Vi sinh vật phân giải xenluloza kỵ khí trong đất

Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Tr-ờng Đại học Vinh khoa sinh häc -  khoá luận tốt nghiệp cử nhân sinh học chuyên ngành: Di truyền vi sinh vi sinh vật phân giải xenlulôza kỵ khí đất Giáo viên h-ớng dẫn : Nguyễn D-ơng Tuệ Sinh viên thực : Hắc Bá Thành Lớp : 42E2 - Sinh Vinh, 2006 - Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn em đà nhận đ-ợc quan tâm, giúp đỡ thầy cô giáo khoa sinh học, phòng Thí nghiệm di truyền vi sinh đà giúp ®ì em vỊ c¬ së vËt chÊt cịng nh- tinh thần trình tiến hành Đặc biệt thầy giáo Nguyễn D-ơng Tuệ đà quan tâm h-ớng dẫn tận tình giúp đỡ em hoàn thành với ph-ơng pháp nghiên cứu khoa học đến lúc hoàn thành luận văn Qua em xin gửi lời cảm ơn quan tâm, giúp đỡ, động viên tất bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian qua Vinh, ngày tháng năm Sinh viên thực Hắc Bá Thành Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Phần I: Đặt vấn đề Xenluloza thành phần chủ yếu tổ chức thực vật Hàm l-ợng Xenluloza xác thực vật thay đổi khoảng 50 80% (tính theo khối l-ợng thô), sợi hàm l-ợng th-ờng v-ợt 90%, -ớc tính tổng l-ợng Xenluloza trái đất vào khoảng 35 tỷ (Nguyễn Lân Dũng cộng 1980) Xenluloza lại hợp chất bền vững, loại polysaccarit cao phân tử, chúng cấu tạo nhiều gốc - glucozơ, liên kết với nhờ dây nối - 1,4 glucozit Mỗi phân tử th-ờng có chứa từ 1400 10.000 gốc glucozơ, khối l-ợng phân tử Xenluloza thay đổi khác phụ thuộc vào tuỳ loại thực vật tuỳ ph-ơng pháp xác định Xenluloza có cấu tạo dạng sợi có cấu trúc phân tử polimer mạch thẳng, đơn vị disacarit gọi Xenlubioza Xenlubioza có cấu trúc từ hai phân tư D -  - glucoz¬ CÊu tróc bËc hai bậc ba phức tạp thành cấu trúc dạng lớp gắn với lực liên kết hydro Lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên bền vững Xenluloza hợp chất khó phân giải Dịch tiêu hoá ng-ời động vật tiêu hoá đ-ợc chúng, động vật nhai lại tiêu hoá đ-ợc Xenluloza nhờ khu hệ vi sinh vật sống động vật nhai lại (Trần Cẩm Vân Giáo trình vi sinh vật học môi tr-ờng năm 2000 NXBĐHQG HN) Xenluloza đ-ợc sử dụng d-ới dạng rơm, rạ, giấy, mạt c-a loại nguyên liệu tuỳ theo đối t-ợng vi sinh vật có cách xử lý thích hợp khác Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Hiện h-ớng sử dụng trực tiếp Xenluloza hạn chế (Trần Thị Thanh Công nghệ vi sinh 2001 NXBGD) Sự phân giải Xenluloza đ-ợc thực điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, môi tr-ờng kiềm hay axit, độ ẩm thấp cao nhiệt độ khác Tất vi sinh vật tham gia vào việc vô hoá Xenluloza thuộc loại dị d-ỡng hoá hữu Chúng hình thành men Xenluloza xúc tác việc phân giải Xenluloza thành Xenlubioza glucoza, sử dụng hợp chất sinh làm nguồn bon nguồn l-ợng N.X.Egrov Thực tập vi sinh vật học NXB MIR Maxcơva (1983) Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả phân huỷ Xenluloza nhờ có hệ enzym Xenlulaza bào Nhóm vi khuẩn kỵ khí bao gồm: Clotridium đặc biệt nhóm vi khuẩn sống cỏ động vật nhai lại, nhờ nhóm vi khuẩn mà trâu bò sử dụng Xenluloza nh- vi khuÈn: - Ruminococus albus - Ruminocus flavefacius - Cillobacterium Cellulosolvens Trong điều kiện hiếu khí kỵ khí Xenluloza bị phân giải d-ới tác dụng nhiều