thợ vơ trùng dàn mỏng đều trên đĩa thạch, hoặc nghiêng đi,
nghiêng lại để 0,1m] canh trùng được dàn đều khắp trên mặt thạch
- Cấy xong đánh dấu độ pha lỗng ở từng đĩa thạch và để ngửa trong tủ ấm 37°C
- Sau 24 giờ lấy đĩa thạch ra đếm số khuẩn lạc mọc trên mặt thạch, đếm tổng số khuẩn '
lạc của 3 - 5 đĩa thạch của cùng một nồng độ, sau đĩ lấy số lượng khuẩn lạc trung bình
Nhân số lượng khuẩn lạc trung bình với 10 để tìm số lượng khuẩn lạc cĩ trong 1ml canh
trùng (vì lúc cấy chỉ cấy cĩ 0,1m]) và cuối cùng nhân với hệ số pha lỗng của canh trùng
2.2.2 Cơng thức tính tổng quái:
Số lượng vi sinh vật trong canh tring = A x N
_ Trong đĩ: A : số lượng khuẩn lạc trong ml canh trùng NĐ: hệ số pha lỗng của canh trùng
II ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO VI SINH VẬT
Muốn đo kích thước tế bào vi sinh vật, người ta sử dụng loại thước đo đặc biệt Cĩ 2 loại thước đo: thước đo thị kính (micromètre oculaire) và thước đo vật kính (micromètre objective)
1 Cấu tạo va cách sử dụng thước đo
1.1 Thước đo vật kính
Thước đo vật kính là một tấm thủy tinh hay kim loại hình chữ nhật, cĩ kích thước
như một phiến kính (lame) ở giữa cĩ một miếng kính hình trịn, trên đĩ cĩ khắc một
thước dài Imm, chia thành 100 khoảng bằng nhau, mỗi khoảng dai 10 um (micron) (như
hình dưới) Se 1.2 Thước do thị kính
Thước đo thị kính là một kết cấu đặc biệt, được gắn trực tiếp ở đầu ống thị kính bao
gồm bộ phận thị kính và bộ phận thước đo Cĩ thể nhìn thấy được trong thị trường một
vạch thẳng chia làm 8 phần bằng nhau đánh số từ 0 - 8, phía trên cĩ một vạch đơi và một hệ thống giao điểm gồm 2 vạch cĩ thể di động được từ phải sang trái hoặc ngược lại là
do một ốc điều chỉnh ở bên ngồi gắn liền với thước đo, trên ốc cĩ vạch 100 khoảng đều
Trang 281.3 Cách sử dụng
Trước khi tiến hành đo kích thước vi khuẩn ở độ phĩng đại nào, phải xác định được
chiều dài của mỗi khoảng cách trên thước đo thị kính, người ta dùng thước đo vật kính
để so sánh
Phương pháp xác định cụ thể như sau:
- Lap thước đo vật kính vào khay kính, điều chỉnh tiêu điểm để xem ảnh của thước
đo trong kính hiển vi, đầu tiên xem với vật kính số x8, sau mới dùng vật kính dầu x90
- Lắp thước đo thị kính vào thay chỗ của thị kính, rồi điều chỉnh các ốc để cho vạch đơi và trục tọa độ ở điểm 0 của thước đo vật kính nằm ở điểm gốc của trục, vạch đầu của
thước đo trùng với trục của tọa độ
- Van ốc để làm cho hệ thống giao điểm chuyển dịch từ 0 đến 0' nào đĩ Xác định
số khoảng cách trên thước đo vật kính và thước đo thị kính tương ứng trong khoảng
chuyển dịch này
- Tùy theo vật kính cĩ số bội giác khác nhau mà khoảng cách trên thước đo thị kính và thước đo vật kính tương ứng cĩ khác nhau Căn cứ vào số liệu này người ta tính được độ dài của một khoảng cách trên thước đo thị kính (hệ số đo) ứng với mỗi vật kính cĩ độ phĩng đại khác nhau
