Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định đặc điểm cấu trúc phân tử gen LMP-1 của một số chủng EBV phân lập từ bệnh nhân ung thư vòm họng ở Việt Nam. Phân tích liên quan bệnh lý của gen mã hóa LMP-1 protein với quá trình methyl hóa gen RASSF1A trên BN ung thư vòm mũi họng.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN LMP-1 CỦA VIRUT EPSTEIN-BARR VÀ METHYL HÓA PROMOTER CỦA GEN RASSF1A Ở MỘT SỐ MẪU UNG THƢ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM Lê Thanh Hà*; Nguyễn Lĩnh Toàn**; Võ Thị Thương Lan*** Nguyễn Đình Phúc*****; Lê Thanh Hòa***** TĨM TẮT Từ mơ sinh thiết 15 bệnh nhân (BN) chẩn đoán ung thư vòm họng (UTVH), tách chiết ADN hệ gen EBV Bằng phản ứng PCR, dòng hóa giải trình tự, thu nhận tồn chuỗi ARN thơng tin gen LMP-1 (1083 - 1182 bp) Kết phân tích gen cho thấy vùng exon ổn định cao biến đổi tập trung vào vùng exon Đồng thời, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Methylation-specific PCR (MSP) để khảo sát mức độ methyl hóa 15 mẫu mơ bệnh RASSF1A gen ức chế khối u chọn để khảo sát mức độ methyl hóa Kết cho thấy: 15 mẫu bệnh phẩm UTVH, 12 mẫu (80%) có methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A Khi so sánh tỷ lệ với số cơng trình nghiên cứu khác giới, chúng tơi nhận thấy methyl hóa nghiên cứu chiếm tỷ lệ cao Nghiên cứu tiếp tục triển khai số lượng bệnh phẩm lớn nhằm góp phần giải thích chế bệnh sinh UTVH EBV * Từ khóa: LMP-1; Kỹ thuật MSP; Methyl hóa ADN; Ung thư vòm họng Characteristics of LMP-1 GENE molecular OF EPSTEINBARR VIRUS AND METHYLATION AT PROMOTERS OF RASSF1A FROM samples of NASOPHARYNGEAL CARCINOMA IN VIETNAM SUMMARY Genomic DNA of Epstein-Barr virus was extracted from biopsy tissue of 15 patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC) Using PCR, cloning and sequencing, the entire mRNA of the LMP-1 gene (1083 - 1182 bp) was obtained The results showed that the genetic analysis of exon has high stability and mutations focused on the exons and We used Methylation-Specific PCR (MSP) to analyze the methylation in tissues from these patients RASSF1A (tumor suppressor gene) was selected for examining the methylation Hypermethylation in RASSF1A was found in 12 samples (80%) Generally, the hypermethylation of this gene in this study were rather high compared with other equivalent studies Our research is being carried out with larger samples in order to evaluate the use of DNA methylation status of these candidate genes as a potential biomarker for Vietnamese NPC * Key words: LMP-1; MSP technique; DNA methylation; Nasopharyngeal carcinoma * Bệnh viện 103 ** Học viện Quân y *** Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội **** Viện Tai Mũi Họng Trung ương ***** Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS TS Trần Văn Khoa TS Nguyễn Đặng Dũng TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vòm họng khối u ác tính xuất phát từ lớp biểu mơ phủ vùng vòm mũi họng Nó dạng ung thư hàng đầu vùng địa lý Nam Trung Quốc, Đông Nam Á, Bắc Cực, Trung Đông, Bắc Phi Việt Nam UTVH có nguyên