Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rps16 ở một số mẫu giống nghệ (curcuma longa l ) có hàm lượng curcuminoids khác nhau

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HÀ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH GEN rps16 Ở MỘT SỐ MẪU GIỐNG NGHỆ (Curcuma longa L.) CÓ HÀM LƢỢNG CURCUMINOIDS KHÁC NHAU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học Giảng viên hƣớng dẫn : Chính qui : Công nghệ sinh học : CNSH&CNTP : 2011 - 2015 : TS Nguyễn Văn Khiêm TS Nguyễn Văn Duy Thái Nguyên, năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Để đạt kết ngày hôm nay, em nhận nhiều giúp đỡ, hướng dẫn tận tình thầy, cô giáo, bạn bè gia đình Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm toàn thể thầy, cô giáo truyền đạt cho em kiến thức, kĩ quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy TS Nguyễn Văn Duy TS Nguyễn Văn Khiêm tận tình hướng dẫn em suốt trình làm Khóa luận Em xin cảm ơn anh chị Bộ môn Giống Công Nghệ Sinh Học - Trung tâm Nghiên cứu Trồng Chế biến thuốc Hà Nội - Viện Dược Liệu, Ban giám đốc Trung tâm, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trình làm khoá luận Em trân trọng cảm ơn TS Phương Thiện Thương - Trưởng khoa Hóa phân tích tiêu chuẩn - Viện Dược Liệu giúp đỡ em trình phân tích mẫu nghệ Khoa Và cuối cùng, với tất lòng kính trọng biết ơn vô hạn, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, Anh, Chị người thân nuôi nấng, động viên tạo động lực cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin trân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng 06 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hà ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Xuất Nghệ Ấn Độ từ năm 1994 -1996 16 Bảng 3.1: Danh sách mẫu giống Nghệ nguồn gốc thu thập 22 Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 3.3: Thành phần cho phản ứng PCR 29 Bảng 4.1: Sự phụ thuộc giá trị mật độ quang vào nồng độ Curcumin 31 Bảng 4.2: Kết phân tích hàm lượng Curcumin tổng số mẫu 32 Bảng 4.3: Hàm lượng DNA tổng số mẫu củ Nghệ 34 Bảng 4.4: Kết khác biệt trình tự gen rps16 36 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Hình thái cây, lá, hoa (a,b), củ Nghệ (c) Hình 2.2: Công thức cấu tạo Curcumin Hình 2.3: Công thức tạo dạng keto Curcumin Hình 2.4: Công thức tạo dạng enol Curcumin Hình 2.5: Cấu trúc hóa học hợp chất tinh dầu Nghệ Hình 2.6: Cấu trúc hóa học Curcumin 11 Hình 2.7: Cấu trúc hóa học đồng phân hình học Curcumin I: s-cisdiketone (1), s-trans-diketone (2), enol (3) 12 Hình 2.8: Liên kết hydro nội phân tử hydrogen nhóm phenol với ortho methoxyl 15 Hình 4.1: Phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng Curcumin 31 Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm tách chiết DNA tổng số mẫu nghệ 33 Hình 4.3: Kết điện di sản phẩm PCR mẫu Nghệ 35 Hình 4.4: Kết tinh sản phẩm PCR mẫu Nghệ 35 Hình 4.5: Kết so sánh trình tự gene rps16 19 mẫu Nghệ phần mềm ClustalW2 37 Hình 4.6: Trình tự gen rps16 mẫu giống Nghệ C4 C18 máy đọc trình tự (A): mẫu giống C4, (B): mẫu giống C18 38 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp base pair (cặp bazơ) Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylene diamine tetra acetate Kb Kilobase NST Nhiễm sắc thể PCR polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại gen) OD Optical density (Mật độ quang) Na2EDTA Ethylene diamine tetra acetate sodium TE Tris EDTA TAE Tris Acetate EDTA µl Micro litre µg Micro gram µM Micro Mole mM Mili Mole RNA ribonucleic acid RE Restriction enzyme (Enzym giới hạn) v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Nghệ (Curcuma longa L.) 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.2 nguồn gốc thực vật Nghệ vàng (Curcuma longa L.) 2.1.3 Thành phần hóa học Nghệ vàng 2.2 Tổng quan Curcuminoids .11 2.2.1 Thành phần dạng đồng phân .11 2.2.2 Tác dụng sinh học Curcumin 12 2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất nghệ vàng giới Việt Nam 16 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới .16 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 19 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 22 3.1.1 Đối tượng .22 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 23 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 23 3.3 Nội dung nghiên cứu 23 3.4 Hóa chất thiết bị 23 vi 3.4.1 Hóa chất 23 3.4.2 Thiết bị 24 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 3.5.1 Phương pháp xác định hàm lượng Curcuminoids củ nghệ 25 3.