Ví dụ: đo với vật kính cĩ số bội giác x40
Vạch chuyển dịch của hệ thống giao điểm là đoạn 00' được xác định bởi 5 khoảng
của thước đo vật kính, mỗi khoảng là 10um Vạch đơi tương ứng chuyển dịch được hơn 4 khoảng trên thước đo thị kính, đoạn nhỏ được xác định chính xác trên khác độ của ốc điều chỉnh của thước đo thị kính, mỗi vịng quay của ốc (từ 0 - 100) tương ứng với một vạch trên thước đo thị kính, vì vậy khi vặn đến số nào thì số đĩ chỉ độ dài của đoạn nhỏ Ở đây giả sử xác định được vạch ngồi trên ốc vặn là 45 Vậy độ dài được xác định trên
thước đo thị kính là 4,45
Do đĩ độ dài của một khoảng trên thước đo thị kính là: —¬
Kết quả tính được là hệ số đo của vật kính x 40 2 Phương pháp đo kích thước
2.1 Do chiều dài
- Đặt tiêu bản vào đúng chỗ đã đặt thước đo vật kính điều chỉnh để thấy rõ ảnh của
vị sinh vật cần xác định
- Điều chỉnh để ảnh của vi sinh vật nằm sát trục tọa độ, đầu vi sinh vật ở vị trí 0,
Trang 29- Văn ốc để cho trục tọa độ chuyển đến phần cuối 0' của vi sinh vật, quan sát thấy vạch đơi di chuyển một khoảng là 4,25 (số 25 đọc ở vịng quay của ốc ở bên ngồi)
- Như trên ta đã đo được độ dài của một khoảng trên thước đo thị kính là: 5 x 10 tưn
T : ¬ : ` 4,45
- Do đĩ độ dài của 4 khoảng 25 hay độ dài của vi sinh vat can do là:
5x 10 mu
Sa x 4,25 = 47,7 um 2.2 Do chiéu ngang
- Điều chỉnh trục tọa độ và vạch đơi trở về vị trí cũ ở điểm 0, xoay cho chiều của vi sinh vật ở vị trí vuơng gĩc với chiều cũ, ảnh vẫn nằm trên trục tọa độ và điểm đầu vẫn ở
vị trí 0
- Văn ốc để cho trục tọa độ chuyển đến phần cuối của chiều ngang vi sinh vật, quan sát thấy vạch đơi di chuyển một khoảng là 2,15
Trang 30Bài 3
QUAN SÁT HÌNH THÁI VÀ CƠ QUAN SINH SẢN CUA NAM, XA KHUAN VA TAO LAM
Mục đích, yêu cầu:
+ Giúp cho sinh viên nhận dạng hình thái của nấm, xạ khuẩn và tảo lam
+ Yêu cầu sinh viên phải nhận biết từng giống nấm, xạ khuẩn và tảo lam Nội dung:
+ Quan sát, nhận dạng từng giống nấm trên tiêu bản cố định và quan sát trực tiếp trong hop dia petri
+ Quan sát và nhận dạng từng giống xạ khuẩn trên tiêu bản đã cố định và quan sát
trực tiếp trong đĩa mơi trường bán rắn
+ Tự chuẩn bị tiêu bản, quan sát hình dạng của tảo lam cộng sinh với bèo hoa dâu
I QUAN SAT HINH THAI XA KHUAN
Xa khuẩn là nhĩm vi sinh vật phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nước, trong các hợp chất hữu cơ khác, thậm chí trong một số cơ chất mà vi khuẩn và
nấm mốc khơng phát triển được
Mơi trường nuơi cấy:
(NH,);SO, lg K,HPO, lg MgSO, 7H;0 lg NaCl lg CaCO, 3g Tình bột tan 10g Nước cất 1000ml Thach 15g
Mơi trường nước chiết đất
Cao thịt 3g
Pepton 5g
Trang 31Mơi trường Czapek
Sacaoa (hay glucoza) 30g
NaNO, 2g K,HPO, lg MgSO,.7H,O 0,5g KCl 0,5g FeSO,.7H,O 10mg Nước cất 1000ml (pH = 7,0 - 7,3) Mơi trường cĩ chất chống nấm Pepton 0,5g Glucoza 1,58 KH,PO, 0,5g MgSO,.7H,O 0,2g FeSO,.9H,O vết Nước cất 1000ml] (pH = 7,0) 1 Quan sát khuẩn lạc