nhóm vi sinh vật nh- vi khuẩn, niêm vi khuẩn, xạ khn, nÊm mèc, nÊm men, nÊm mđ C¸c vi khn có khả phân giải Xenluloza mạnh thuộc chi nh-: Achromobacter, Pseudomonas, Cellulomonas, Vibrio, Cellvibrio, Clotridium, Baccillus (vi khuÈn), Bac omelianskii, Bac.Cellulosaedissolven Nhiều nghiên cứu gần cho biết vi sinh vật làm sinh hai loại enzym phân giải Xenluloza: Xenlulaza C Xenlulaza Cx enzym C1 tác dụng sơ vào phân tử Xenluloza thiên nhiên biến chúng thành chuỗi Xenluloza mạch thẳng Sau d-ới tác dụng enzym Cx bị phân hủy thành đ-ờng Xenlubioza (gồm hai phân tử -glucoza), Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành loại đ-ờng tan n-ớc d-íi t¸c dơng cđa  - Glucozidaza (hay Xenlobioza) rÊt dễ dàng chuyển hoá thành glucoza Nguyễn Lân Dũng Nguyễn Đình Quyến -1998- vi sinh vật học Trong điều kiện n-ớc ta việc tìm kiếm nòi vi sinh vật có khả phân giải mạnh Xenluloza có ý nghĩa lớn đặc biệt khả sử dụng vi sinh vật để chế biến nguyên liệu giàu Xenluloza tạo sinh khối dùng chăn nuôi, lên men sản xuất cồn thay xăng góp phần xử lý chất thải rắn, hạn chế ô nhiễm môi tr-ờng Chính lẽ vào tìm hiểu vi khuẩn có khả phân giải Xenluloza để ứng dụng vào thực tiễn Mục tiêu đề tài -Tìm chủng vi sinh vật có khả phân giải yếm khí Xenluloza -Chọn chủng để nghiên cứu đặc điểm hình thái khả phân giải Xenluloza để sử dụng vào thực tiễn -Rèn luyện ph-ơng pháp nghiên cứu làm việc phòng thí nghiệm Phần II: Tổng luận I Tình hình nghiên cứu n-ớc Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Ngoài vi sinh vật hiếu khí số vi khuẩn kỵ khí có khả tham gia tích cực vào trình phân giải Xenluloza Ng-ời ta gọi trình phân giải Xenluloza kỵ khí trình lên men Xenluloza C.Thermocellum loại vi khuẩn đ-ợc nghiên cứu nhiều nhà khoa học Nga A.A.Imseuhietxki chúng phân lập lần từ phân ngựa, lúc non có hình que ngắn, tr-ởng thành có hình uốn cong với kích th-ớc dài, bào tử sinh đầu tế bào Loại vi khuẩn phát triển đ-ợc môi tr-ờng tổng hợp đơn giản chứa nguồn cácbon Xenluloza Xenlobioza, nguồn nitơ muối NH4+ chúng không sử dụng đ-ợc glucoza nhiều loại đ-ờng khác, chúng phát triển lên men mạnh mẽ nhiệt độ 60 650C, giới hạn nhiệt độ cao th-ờng 700C, 40 500C ng-ời ta nhận thấy chúng bắt đầu phát triển Sản phẩm trình lên men vi khuÈn nµy lµ etanol, Axit Axetic, Axit focmic, Axit lactic, hydro vµ CO2 Cã lÏ enzym Xenlulaza chØ gióp chúng chuyển hoá Xenluloza thành Xenlobioza Việc lên men Xenluloza đ-ợc thực nhờ xúc tác nhiều loại men khác vi sinh vật -a ấm C.omelianskii đ-ợc nhà khoa học Nga Omelianski phân lập năm 1902 Đó loại vi khuẩn có hình que, kích th-íc 0.5 – x -  m, có khả di động, bào tử đ-ợc hình thành đầu làm cho vi khuẩn trở nên có hình dáng giống dùi trống, loại vi khuẩn phát triển lên men mạnh mẽ 30 400C Sản phẩm trình lên men nµy lµ: etanol, Axit Axetic, Axit lactÝc, Axit focmic, H2 , CO2 Còn nhóm vi sinh vật đặc biệt có khả phân giải Xenluloza cách mạnh mẽ điều kiện kỵ khí đủ nhóm vi sinh vật sống cỏ trâu bò động vật nhai lại khác Trâu bò tiêu hoá đ-ợc cỏ, rơm rạ cộng sinh với khu hệ đông đúc sinh vật cỏ chúng, nhiều nghiên cứu cho biết Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành ml chất lấy đ-ợc từ cá ng-êi ta