nhân phức tạp nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu Hiện nay, nguyên nhân bệnh tập trung thành ba nhóm chủ yếu virut Epstein-Barr (EBV), di truyền yếu tố môi trường, tập quán sinh hoạt Nhiễm tiềm tàng EBV tượng khởi đầu cho trình tiến triển ung thư Đặc trưng truyền nhiễm EBV chủ yếu biểu gen tiềm tàng, bao gồm EBNA-1, LMP-1, LMP-2 EBER [6] Trong gen protein ảnh hưởng đến tiến triển thành ung thư, LMP-1 có vai trò đặc biệt quan trọng chứng minh có khả đơn phương gây ung thư chuột thực nghiệm [6] LMP-1 gen tiềm ẩn EBV phát có chức chuyển đổi dòng thay đổi kiểu hình tế bào [7] RASSF1A (Ras association domain family isoform A) gen ACUT nằm vùng 3p21.3 nhiễm sắc thể số gen người [4] RASSF1A ức chế tăng trưởng khối u in vitro, in vivo xem gen ACUT điển hình Gen xác định vào năm 2000, đến có 150 nghiên cứu chứng minh q trình methyl hóa bất thường xảy đảo CpG thuộc vùng promoter RASSF1A diễn nhiều loại ung thư, UTVH, phổi, vú, thận, dày, bàng quang, tế bào thần kinh đệm [1] Tần số methyl hóa số gen phát phương pháp MSP (Methylation-Specific PCR) [5] Phương pháp dựa khác biệt trình tự ADN bị methyl hóa khơng methyl sau xử lý ADN dung dịch muối natribisulfit Quá trình xử lý ADN natribisulfite làm thay đổi trình tự ADN cách chuyển đổi tất cytosin khơng bị methyl hóa thành uracil, cytosin bị methyl hóa khơng thay đổi Hai cặp mồi đặc hiệu sử dụng để khuếch đại vùng gen quan tâm phản ứng PCR Mục tiêu đề tài: - Xác định đặc điểm cấu trúc phân tử gen LMP-1 số chủng EBV phân lập từ BN UTVH Việt Nam - Phân tích liên quan bệnh lý gen mã hóa LMP-1 protein với q trình methyl hóa gen RASSF1A BN ung thư vòm mũi họng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Tách chiết 15 mẫu ADN từ mô sinh thiết khối u BN UTVH ký hiệu: H2, S9, S18, H9, S1, B1, B2, B7, B9, B10, B12, E61, H14, M12, M14 chẩn đoán xác định dựa vào triệu chứng lâm sàng kết giải phẫu bệnh lý Bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương Phƣơng pháp nghiên cứu * Biến đổi bisulfite: ADN tổng số sau từ tách chiết từ 15 mẫu bệnh phẩm chia làm phần: phần dùng làm khuôn để chạy phản ứng PCR gen LMP-1, phần lại TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 xử lý với bisulfite tinh Epitect Kit (Qiagen, Cat No 59104) * Thực phản ứng PCR gen LMP-1 MSP để khảo sát q trình methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A: Tiến hành phản ứng PCR 15 mẫu cho cặp mồi LMP1-F LMP1-R Sản phẩm thu mẫu S1, S9, S18, H2, H9 sử dụng cho giải trình tự 15 mẫu ADN sau xử lý bisulfite, tiến hành phản ứng MSP với mồi điều kiện sau: Bảng 1: Trình tự nucleotid cặp mồi cho phản ứng PCR MSP TÊN MỒI TRÌNH TỰ NUCLEOTID (5 phút > phút) ĐIỀU KIỆN PCR LMP1-F ATGGAACGCGACCTTGAGAG LMP1-R TTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAAC GL-F CAACTTCATCCACGTTCACC GL-R GAAGAGCCAAGGACAGGTAC RASSF1A-M210-F GGGTTTTGCGAGAGCGCG RASSF1A-M211-R GCTAACAAACGCGAACCG RASSF1A-Un-F1 GGGGTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG RASF1A-Un-R1 TAAACACTAACAAACACAAACC RASSF1A-Un-F2 GAGAGTGTGTTTAGTTTTGTTTTTG RASF1A-Un-R2 