- Khuẩn lạc thường cĩ dạng vơi, chắc, cĩ nếp nhăn, mép khơng thẳng
- Trên mơi trường đặc sợi xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: sợi cơ chất (hay sợi thuỷ tinh) và sợi khí sinh
2 Quan sát sợi khí sinh
- Dùng xạ khuẩn đã nuơi cấy 7 - § ngày trở lên
- Lấy một lá kính (lamelle) sạch, đặt trên mặt khuẩn lạc, khẽ ấn cho lá kính gắn vào
bề mặt khuẩn lạc
- Lấy lá kính ra, úp trên bản kính sạch đã cĩ sắn thuốc nhuộm xanh methylen
- Đặt lên kính hiển vi quan sát Vẽ hình
Cách làm này cĩ thể quan sát được: sợi khí sinh, hình dạng sợi bào tử, bào tử
* Cách xem trực tiếp khơng nhuộm màu:
Đưa khuẩn lạc mọc trên mơi trường thạch ở hộp petri, xem trực tiếp dưới kính hiển
Trang 32Phương pháp này đơn giản, nhanh và cĩ thể xem được hình thái tổng quát của xạ
khuẩn và sợi bào tử Muốn thực hiện được mơi trường nuơi cấy phải trong, mỏng vừa
phải Sợi khí sinh và sợi bào tử dài lại mọc trên mơi trường nên muốn quan sát được tồn
bộ xạ khuẩn phải vừa xem vừa điều chỉnh kính hiển vi
3 Xem sợi cơ chất
- Dùng kim mũi mác vơ trùng, lấy một ít thạch vơ trùng cĩ sợi xạ khuẩn
- Đặt lên bản kính sạch, sau đĩ lấy phiến kính khác đè lên và ép cho thạch thành
một lớp mỏng :
- Để khơ khơng khí - Nhuộm mau xem kính
- Quan sát độ lớn của sợi, sợi đơn bào, so sánh độ lớn của sợi với vi khuẩn và độ lớn
của sợi nấm nếu cĩ
II QUAN SÁT NẤM MỐC
1 Mơi trường nuơi cấy Mơi trường Martin:
Gluco 10g Pepton 58 KPO, lg MgSO, 7H,0 0,5g Rose bengale 1/30000 100ml Nước cất 900ml Thạch 20g
Mơi trường Martin cải tiến:
Trang 33Trước khi dùng thêm vào mỗi bình 100ml] sắp đơng 10 giọt natri taurocholat 10%
và streptomyxin với nồng độ 3mg/100ml
Mơi trường Comn:
KNO, 2g
MgSO, 7H;0 1,2g
KH,PO, 2,7g
Maltoza 7,20
Nước đủ 1000ml
Mơi trường bột ngơ:
Bột ngơ 26g
Pepton 20g
Glucoza 20g
Nước đủ 1000ml
-2 Dụng cụ nguyên liệu
- Bản kính, lá kính, đèn cồn, lưỡi lam, kim khêu nấm
- Dung dịch lacto - phenol
- Nấm mốc nuơi cấy 5 - 6 ngày trên thạch 3 Quan sát nấm mốc Mucor
- Dùng kim khêu sợi nấm khí sinh
- Đưa lên bản kính cĩ dung dịch lacto - phenol hoặc dung dịch xanh methylen
- Quan sát sợi khí sinh khơng cĩ vách ngăn
- Quan sát cơ quan sinh sản: bào tử nang (Sporangium) và bào tử kín (Sporang1ospore)
- Vẽ hình
4 Quan sát nấm mốc Aspergillus và Penicillium
4.1 Quan sát khuẩn lạc: ˆ
- Khuẩn lạc Aspergillus trén dia thach: khuan lac bang phẳng, cĩ mầu Tuỳ loại
nấm, cĩ thể cĩ mầu xanh, đen là mầu của bào tử
- Khuẩn lạc Penicilliưm trên thạch đĩa: khuẩn lạc bằng phẳng, thường bên ngồi
Trang 344.2 Quan sát sợi nấm thuỷ sinh:
- Dùng một lưỡi lam cắt một lát mỏng thạch xung quanh khuẩn lạc
- Đặt lên kính, xem ở vật kính 8x rồi 40x
- Quan sát khuẩn ty cĩ vách ngăn ngang, vẽ hình
4.3 Quan sát sợi nấm khí sinh và cơ quan sinh sản:
- Dùng kim khêu nấm, lấy một ít sợi nấm, đưa lên kính