nhËn thÊy th-êng cã kho¶ng 109 – 1010 tÕ bµo vi khuÈn, sinh khèi vi khuÈn chiÕm đến 10% so với l-ợng khô toàn chất chứa cỏ trâu bò Ngoài vi khuẩn ml chất cỏ trâu bò thấy có khoảng vài triệu thể ®éng vËt nguyªn sinh (cịng chiÕm – 10% khèi l-ợng khô) Về khu hệ vi khuẩn cỏ hệ động vật nhai lại kể đến nhiều loài nh-ng số loài có khả phân giải Xenluloza mạnh mẽ là:Ruminococus flavefeciens, R.albus, Ruminobacter parvum, Bacteroides Succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Clotridium Cellobio parum, Cellulosolvens, Cillobacterium Các cầu khuẩn sống cỏ đ-ợc nghiên cøu rÊt nhiỊu nhÊt lµ thc vỊ hai loµi Ruminococus flavefeciens R.albus Ruminococus flavefeciens loại cầu gram d-ơng, th-ờng xếp thành chuỗi có khả sinh sắc tố vàng, sản phẩm cuối lên men Xenluloza Xenlobioza ,Axit xucxinic Axit Axetic Một số chủng có khả sinh l-ợng nhỏ Axit lactic, Axit focmic, Etanol R.Albus lên mem Xenluloza Xenlobioza th-êng lµm sinh Axit Axetic, Etanol, Axit focmic, H2 CO2 Bacteroidessuccinogenes loại trực khuẩn gram âm kỵ khí bắt buộc, không sinh bào tử, nguồn l-ợng tốt chúng Xenluloza glucoza Chúng có khả đồng hoá tinh bột, Xenlobioza, Pectin số đ-ờng khác Sản phẩm cuối trình lên men Xenluloza Axit Succinic l-ợng nhỏ Axit Axetic, Axit focmic, để phát triển tốt chúng đòi hỏi phải có muối amôn l-ợng nhỏ Xixtein, chúng cần biotin Axit paraaminobenzoic Để nuôi cấy loại vi khuẩn ng-ời ta th-ờng dùng môi tr-ờng chứa dịch cỏ, Xenluloza, số muối vô bicacbonat Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Bytyrivibrio fibrisolvens loại trực khuẩn uốn cong gram âm, không sinh bào tử Ngoài Xenluloza chúng đồng hoá tinh bột, hemixenluloza, Xilan,glucoza, galactoza, arabinoza nhiều hydratcacbon khác Để sinh tr-ởng tốt, loài vi khuẩn đỏi hỏi phải cung cấp số amino axit thiếu chất chúng phát triển chậm Chúng cần đ-ợc cung cấp số chất nh- biotin, axit folic, vitaminB6 loại vi khuẩn phân bố rộng tự nhiên Cellobacterium Cellulosolven trực khuẩn kỵ khí, không sinh bào tử , chúng thuộc loại gram d-ơng có khả di động, khả đồng hoá Xenluloza loại vi khuẩn đồng hoá glucoza, Xenlobioza, maltoza, Fructoza, insulin sản phẩm chủ yếu sinh môi tr-ờng chứa Xenluloza Axit lactic Về trực khuẩn kỵ khí không sinh bào tử có khả phân giải Xenluloza cỏ cần phải kể đến loài Clostridium Cellobioparum loại vi khuẩn phân lập từ năm 1944 (Hungate 1944) chúng thuộc loại vi khuẩn gram âm, có khả lên men Xenluloza số hydrat cacbon khác, sản phẩm trình lên men Axit Axetic, Axit lactic,Axit focmic, Etanol, H2 CO2 Gần ng-ời ta phân lập đ-ợc từ cỏ hai loài Clotridium khác (Cl.Locheadii Ch.longisporum) Khi lên men Xenluloza, Xenlobioza số đ-ờng khác loại vi khuẩn làm sinh nhiều chất nhầy II Cấu tạo Xenluloza Thành phần Xenluloza tinh khiết nguyên liệu chứa Xenluloza Nguyên liệu Xenluloza tinh khiết (%) Sợi 80 95 Gỗ thông 41 Bà mía 56,6 Rơm rạ 44 Luận văn tốt nghiệp Trấu lúa mì Hắc Bá Thành 30,5 Trấu lúa n-ớc 32,1 Vỏ đậu t-ơng 51 Thân ngô 36 Cá 28 Xenluloza cã cÊu tróc líp sỵi song song chuỗi Xenluloza gắn với nhờ mạng l-ới liên kết hydro lớp gắn với nhờ lực Van der van Trong tự nhiên chuỗi glucan Xenluloza có cấu trúc dạng sợi, đơn vị sợi nhỏ có đ-ờng