CCACAAAACAAACCCCAACTTCAA 94oC phút, 35 chu kỳ gồm bước: 94oC phút, 55oC phút, 72oC phút, 72oC 10 phút 94oC phút, 40 chu kỳ gồm bước: 94oC 30 giây, 57oC 30 giây, 72oC 30 giây, 72oC phút 94oC phút, 40 chu kỳ gồm bước: 94oC 30 giây, 63oC 30 giây, 72oC 30 giây, 72oC phút 940C phút, 40 chu kỳ gồm bước: 940C 30 phút, 630C 20 phút, 720C 30 phút, 720C phút 94oC phút, 40 chu kỳ gồm bước: 94oC 30 giây, 60oC 30 giây, 72oC 30 giây, 72oC phút (* Dòng hố sản phẩm, tách dòng giải trình trình tự): Sản phẩm PCR đoạn gen LMP-1 mẫu S1, S9, S18, H2, H9 sau tinh sạch, dòng hố vào plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen Inc.) Chọn lọc tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp theo quy trình hãng Bioneer (Hàn Quốc) Trình tự nucleotid ADN plasmid tái tổ hợp mang khung gen LMP-1 giải trình máy tự động ABI-3100 Genetic Analyzer Xử lý chuỗi nucleotid chương trình SeqEd1.03, AssemblyLIGN1.9, MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) so sánh đối chiếu chương trình GENEDOC 2.6.002 (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết phân tích đặt điểm gen LMP-1 Để phát gen LMP-1 15 mẫu bệnh phẩm, sử dụng cặp mồi đặc hiệu LMP1-F/LMP1-R Kết điện di cho 12 mẫu dương tính (H2, S9, S18, H9, S1, B1, B2, B7, E61, H14, M12, M14) mẫu âm tính (B9, B10, B12) với tỷ lệ dương tính 80% (12/15 BN) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 1100 bp Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen LMP-1 với cặp mồi LMP1-F/LMP1-R 15 mẫu M: thị phân tử ADN (ở sử dụng hệ gen Lamda cắt enzym giới hạn HindIII); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương: H2, S9, S18, H9,S1, B1, B2, B7, B9, B10, B12, E61, H14, M12, M14: sản phẩm chạy PCR 15 mẫu BN tương ứng Toàn chuỗi nucleotid đoạn ADN thu nhận từ mẫu H2, S9, S18, H9,S1 giải trình máy tự động ABI-3100 Genetic Analyzer Hình 2, so sánh trình tự nucleotid axít amin ARN thơng tin gen LMP-1 chuỗi H2, S9, S18, H9, S1 Ngoài thay đổi nucleotid axít amin mang tính chất sai khác điểm (point-mutation), hai vùng có sai khác thêm vào - bớt chuỗi: vùng thứ (nt.861-959) 33 nucleotid (nt.861-893) chuỗi S1 mã hoá cho 11 axít amin (QDPDNTDDNGP), đồng thời thêm vào 66 nucleotid (nt.894-959) chuỗi H2 mã hố cho 23 axít amin (QDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGPH); vùng thứ hai (nt.1087-1116) thêm vào 30 nucleotid (nt.1087-1116) chuỗi S18 mã hố cho 10 axít amin (HSHDSGNGGG) Hình 2: So sánh trình tự nucleotid đoạn gen LMP-1 (800-1302) chuỗi H2, S9, S18, H9 S1 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Hình 3: So sánh trình tự axít amin mã hóa gen LMP-1 chuỗi H2, S9, S18, H9 S1 Như vậy, đột biến đoạn chuỗi S1 (nt.861-893), thêm đoạn chuỗi H2 (nt 894-959) S18 (nt.1087-1116) dẫn đến thay đổi lớn cấu trúc đầu C tận protein LMP-1 sản phẩm gen mã hóa Vùng có vai trò quan trọng chế gây UTVH EBV nói chung gen LMP-1 nói riêng [6] Một số nghiên cứu chứng minh vai trò LMP1 việc ức chế biểu gen RASSF1A gen ức chế ung thư có vai trò quan trọng việc phát triển tế bào ung thư [9] Kết khảo sát trình methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A mẫu UTVH H2 (+) T B S9 T S18 B T B H9 T B S1 T B (-) Hình 4: Sản phẩm PCR với cặp mồi GL-F/GL-R nhân gen β-globin từ khuôn ADN trước (T) sau xử lý với bisulfite (B) mẫu H2, S9, S18, H9, S1 Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% L1: Thang chuẩn ADN 100 bp; (-): Đối chứng âm (khơng có ADN khn); (+): Đối chứng dương (có ADN gen β-globin) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Hình 5: Sản phẩm PCR với cặp mồi GL-F/GL-R nhân gen β-globin từ khuôn ADN trước (A) sau xử lý với bisulfite (B) 10 mẫu: B1, B2, B7, B9, B10, B12, E61, H14, M12, M14 Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1.5% (A) điện di gel acrylamide 8% (B); M: Thang chuẩn ADN SY-60 bp; (-): Đối chứng âm (khơng có ADN khn); (+): Đối chứng dương (có khn plasmid mang đoạn gen β-globin) Kết cho thấy ADN trước xử lý cho phép nhân băng ADN đặc hiệu cho gen đơn β-globin Các mẫu sau xử lý không phát băng cho thấy hầu hết ADN tổng số xử lý hoàn toàn với bisulfite - H2 S9 S18 H9 S1 M ** M M _ B1 B2 _ B7 B9 B10 B12 E61 H14 M12 M14 M 169 bp Hình 6: Sản phẩm MSP nhân promoter gen RASF1A từ khuôn ADN bị xử lý với bisulfite 15 mẫu UTVH với cặp mồi methyl RASSF1A-M210-F/RASSF1A-M211-R Sản phẩm PCR điện di gel acrylamide 12% M: Thang chuẩn ADN SY-100 bp; (-): Đối chứng âm (khơng có ADN khn) Kết cho thấy: mẫu S9, B2 M14 khơng bị methyl hóa, 12 mẫu lại có methyl promoter gen RASSF1A Như vậy, tỷ lệ methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A 15 mẫu bệnh phẩm UTVH 80%, cao so với số cơng trình nghiên cứu khác giới (từ 50 - 70%) [3] promoter gen RASSF1A số 15 Mặc dù chưa có tương thích tuyệt đối 15 mẫu nghiên cứu cao (80%), cho kết chạy PCR gen LMP-1 thấy liên quan q trình methyl hóa đảo CpG thuộc vùng chế bệnh sinh UTVH EBV gây mẫu bệnh phẩm UTVH (3 mẫu LMP-1 âm tính B9, B10, B12 cho kết methyl hóa dương tính ngược lại, mẫu LMP-1 dương tính S9, B2 M14 cho kết methyl hóa âm tính), tỷ lệ dương tính với LMP-1 tỷ lệ methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 nên số nghiên cứu cơng bố [9] Mặt khác, vai trò LMP-1 gây methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A phụ thuộc vào cấu trúc protein LMP-1 liên quan đến đột biến thêm đoạn chuỗi H2 (nt 894-959), S18 (nt.1087-1116) dẫn đến thêm đoạn axít amin tương ứng 23 axít amin (QDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGPH) 10 axít amin (HSHDSGNGGG) Kết nghiên cứu methyl hóa gen [6] đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A cho thấy: số 15 mẫu bệnh phẩm UTVH, 12 mẫu dương tính (80%), tỷ lệ cao tương đương với tỷ lệ dương tính gen LMP-1 mẫu sinh thiết UTVH 80% (12/15 BN) Khi so sánh Hình 7: Sản phẩm nested-MSP nhân promoter gen RASF1A từ khuôn ADN bị xử lý với bisulfite mẫu UTVH với cặp mồi unmethyl Sản phẩm PCR với cặp mồi RASSF1A-Un-F1/RASSF1A-Un-R1.