- Xem ở vật kính 8x rồi 40x, vẽ sợi nấm cĩ vách ngăn
- Xem cơ quan sinh sản: dùng kim khêu nấm, lấy một ít thạch cĩ sợi nấm khí sinh,
đưa lên kính, xem ở vật kính 8x rồi 40x
Cơ quan sinh sản cha nam Aspegillus cé hình như hoa cúc Cơ quan sinh sản của Penicillium cé hinh nhu bàn tay xoè
- Vế hình
+ Bào tử của Aspegillus và Penicilhiưn + Cuống bào tử đính nấm (Conidiphore) 5 Quan sát nấm men
3.1 Mơi trường Mơi trường Hansen:
Pepton 10g MgSO, 7H;0 2g Mantơ 50g Nước 1000ml KH; PO, 3g Thạch 20g
Mơi trường nấm men - Glyxerin:
Nước chiết nấm men 1000ml
Glyxerin 50ml
Thạch 20g
Mơi trường cao mầm lúa:
Trang 35Cao nấm men 3g
Pepton 5g
Gluco 10g
Thach 20g
Nước cất 1000ml Mơi trường khoai tây - đường cám:
Khoai tây 300g
Cám 100g
Đường kính 50g Nước cất 1000ml
Thạch 20g
+ Lấy 300g khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái nhỏ, thêm 300ml] nước, đun sơi và lọc
+ Cân 100g cám, cho 500ml nước, đun sơi 30 phút, lọc lấy nước trong
+ Trộn 2 dịch lọc với nhau
+ Thêm 50g đường và 20g thạch, đun nĩng chảy, bổ sung nước vừa đủ 1000m] 5.2 Các bước tiến hành
- Giống nấm men trong ống thạch nghiêng - Dùng que cấy lấy I vịng nấm men
- Trên 1 bản kính cĩ giọt lugol, trộn đều vịng nấm men vao dich lugol
- Để khơ xem kính
- Tế bào nấm men màu vàng Vách tế bào màu sâm hơn Trong nguyên sinh chất cĩ các hạt màu tím Đấy là hạt tinh bột dự trữ của tế bào
Trang 36Bài 4
CHUẨN BỊ MƠI TRƯỜNG NUƠI CẤY VI SINH VẬT
Mục đích, yêu câu:
+ Giúp sinh viên hiểu rõ và nắm được các loại mơi trường, cách pha chế mơi trường nuơi cấy vi sinh vật
+ Tự lập pha chế mơi trường nuơi cấy vi sinh vật Nội dung thực hành:
+ Sự cần thiết phải chuẩn bị mơi trường nuơi cấy vi sinh vật
+ Giới thiệu một số loại mơi trường nuơi cấy vị sinh vat + Khử trùng các dụng cụ dùng pha chế mơi trường + Khử trùng mơi trường nuơi cấy vi sinh vật
I GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ MƠI TRƯỜNG 1 Sự cần thiết phải chuẩn bị mơi trường nuơi cấy vi sinh vật
Bất kỳ một cơng việc nào về vi sinh vật học và tất nhiên là bất kỳ một thực nghiệm nào cũng đều liên quan tới việc chuẩn bị các mơi trường dinh dưỡng để nuơi cay vi sinh vat
Mơi trường cần thiết cho việc nuơi cấy tích luỹ, phân lập, bảo quản giống vi sinh vật, cũng như để nuơi cấy với mục đích nghiên cứu quá trình trao đổi chất hoặc thu nhận
các sản phẩm trao đổi chất cĩ giá trị ở vi sinh vật Mơi trường cần phải chứa đựng tất cả
các thành phần cần thiết đối với các quá trình cấu trúc và quá trình năng lượng của tế bào - các nguồn carbon, nitrogen, nguyên tố khống và nguyên tố vi lượng
Khả năng tổng hợp và cách thức thu nhận năng lượng ở vi sinh vật khác nhau rất
nhiều Vì vậy nhu cầu về các chất dinh dưỡng của chúng cũng rất khác nhau Do đĩ rõ
ràng là khơng thể cĩ một loại mơi trượng vạn năng nào thích hợp như nhau đối với tất cả các loại vi sinh vật Sự khác nhau về trao đổi chất của vi sinh vật trước hết là ở mối quan ˆ