kính khoảng 3nm, sợi sơ cấp hợp thành vi sợi có đ-ờng kính từ 10 40nm, vi sợi hợp thành bó sợi to, quan sát d-ới kính hiển vi quang học toàn lớp sợi lớp vỏ Hemixenluloza lignin gắn chặt bao bọc bên phân tử Xenluloza có cấu trúc không đồng gồm hai vùng Xenluloza có cấu trúc đặc, bền cïng víi sù cã mỈt cđa líp vá Hemixenluloza, lignin khiến cho xâm nhập enzym vào cấu trúc khó khăn làm tăng tính kỵ khí chuỗi - 1-4 glucan làm cản trở tốc độ phản ứng thuỷ phân Xenluloza cấu tạo gèc  - D glucopyranoza liªn kÕt víi qua d©y nèi 1,4 -  glucorit CH2OH CH2OH CH2OH n Các sợi xenluloza chứa khoảng 10-12 nghìn gốc - Glucopyranoza (Nguyễn Lân Dũng 1984) Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Xenluloza hợp chất bền vững không tan n-ớc không đ-ợc tiêu hoá đ-ờng tiêu hoá ng-ời động vật có cỏ túi Tuy nhiên cỏ động vật nhai lại đất có tồn nhiều loài vi sinh vật có khả sản sinh Xenluloza enzym, xúc tác trình chuyển phân Xenluloza thay đổi loại vi sinh vật III Công nghệ xử lý chất thải hữu vi sinh vật Nhờ hoạt động sống vi sinh vật chất hữu (CHO) có rác thải phân hủy thành phần nhỏ hơn, hình thành sinh khối vi sinh vật mới, sản phẩm trao đổi chất, chất khí nh- CH4, CO2, H2 trình chuyển hoá chất hữu xẩy d-ới tác dụng vi sinh vật điều kiện hiếu khí hay kỵ khí đ-ợc tóm tắt nh- sau: CHO -> Các chất hữu bị thuỷ phân + tÕ bµo vi sinh vËt + CO2 + H2O + CH4 + Kcal ủ kỵ khí ph-ơng pháp đơn giản dễ thực hiện, chi phí thấp thu khí mêtan làm chất đốt Nh-ợc điểm biện pháp trình xử lý th-ờng kéo dài không tận thu đ-ợc hết khí mêtan nên gây ô nhiễm môi tr-ờng Quá trình phân giải hợp chất cácbon tự nhiên trình sinh hoá phức tạp, nhờ hoạt động sống vi sinh vật l-ợng lớn chất hữu bị phân giải làm giảm trọng l-ợng Trong trình hydratcabon Xenluloza, Hemixenluloza, lizim đ-ợc phân giải thành phần nhỏ hơn, sinh khối vi sinh vật đ-ợc tạo thành đồng thời tạo sản phẩm trình trao ®ỉi chÊt c¸c chÊt khÝ (NH3, CO2 …) c¸c axit hữu cơ, axit focmic, axit axetic, axit propyonic, axit béo, axit lactic chất tiếp tục chuyển hoá thành sản phẩm khác Chu trình chuyển hoá hợp chất cácbon đ-ợc chuyển hoá qua hàng loạt phản ứng hoá học, xúc tác phản ứng enzym để trì sống, vi sinh vật sử dụng sản phẩm chúng phân huỷ hay vi sinh vËt kh¸c chun ho¸ 10 Ln văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Bảng 5a Hoạt tính chủng C1 KL giấy ban đầu KL giấy sau èng thÝ nghiƯm (mg) ngµy (mg) 173,5 153,2 126,4 102,4 188,0 151,8 197,3 159,3 212,9 183,8 X (mg) 179,6 150,1 G(%) 19,653 Ngµy 25/10/05 : G= G Gt 100(%) G0 G0: Khối l-ợng ban đầu Gt: Khối l-ợng lại sau phân giải G: Khả phân giải ảnh 1: Khuẩn lạc C1 đà phân lập đ-ợc ảnh 2: Khuẩn lạc C1 đà phân lập đ-ợc ảnh 6: ống nghiệm thử hoạt tính phân giải Xenluloza Qua bảng 5a thấy vận tốc phân giải Xenluloza kỵ khí đạt cao Nên sử dụng chủng để làm thí nghiệm Tìm nhiệt độ thích hợp, PH thích hợp, thời gian thích hợp để từ đ-a quy trình thích hợp cho vi khuẩn phát triển để áp dụng vào thực tiễn Bảng 5b Hoạt tính chủng C2 Ngày KL giÊy ban KL giÊy sau èng thÝ nghiÖm đầu(mg) ngày (mg) 182,1 171,5 27 Luận văn tốt nghiệp 25/10/05 208,7 Hắc Bá Thành 189,4 171,0 163,2 162,4 149,3 175,6 170,1 179,9 166,8 X (mg) G(%) 