được dùng làm khuôn với cặp mồi RASSF1A-UnF2/RASSF1A-Un-R2 điện di gel acrylamide 12% M: Thang chuẩn ADN 100 bp; (-): Đối chứng âm (khơng có ADN khn) Kết cho thấy tất 15 mẫu có băng đặc hiệu cho ADN khơng bị methyl hóa Đây sản phẩm đặc trưng cho tế bào lành lẫn mẫu ung thư Chứng tỏ ADN xử lý bisulfite tốt cặp mồi thiết kế đặc hiệu xác vùng promoter RASSF1A tỷ lệ với số cơng trình nghiên cứu khác giới, chúng tơi nhận thấy tỷ lệ methyl hóa nghiên cứu cao [3] TÀI LIỆU THAM KHẢO Agathanggelou A, Wendy N, Farida L Role of the Ras-association domain family tumor suppressor gene in ®uman cancers Cancer Res 2005, 65, pp.3497-3508 Brooks J, Cairns C, Zeleniuch J Promoter methylation, the detection of breast cancer Cancer Causes Control 2009, 20 (9), pp.1539-1550 Challouf S, Ziadi S, Zaghdoudi R, Ksiaa F, Ben Gacem R, Trimeche M Patterns of aberrant DNA hypermethylation in nasopharyngeal carcinoma in Tunisian patients Clin Chim Acta 2012, Apr, 413 (7-8), pp.795-802 KẾT LUẬN Gen LMP-1 chuỗi H2, S9, S18, H9, S1 dòng hóa giải trình tự gen, qua phân tích kết cho thấy gen LMP-1 tồn đột biến điểm thường gặp, có đột biến đoạn nucleotid (nt.861-893) chuỗi S1 dẫn đến 11 axít amin (QDPDNTDDNGP) Donninger H, Vor MD, Clark GJ The RASSF1A tumor suppressor Journal of Cell Science 2007, 120, pp.3163-3172 Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands Proc Natl Acad Sci U S A 1996, Sep, 93 (18), pp.9821-9826 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Kaye KM, Izumi KM, Kieff E Epstein-Barr virus latent membrane protein is essential for B lymphocyte growth transformation Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90, pp.9150-9154 Kilger E, Kieser A, Baumann M, Hammerschmidt W Epstein-Barr virus-mediated B-cell proliferation is dependent upon latent Man C, Rosa J, Lee LT, Lee VH, Chow BK, Lo KW, Doxsey S, Wu ZG, Kwong YL, Jin DY, Cheung AL, Tsao SW Latent membrane protein suppresses RASSF1A expression, disrupts microtubule structures and induces chromosomal aberrations in human epithelial cells Oncogene 2007, May, 26 (21), pp.3069-3080 membrane protein 1, which stimulates an activated CD40 receptor EMBO J 1998, 17, silencing in cancer initiation, progression Cancer pp.1700-1709 Letters 2002, 190, pp.125-133 10 Nephew KP, Huang TM Epigenetic gene Lo KW, Chung GT, To KF Deciphering the molecular genetic basis of NPC through molecular, cytogenetic and epigenetic approaches Semin Cancer Biol 2012, Apr, 22 (2), pp.79-86 Ngày nhận bài: 26/10/2012 Ngày giao phản biện: 5/1/2013 Ngày giao thảo in: 6/2/2013 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 ... phân tử gen LMP-1 số chủng EBV phân lập từ BN UTVH Việt Nam - Phân tích liên quan bệnh lý gen mã hóa LMP-1 protein với q trình methyl hóa gen RASSF1A BN ung thư vòm mũi họng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG... thấy: mẫu S9, B2 M14 không bị methyl hóa, 12 mẫu lại có methyl promoter gen RASSF1A Như vậy, tỷ lệ methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A 15 mẫu bệnh phẩm UTVH 80%, cao so với số cơng... LMP-1 sản phẩm gen mã hóa Vùng có vai trò quan trọng chế gây UTVH EBV nói chung gen LMP-1 nói riêng [6] Một số nghiên cứu chứng minh vai trò LMP1 việc ức chế biểu gen RASSF1A gen ức chế ung thư