hệ của chúng đối với các nguồn thức ăn carbon và nitrogen, vì vậy cho nên các nguyên tố này được đưa vào mơi trường dưới dạng các chất khác nhau và chính những nguồn
thức ãn này tạo nên những tính chất riêng biệt của từng loại mơi trường
Các vi sinh vật tự dưỡng cĩ khả năng dùng CO; trong khơng khí hoặc các muối carbonat làm nguồn thức ăn carbon duy nhất đối với chúng trong khi các hợp chất này
Trang 37Để nuơi cấy các vi sinh vật dị dưỡng cần phải cĩ các mơi trường chứa các hợp chất ` carbon cĩ tính khử nhiều hơn, tuỳ theo đặc điểm sinh lý - sinh hố của vi sinh vật mà chúng cĩ thể là các hợp chất khác nhau, chẳng hạn như axit hữu cơ, rượu, hydrat carbon, hydrocarbon
Nhu cầu của các vi sinh vật đối với nguồn nitrogen cũng khơng giống nhau Để
nuơi cấy các vi sinh vật cố định nitrogen phân tử, cần sử dụng các mơi trường khơng
chứa nitrogen ở dạng hợp chất Trong thành phần của tất cả các mơi trường khác, người ta sử dụng các hợp chất chứa nitrogen khác nhau Cĩ thể là nitrat hoặc muối amơn, cĩ
thể là một số aminoaxit Hoặc là như chúng ta đã biết cĩ các vi sinh vật cần sử dụng đủ
cả một loại các aminoaxit hoặc protein
Nhu cầu của các nhĩm vi sinh vật khác nhau về các nguyên tố khống hoặc các nguyên tố vi lượng được đáp ứng thường bằng các loại muối khống nào đĩ Vì vậy cái gọi là “ muối khống cơ sở” của các mơi trường đối với nhiều loại vi sinh vật cĩ thể là
rất giống nhau về thành phần
Ngồi các nguyên tố cần thiết đối với các quá trình cấu trúc, mơi trường cịn phải chứa các các nguyên liệu năng lượng Trong các mơi trường nuơi cấy vi sinh vat di dưỡng, các hợp chất carbon trong phần lớn trường hợp cũng đồng thời là các nguyên liệu năng lượng Trong các mơi trường nuơi cấy các vi sinh vật tự dưỡng thì vai trị đĩ lại được thực hiện bằng các muối khống
Như vậy rõ ràng là khi thành lập mơi trường nhất thiết phải xét đến đặc điểm trao đổi chất của vi sinh vật Ngồi ra các mơi trường dùng cho ngay chỉ một loại vi sinh vật nào đĩ cũng cĩ thể khác nhau tuỳ thuộc vào nhiệm vụ nghiên cứu Chẳng hạn mơi trường để giữ giống vi sinh vật lâu dài trong điều kiện phịng thí nghiệm
hồn tồn khắc hẳn so với mơi trường nuơi cấy để nhằm thu nhận các sản phẩm trao
đối chất nào đấy
Nhưng dù cho mơi trường cĩ hồn thiện đến đâu thì các thành phần của chúng cũng cĩ thể khơng được sử dụng nếu như độ axit hoạt động của mơi trường (pH) khơng tương
ứng với giới hạn mà các vi sinh vật được nghiên cứu cĩ thể phát triển được Vì vậy khi
chuẩn bị mơi trường phải kiểm tra pH và nếu cần phải điều chỉnh tới mức độ cần thiết
nhờ sử dụng các dung dịch axit (HCI, H;SO,) kiểm (NaOH, KOH) hoặc các muối cĩ
phản ứng kiểm (Na,CO;, NHCO,) Khi khử trùng, pH của mơi trường cĩ thể thay đổi, vì
vậy nhiều khi cần phải kiểm tra lại pH của các mơi trường đã khử trùng và trong trường