7,853 Nhận thấy qua bảng 5b tốc độ phân giải Xenluloza kỵ khí chủng C2 yếu Bảng 5c Hoạt tính chủng C4 Ngày 25/10/05 KL giấy ban đầu KL giấy sau ống thí nghiệm (mg) ngµy (mg) 154,2 153,8 169,2 162,4 212,9 209,8 234,3 232,1 192,5 116,0 192,6 190,8 X (mg) G(%) 0,932 Qua bảng 5a, 5b, 5c nhận thấy chủng C1 có tốc độ phân giải Xenluloza kỵ khí mạnh nên đà đ-ợc giữ lại để nghiên cứu nh-: tìm nhiệt độ thích hợp, pH, thời gian, để tìm quy trình thích hợp cho vi khuẩn phát triển mạnh để áp dụng vào thực tiễn Còn chủng C2 C4 tốc độ phân giải Xenluloza chậm nên không tiếp tục nghiên cứu mà nghiên cứu chủng C1 Số l-ợng vi khuẩn cần sử dụng Sau biết đ-ợc hoạt tính vi sinh vật Điều quan trọng phải biết đ-ợc số l-ợng vi sinh vËt ®Ĩ tõ ®ã cã thĨ tÝnh sè l-ợng cần thiết cho tác dụng lên đơn vị nguyên liệu có hiệu 28 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Số l-ợng vi sinh vật đ-ợc xác định sở đo độ đục máy đo màu quang điện Erma (Nhật) b-ớc sóng trung tính ( = 660nm) Với khối l-ợng nguyên liệu không đổi, số l-ợng vi sinh vật khác nhau, kết thu đ-ợc bảng sau: Bảng Số l-ợng vi sinh vật cần/đơn vị nguyên liệu Ngày 5/11/05 Vi sinh Khèi l-ỵng giÊy Khèi l-ỵng giÊy sau vật(ml) ban đầu (mg)-G0 ngày (mg)-Gt 194,6 147,8 28,8 232,4 195,6 36,8 222,5 187,5 35,0 184,3 159,8 24,5 155,0 135,0 20,0 G0 - Gt Qua bảng nhận thấy với 1ml vi sinh vật ch-a đủ phân giải xenluloza 2ml vi sinh vật khả phân giải xenluloza tốt nhất, tăng số l-ợng vi sinh vật lên có t-ợng ức chế cạnh tranh dinh d-ỡng dẫn đến hoạt tính phân giải xenluloza giảm ¶nh h-ëng cđa pH pH ¶nh h-ëng rÊt lín ®Õn phản ứng enzym vi sinh vật mà xenlulaza Vì thay đổi pH làm thay đổi trạng ion hoá bề mặt enzym mà dẫn đến hoạt tính thay đổi tất enzym nhạy cảm với thay đổi pHcủa môi tr-ờng có vùng pH mà hoạt độ enzym cực đại vùng pH kết nhiều tham số: nhiệt độ, lực ion hoá, nồng độ chất nghĩa yếu tố bên nh- chất enzym ( Đặng Thị Thu Công nghệ enzym 2004) Hoạt độ enzym phụ thuộc rõ rệt vào pH môi tr-ờng Đó pH môi tr-ờng có ảnh h-ởng đến mức độ ion hoá chất enzym trung tâm hoạt động phức chất enzym, chất ảnh h-ởng đến độ bền protein enzym đa số enzym bên giới hạn: < pH < độ bền 29 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành enzym tăng lên có yếu tố làm bền nh- chất Ca2+ (Nguyễn Lân Dũng Phạm Trần Châu (1982)) Đ-ờng cong biểu diễn ¶nh h-ëng pH ®Õn vËn tèc ph¶n øng cđa nhiỊu enzym có dạng hình sau: PH thích hợp cho hoạt động nhiều enzym vào khoảng Tuy nhiên cã mét sè enzym cã pH thÝch hỵp rÊt thÊp nh- (Pepxin, proteinaz axit vi sinh vật) cao (suptilizin pH thÝch hỵp >10) pH thÝch hỵp cđa số enzym không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nh- chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ (Phạm Thị Trân Châu Ho¸ sinh häc - NXBGD – 2000) Do vËy enzym protein axit amin trùng ng-ng với tạo nên Trong số gốc axit amin thuộc phân tử enzym có nhóm ion hoá đ-ợc số nhóm tham gia vào liên kết định vị chất, số khác tham gia vào phản ứng, đa số gốc đ-ợc dùng để trì hình thể enzym, gốc nh- chất nhiều tr-ờng hợp nhạy cảm với pH th-ờng có trạng thái ion hoá khác phụ thuộc vào giá trị pH Ta dễ dàng hiểu đ-ợc nhóm COO tâm hoạt động vốn cần thiết cho kết gắn chất, giảm pH môi tr-ờng dẫn đến biến thành nhóm COOH không kết gắn đ-ợc chất enzym hoạt tính Theo dõi ảnh h-ởng pH đến hoạt tính phân giải enzym chủng C1 thu đ-ợc kết bảng sau: 30 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Bảng - ảnh h-ởng pH Ngày PH ống TN KL.Giấy X (mg) ban đầu KL.Giấy X (mg G(%) 218,8 164,4 3,588 159,7 18,973 185,2 3,239 sau ngµy 12/11/05 0,2135 0,2135 0,1962 0,2469 0,2469 0,1468 0,1413 0,1860 0,1783 0,1698 0,2135 0,1815 0,1613 0,.1952 0,1634 0,1703 0,1703 0,2063 0,1971 218,8 170,3 190,0 191,2 0,1962 0,1821 0,1343 0,1986 0,1868 Qua bảng nhận thấy pH đà làm ảnh h-ởng đến hoạt tính enzym vi khuẩn pH tích hợp cho vi khuẩn phân giải pH trung tính nồng độ pH khác vi khuẩn phân giải yếu hầu nh- không phát triển đ-ợc nồng độ pH khác 250 khối l-ợng(mg) 200 150 khối l-ơng giấy ban đầu(mg) 100 khối l-ơng giấy sau ngµy(mg) 50 51 62 73 PH ảnh h-ởng nhiệt độ 31 84 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Tốc độ phản ứng enzym xúc tác tăng theo nhiệt độ giới hạn xác định mà phân tử enzym bền ch-a bị biến tính đại l-ợng đặc tr-ng cho ảnh h-ởng nhiệt độ đến tốc độ phản ứng hoá học nh- phản ứng enzym hệ số Q10 Đó tỷ lệ số tốc độ phản ứng nhiệt độ thấp 100C Q10 = Kl l Kl điều kiện tiêu chuẩn, phản ứng enzym chịu ảnh h-ởng lớn nhiệt độ đ-ợc biểu thị theo định luật Vanhot Hệ số lớn phản ứng khó xảy nhiệt độ bình th-ờng, hệ số nhiệt phản ứng hoá học -> phản ứng enzym từ -> Đa số phản ứng enzym cã hƯ sè nhiƯt b»ng Dùa vµo hƯ sè Q10 ta tính đ-ợc l-ợng hoạt hoá phản ứng enzym Xác định đ-ợc l-ợng hoạt hoá cho phép đánh giá tính chất enzym, đánh giá trình xúc tác, điều có ý nghĩa mặt sinh học Kết nghiên cứu ảnh h-ởng nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzym nhận đ-ợc th-ờng biểu diễn dạng hình sau: Nhiệt độ ứng với hoạt độ enzym cao gọi nhiệt độ hoạt động thích hợp enzym Nhiệt độ thích hợp đa số enzym vào khoảng 30 - 400C enzym thực vật số enzym vi sinh vật có nhiệt độ phát triển cao Nhiệt độ thích hợp enzym không cố định mà 32 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành thay đổi tùy theo chất, PH môi tr-ờng, thời gian tác dụng, nhiệt độ cao nhiệt độ phát triển, tốc độ phản ứng giảm xuống nhanh chóng nhiệt độ cao làm hỏng cấu trúc phân tử enzym Nh- chóng ta ®· biÕt, khèi vi sinh vËt kỵ khí phân giải hợp chất hữu tạo thành mêtan thể -a ẩm -a nhiƯt Do vËy thùc tÕ ta sư dơng hai trình lên men 30 350C 50 550C hai thang nhiệt độ ta nhận thấy: thang nhiệt độ thấp phản ứng xảy chậm hơn, thời gian thu khí dài tổng l-ợng khí sinh thấp nh-ng tỷ lệ CH hỗn hợp khí cao thang nhiệt độ cao phản ứng xÈy nhanh h¬n, nhiỊu h¬n, nh-ng tû lƯ CH4 thấp Thông th-ờng trình lên men quy mô nhỏ đ-ợc thực 30 350C, lên men công nghiệp với lò phản ứng lớn có điều kiện khí hoá tự động hoá cao đ-ợc thực 50 550C Kết theo dõi ảnh h-ởng nhiệt độ hoạt tính phân giải nh- sau: Bảng - ảnh h-ởng nhiệt độ Ngày Nhiệt độ ống TN KL.Giấy X (mg) ban đầu KL.Giấy X (mg G(%) 201,7 1,471 168,5 17,262 211,2 0,047 192,0 sau ngµy 20 C 30 C 30/11/05 40 C 50 C 0,1860 0,1793 0,1962 0,2324 0,2320 0,2105 0,1852 0,1891 0,1952 0,1658 0,2032 0,2032 0,2429 0,1878 0,1876 0,1532 0,1532 0,1856 0,2374 204,8 198,2 