hợp cần thiết phải sử dụng các dung dịch axit hoặc kiểm đã khử trùng để điều chỉnh lại pH của mơi trường
2 Một số loại mơi trường nuơi cấy vi sinh vật
Trang 382.1 Mơi trường tự nhiên
Mơi trường tự nhiên là các mơi trường làm thành từ các sản phẩn cĩ nguồn gốc
động vật hoặc thực vật Thuộc loại này là nước ép rau hoặc quả, tổ chức mơ cơ động
vật, máu pha lỗng, sữa, nước biển, nước hồ, nước suối khống, hoặc cũng cĩ thể là
nước đun hoặc nước chiết nhận được khi chế tạo từ các cơ chất tự nhiên, ví sụ như thịt, phân, đất, các bộ phận của thực vật Trên mơi trường tự nhiên, nhiều loại vi sinh vật
phát triển rất tốt bởi vì các mơi trường này cĩ chứa đủ tất cả các thành phần cần thiết
cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng Tuy nhiên các mơi trường này cĩ thành phần hố học phức tạp, khơng ổn định và ít thuận lợi đối với việc nghiên cứu về sinh lý trao đổi chất của vi sinh vật bởi vì chúng khơng cho phép xác định được nhu cầu của hàng loạt các thành phần mơi trường tạo thành trong quá trình phát triển Các mơi
trường tự nhiên chủ yếu được dùng để giữ giống, để nuơi cấy tích luỹ sinh khối hoặc
để định tên vi sinh vật
Ví dụ về các mơi trường tự nhiên cĩ thành phần khơng xác định thường được sử dụng rộng rãi trong thực nghiệm ở phịng thí nghiệm là mơi trường canh thịt - pepton, mơi trường nước mạch nha, mơi trường nấm men, mơi trường khoai tây, mơi trường
nước chiết đất
2.1.1 Mơi trường canh thịt - pepton (MPB): là mơi trường dùng để nuơi cấy các
loại vi sinh vật dị dưỡng Chuẩn bị mơi trường này như sau:
Lấy 500g thịt đã loại bỏ xương, mỡ, gân và thái nhỏ hoặc đem xay nhỏ trong cối
xay thịt, thêm | lít nước máy và để ở nhiệt độ phịng trong 12 giờ hoặc để ở tủ ấm ổn nhiệt 30°C trong 6 giờ, ở tủ ấm ổn nhiệt 37C trong 2 giờ Trong khoảng thời gian này
nhiều chất khác nhau đã được chiết ra từ thịt, trong đĩ cĩ vitamin tan trong nước Sau đĩ ' vát lấy nước, lọc qua vải màn (vải gạc) rồi đem đun sơi 30 phút Đợi nguội lọc lại qua
bơng, bổ sung nước tới mức ban đầu, sau đĩ bổ sung thêm 0,5% NaCl va 1% pepton Pepton là một hỗn hợp các pholipeptid (các sản phẩm phân giải khơng triệt để của protein) cĩ chứa nhiều hay ít các aminoaxit tự do, các enzIm, axit nucleic và một số
vitamin Người ta chế tạo ra pepton bằng cách thuỷ phân thịt hoặc cazein nhờ axit hoặc
nho enzim
Như vậy mơi trường canh thịt - pepton là một mơi trường giàu dinh dưỡng nhưng
hầu như khơng cĩ chứa hydrat carbon MPB được khử trùng ở I atm trong 20 - 30 phút
2.1.2 Mơi trường mạch nha: là một mơi trường tốt đối với nhiều vi khuẩn lactic, vi khuẩn axetic, nấm men, nấm mốc và các vi sinh vật dị dưỡng khác thường sử dụng đường làm nguồn carbon và làm nguyên liệu năng lượng Trong mạch nha cĩ chứa các aminoaxit, các yếu tố của axit nucleic, vitamin (chủ yếu là các vitamin nhĩm B) các axit hữu cơ khơng chứa nitrogen, các muối khống, một khối lượng lớn hydrat carbon (đến