211,3 192,0 0,1938 0,1545 0,2429 0,1856 0,2374 33 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Qua bảng ta thấy nhiệt độ thay đổi làm ức chế hoạt hoá emzym Xenlulaza dẫn đến khả phân giải Xenluloza hầu nh- khả phân giải nhiệt độ: 20 0C, 400C 500C Chỉ phân giải mạnh nhiệt độ 300C Khả phân giải Xenluloza sau tuần nh- sau: 198,2 mg -> giảm xuống 168,5mg Khối l-ợng (mg) 250 200 150 khối l-ơng giấy ban đầu(mg) 100 khối l-ơng giấy sau ngày(mg) 50 20 0C 30 0C 3400C 50 40C Nhiệt độ Thời gian phân giải Với điều kiện đà nghiên cứu đ-ợc nh- nhiệt độ, PH, vi sinh vật cần tiếp tục nghiên cứu thời gian phân giải nhằm tìm hiểu thời gian thích hợp điều kiện thích hợp nh- 34 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Kết thu đ-ợc bảng Ngày Thời gian KL.Giấy ống TN tuÇn tuÇn 30/11/05 tuÇn tuÇn X (mg) KL.Giấy sau ban đầu tg phân giải 0,1821 0,1636 0,2343 0,1636 0,1458 0,1852 0,1320 0,2078 0,1852 0,1286 0,1710 0,0938 0,1624 0,2015 0,1756 0,1900 193,3 193,0 178,3 0,2043 0,1463 0,0867 X (mg G(%) 161,2 19,913 135,6 42,330 106,0 68,207 0,1374 180,3 Phân giải 100 hoàn toàn 0,1755 Qua bảng ta thấy sau tuần nuôi cấy khả phân giải Xenluloza hoàn toàn sau 21 ngày (3 tuần) 250 khối l-ợng(mg) 200 150 1tuần 2tuần 3tuần 4tuần 100 50 thêi gian 35 khèi l-ơng giấy ban đầu(mg) khối l-ơng giấy sau ngày(mg) Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Qua bảng nghiên cứu pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển pH = nồng độ pH khác ức chế hoạt hoá enzym Xenlulaza Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển 30 0C loại vi khuẩn -a ẩm, tăng giảm nhiệt độ ức chế hoạt hoá enzym phân giải Xenluloza, thời gian cần thiết để phân giải l-ợng Xenluloza hoàn toàn sau 21 ngày (3 tuần) Đây tiêu đà nghiên cứu đ-ợc thích hợp cho vi khuẩn phát triển Xác định số l-ợng vi sinh vật theo ph-ơng pháp CFU - Cấy lên nồng độ pha loÃng đĩa - Xác định số khuẩn lạc (ph-ơng pháp CFU) - Cấy vào môi tr-ờng thạch 1ml - Nuôi 300C ngày - Theo ph-ơng pháp trình bày mục 4.5 ta có: - Nồng độ pha loÃng: 10-4 10-5 Kết quả: Đĩa 1: 432 218 §Üa 2: 425 236 N= 435  218  425  236  5.972 x 105 (CFU/ml) 10 4 x x1  10 5 x x1 PhÇn IV: Kết luận đề nghị I Kết luận 36 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Qua kết nghiên cứu rút kết luận nh- sau: Khi nuôi vi khuẩn Xenluloza điều kiện kỵ khí sau ngày đà có vi khuẩn hoạt động hoạt động phân giải mạnh sau 21 ngµy Theo dâi thêi gian xt hiƯn cđa vi khuẩn Khuẩn lạc xuất sau ngày nuôi cấy, số khuẩn lạc tăng lên nhanh chóng sau ngày, sau giảm dần Sinh tr-ởng chủng Cho thÊy sù sinh tr-ëng sau ngµy chđng C1 80%, chủng C3 sinh tr-ởng yếu, chủng C2, C4, C5 sinh tr-ởng với tốc độ gần nh- ngang Chủng C1 có đặc điểm: Mọc nhanh sau ngày, khuẩn lạc tròn, đều, lồi, mép phẳng, cấu trúc đồng nhất, đ-ờng kính 0,9mm, có màu trắng đục Chúng nhận thấy vận tốc phân giải xenluloza kỵ khí chủng C1 cao cách xác định khối l-ợng tr-ớc sau chủng vi khuẩn tác dụng phân giải sau tuần lễ nên đà sử dụng chủng tìm pH thích hợp cho phân giải pH = 7, nhiệt độ thích hợp 300C, thời gian phân giải xenluloza nát hoàn toàn sau 21 ngày II Đề nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn, tiến hành thí nghiệm