20%, trong đĩ 80% là maltoza) - tức là tất cả những thứ cần thiết nhất cho sự phát triển
Trang 39Mạch nha được chuẩn bị như sau: lấy 250 g đại mạch nảy mầm (cĩ thể thay bằng
thĩc mầm - NĐD) đã xay nhỏ, thêm I lít nước máy, làm nĩng lên đến 45 - 50°C và duy trì ở
nhiệt độ này trong vịng nửa giờ, liên tục khuấy trộn để trách vĩn cục Sau đĩ nâng lên đến nhiệt độ 55 - 58°C và giữ cho đến khi đường hố hết tinh bột tức là cho tới khi khơng cịn thấy phản ứng màu với thuốc thử iốt Trong điều kiện nĩi trên đã xảy ra cả quá trình thuỷ phân protein thành aminoaxit và polipeptid Nước chiết được lọc qua bơng hoặc qua giấy lọc Nồng độ đường trong dung dịch được xác định bằng tỷ trọng kế Balling, số bộ Balling
CB) gần tương ứng với số phần trăm của lượng chứa đường trong dung dịch Nồng độ đường trong nước mạch nha mới ché tao thudng dat tdi 16 - 18°C Mu6n cĩ các nồng độ
mạch nha cần thiết ta dùng nước máy để pha lỗng ra Đối với nấm mốc ta sử dụng nồng
độ 3 - 4'B, đối với nấm men - 6 - 8°B, cịn đối với phần lớn các vi khuẩn lactc - 8 - 12°B
nước mạch nha được khử trùng ở 0,5 atm trong 20 - 30 phút
2.1.3 Mơi trường nấm men: được sử dụng để nuơi cấy nhiều đại diện khác nhau
của các vi sinh vật dị dưỡng Cơ sở của mơi trường nấm men là nước nấm men Để chế tạo nước này ta lấy 70 -100g men ép tưới hoặc 7 - 10 g men khơ hồ vào 1 lít nước máy rồi đun sơi trong vịng 10 - 30 phút Sau đĩ để lắng dung dịch ở ống đong đặt trong tủ lạnh, gạn lấy dịch rồi lọc qua bơng Bổ sung thêm 1 lít nước máy nữa, đun sơi lại 30 phút rồi lọc lại Bổ sung thêm vào nước men thu được hydrat carbon (1 - 2%) và muối
khống, thường là K;HPO, (0,1%) va NaCl (0,5%) Điều chỉnh pH của mơi trường đến
6,8 - 7,2; phân phối mơi trường vào các dụng cụ cần thiết rồi khử trùng 6 0,5 atm trong °
20 - 30 phút
2.1.4 Mơi trường khoai tây: được sử dụng chủ yếu để phân lập và nuơi cấy các lồi trong giống Closfridiưm và các đại diện vi khuẩn phân giải tỉnh bột khác Để chuẩn bị
cho mơi trường này, ta chọn các củ khoai tây tốt rồi rửa sạch, gọt vỏ, bỏ chồi và các chỗ thương tổn, sau đĩ rửa lại Đem 200g khoai tây này cất nhỏ ra, thêm một lít nước máy, đun sơi 15 phút, phân phối vào các dụng cụ nuơi cấy Mơi trường khoai tây được khử trùng ở 1,5atm trong 30 phút Sau khi khử trùng bổ sung thêm CaCO; đã khử trùng riêng vào mơi trường
2.1.5 Nước chiết đất: được dùng để phân lập vào nuơi cấy các vi sinh vật đất Để
chuẩn bị mơi trường này ta lấy Ikg đất giầu chất mùn, thêm 1 lít nước máy hồ đều rồi đun sơi trong 30 - 40 phút Để lắng rồi gạn ra đem ly tâm bỏ cặn Nếu cần thì trung hồ lại dich loc, b6 sung 0,5g K,HPO,, phan phối vào các dụng cụ nuơi cấy và khử trùng ở
1,5 atm trong 30 phút
2.2 Mơi trường tổng hợp
Mơi trường tổng hợp là những mơi trường chỉ gồm các hợp chất hố học tỉnh khiết,
xác định và được lấy với những nồng độ cho trước Mơi trường tổng hợp thích hợp nhất cho việc nghiên cứu trao đổi chất ở VSV Vì đã biết rõ thành phần và số lượng các chất đưa vào mơi trường, cho nên cĩ thể nghiên cứu được nhu của chúng cũng như sự chuyển
Trang 40Để thiết lập các mơi trường tổng hợp cần phải biết rõ nhu cầu của VSV và các chất
dinh dưỡng và các đặc điểm trao doi chất chủ yếu của chúng Các nhà VSV học đã tạo ra
khơng ít các mơi trường tổng hợp với chất lượng khơng thua kém những mơi trường tự nhiên cĩ thành phần khơng xác định Tuỳ thuộc vào nhu cầu của VSV, các mơi trường
tổng hợp cĩ thể gồm rất nhiều thành phần chẳng hạn như đối với các mơi trường nuơi
cấy nhiều loại vi khuẩn lactic, trong khi đĩ cũng cĩ những mơi trường khá đơn giản về thành phần, chẳng hạn như các mơi trường nuơi cấy các VSV tự dưỡng
Thơng thường mơi trường tổng hợp được pha trong nước máy và khơng cần bổ
sung thêm các nguyên tố vi lượng bởi vì chúng đã luơn cĩ sắn chút ít trong nước máy hoặc cĩ thể từ thuỷ tinh của chai lọ mà tan vào mơi trường Nĩi chung người ta chỉ đưa vào mơi trường các nguyên tố vi lượng mà loại VSV đang nghiên cứu cĩ nhu cầu đáng kể
Trong các mục đích đặc biệt, chẳng hạn như khi cần nghiên cứu nhu cầu của VSV
đối với từng loại thành phần của muối khống thì người ta pha mơi trường tổng hợp '
trong nước cất Trong trường hợp này nhất thiết phải đưa thêm các nguyên tố vi lượng vào mơi trường
Các mơi trường đã được gọi là mơi trường bán tổng hợp cũng thuộc loại mơi trường tự nhiên cĩ thành phần khơng xác định Trong thành phần của chúng, ngồi các hợp chất đã biết rõ bản chất hố học, cịn cĩ cả những chất chưa biết rõ thành
phần Những mơi trường như vậy được sử dụng phổ biến trong VSV cơng nghiệp để
thu nhận các axit amin, vitamin và các sản phẩm quan trọng khác trong hoạt động
sống của VSV
Thuộc về mơi trường bán tổng hợp ví dụ như mơi trường canh thịt - pepton với g#lucoza và photphatkali, mơi trường khoai tây gluco và pepton Các mơi trường nay cấu tạo chủ yếu bởi các thành phần khơng xác định
2.3 Mơi trường bán tổng hợp
Mơi trường bán tổng hợp cĩ thể gồm cả những mơi trường chủ yếu cấu tạo bởi
các hợp chất biết rõ thành phần hydratcacbon, nitrat hoặc muối amơn, phơtphat và các chất khác, cịn hợp chất chưa biết rã thành phần cĩ thể là dịch thuỷ phân cazein, dịch tự phân nấm men, cao ngơ - những thứ bổ sung với tính chất dùng làm nguồn vitamin và chất sinh trưởng
2.3.1 Dịch thuỷ phân cazein: được sử dụng chủ yếu như là nguồn các aminoaxit Thơng thường người ta chế tạo ra nĩ bằng phương pháp thuỷ phân nhờ axit Trong loại dịch thuỷ phân này hồn tồn thiếu tryptophan Để chế tạo dịch thuỷ phân cazein, ta lấy
20g cazein, ta lấy thêm 200ml nước và 10ml H,SO, đặc, giữ 4 giờ trong nồi hấp áp lực với áp suất 1,5atm Sau đĩ dùng dung dịch NaOH 50% trung hồ đến pH - 7,0 Lọc qua