tìm hiểu sinh tr-ởng đặc điểm hình thái vi khuẩn phân giải Xenluloza kỵ khí số tiêu nh-: pH, nhiệt độ, thời gian Bên cạnh cần nghiên cøu tiÕp sư dơng c«ng nghƯ xư lý chÊt thải rắn giàu Xenluloza Có điều kiện xác định đồng phân - glucoza để sản xuất thức ăn cho gia súc, sản xuất cồn, axit axetic axit lactic 37 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Tài liệu tham khảo Phạm Thị Trân Châu Hoá sinh học NXBGD 1997 Nguyễn Lân Dũng cộng (1978) Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty - Vi sinh vật học NXBGD, 1980 Ngun L©n Dịng - Vi sinh vËt đất chuyển hoá hợp chất cacbon, nitơ - NXBKHKT 1984 Ngun L©n Dịng, Thùc tËp vi sinh vËt häc – NXB “ MiR” Maxc¬va (1983) Nguyễn Lân Dũng Ngô Kế S-ơng Sản xuất khí đốt (biogas) kỹ thuật lên men kỵ khí NXBNN TP HCM, 1997 Ngun L©n Dịng - KiĨm tra số l-ợng phân lập nhóm vi sinh vật Nguyễn Lân Dũng Phạm Thị Trân Châu – Enzym vi sinh vËt – TËp – NXBKHKT 1982 Nguyễn Thành Đạt H-ớng dẫn thực hành vi sinh vËt häc – NXBGD Hµ Néi – 1980 38 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành 10 Nguyễn Thành Đạt Thực tập vi sinh - NXBGD, 2000 11 Vị Minh §øc - Thùc tËp vi sinh häc NXBGD, 2001 12 Nguyễn D-ơng Tuệ Đại hoc Vinh - Thùc hµnh vi sinh vËt häc – 1995 13 Nguyễn D-ơng Tuệ Đại hoc Vinh Thực tập lớn vi sinh học 2003 14 Trần Thị Thanh Công nghệ vi sinh NXBGD 2003 15 Trần Minh Tâm Công nghệ vi sinh ứng dụng NXBKHNN, 2002 16 Đặng Thị Thu Công nghệ enzym NXBKHKT, 2004 17 Trần Cẩm Vân Giáo trình vi sinh vật học môi tr-ờng NXBĐHQG HN - 2000 Mục lục Trang Phần I: Đặt vấn đề Phần II: Tổng luận I Tình hình nghiên cứu n-ớc II Cấu tạo Xenluloza III Công nghệ xử lý chất thải hữu vi sinh vật IV Bản chất ứng dụng enzym Xenlulaza Phần III: Địa điểm, thời gian ph-ơng pháp nghiên cứu I Địa điểm nghiên cứu 39 Luận văn tốt nghiệp II Thời gian nghiên cứu Hắc Bá Thành III Ph-ơng pháp nghiên cứu 3.1 Thu mẫu vi sinh vật 3.2 Ph-ơng pháp nuôi cấy 3.3 Ph-ơng pháp phân lập vi sinh vật 3.4 Ph-ơng pháp theo dõi 3.5 Xác định số l-ợng vi sinh vật theo ph-ơng pháp CFU 3.6 ChØ tiªu thèng kª theo Rumxki V øng dơng 4.1 Thí nghiệm số l-ợng vi sinh vật cần/đơn vị nguyên liệu 4.2 ảnh h-ởng pH 4.3 ảnh h-ởng nhiệt độ 4.4 ảnh h-ởng thời gian 40 Luận văn tốt nghiệp Phần IV: Kết nghiên cứu Hắc Bá Thành Thời gian xuất vi khuẩn Xenluloza Ph©n lËp vi khuÈn Xenluloza Sinh tr-ëng chủng Đặc điểm khuẩn lạc Hoạt tính phân giải Xenluloza chủng Số l-ợng vi sinh vật cần sử dụng ảnh h-ởng pH ảnh h-ởng nhiệt độ ảnh h-ởng thời gian Phần V: Kết luận đề nghị I Kết luận II Đề nghị Tài liệu tham kh¶o 41 ... 1ml vi sinh vật ch-a đủ phân giải xenluloza 2ml vi sinh vật khả phân giải xenluloza tốt nhất, tăng số l-ợng vi sinh vật lên có t-ợng ức chế cạnh tranh dinh d-ỡng dẫn đến hoạt tính phân giải xenluloza. .. -1998- vi sinh vật học Trong điều kiện n-ớc ta vi? ??c tìm kiếm nòi vi sinh vật có khả phân giải mạnh Xenluloza có ý nghĩa lớn đặc biệt khả sử dụng vi sinh vật để chế biến nguyên liệu giàu Xenluloza. .. Bá Thành Ngoài vi sinh vËt hiÕu khÝ cßn mét sè vi khuÈn kỵ khí có khả tham gia tích cực vào trình phân giải Xenluloza Ng-ời ta gọi trình phân giải Xenluloza kỵ khí trình lên men Xenluloza C.Thermocellum