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 26 3.5.3 Phương pháp PCR 28 3.5.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR .29 3.5.5 Phân tích gen rps16 30 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết xác định hàm lượng Curcumin củ nghệ .31 4.1.1 Xây dựng đồ thị chuẩn xác định hàm lượng Curcumin 31 4.1.2 Xác định hàm lượng Curcumin mẫu nghệ .32 4.2 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu 32 4.3 Kết phân lập gene rps16 PCR 35 4.4 Kết tinh sản phẩm PCR 35 4.5 Giải trình tự phân tích gen rps16 36 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 5.1 Kết luận .39 5.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: II Tài liệu tiếng Anh: PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam quốc gia nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, có nguồn tài nguyên động thực vật đa dạng, phong phú, có nhiều loài cỏ tổ tiên sử dụng làm thức ăn làm thuốc Cho tới có khoảng 12000 loài thực vật phát hiện, loài sử dụng làm thuốc chiếm 26-30% [5] Từ chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc thiên nhiên, người ta tìm cách biến đổi cấu trúc hóa học chúng thành chất có hoạt tính sinh học cao hơn, ưu việt loại thuốc sản xuất hoàn toàn đường tổng hợp Vì vậy, việc nghiên cứu hợp chất tự nhiên quan trọng đánh giá tài nguyên thiên nhiên nhằm sử dụng chúng cách hiệu Cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Nghệ có nguồn gốc nguyên thủy từ Ấn Độ, ưa vùng khí hậu nhiệt đới nên vùng tập trung trồng Nghệ chủ yếu số nước châu Á như: Ấn Độ Trung Quốc, Myanma, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam Ở Việt Nam Nghệ trồng khắp nơi [5] Thân rễ Nghệ có độc tính thấp, tác dụng gây đột biến ung thư Nghệ vàng loài cỏ có nhiều tác dụng, không loại gia vị quen thuộc bữa ăn hàng ngày gia đình mà vị thuốc chữa nhiều loại bệnh khác như: Được sử dụng chữa đái máu, phụ nữ bị u uất sinh điên, chữa trị lở, sưng đau, chữa dày, tá tràng viêm loét, ung nhọt, ghẻ lở, phong thấp, tay chân đau nhức, vàng da, chữa viêm gan, suy gan, vàng da virus, thổ huyết máu cam Tinh dầu Nghệ có tác dụng sát khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm cấp tính mãn tính, liền vết thương Tác dụng bảo vệ tế bào gan hợp chất Curcumin có củ Nghệ [2] Ở nước ta có số đề tài nghiên cứu triển khai thu thập bảo tồn mẫu giống Nghệ, chọn giống Nghệ cho suất chất lượng cao sở mẫu giống trồng tỉnh khác Tuy nhiên, chưa có giống Nghệ cấp có thẩm quyền công nhận giống Trong sản xuất khó nhận biết giống Nghệ có chứa hàm lượng Curcumin cao giống đặc điểm hình thái Mặt khác, suất, chất lượng củ Nghệ lại phụ thuộc chủ yếu vào giống, giai đoạn sinh trưởng phát triển Điều đặt nhu cầu nghiên cứu nhận biết giống Nghệ có mức hàm lượng Curcumin khác thị phân tử DNA [12] Các nghiên cứu cho thấy hàm lượng Curcumin có thay đổi khác giống Nghệ Có nhiều yếu tố liên quan đến tổng hợp trao đổi hàm lượng Curcumin gen nằm nhân lục lạp Trong nghiên cứu này, thực đề tài nhằm mục đích phân lập, giải trình tự phân tích gen rps16 nằm DNA lục lạp số mẫu giống Nghệ (Curcuna longa L.) có hàm lượng Curcumin tổng số khác thu thập Việt Nam Để thực đề tài xác định hàm lượng Curcumin giống sử dụng phương pháp PCR để phân lập gen, sau giải trình tự gen, phân tích gen để tìm thị đặc trưng cho mẫu Nghệ có hàm lượng khác Để góp phần vào việc nghiên cứu cách sâu rộng loài Nghệ nước, từ ứng dụng loại Nghệ vàng cách khoa học, có hiệu quả, đem lại lợi ích kinh tế góp phần vào công trình nghiên cứu nhằm lựa chọn vùng sinh thái cho sản phẩm tốt Do đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phân lập, giải trình tự phân tích gen rps16 số mẫu giống Nghệ (Curcuma longa L.) có hàm lượng Curcuminoids khác nhau” 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu Nghiên cứu phân lập được, giải trình tự phân tích gen rps16 số mẫu giống Nghệ (Curcuna longa L.) có hàm lượng Curcumin tổng số khác thu thập Việt Nam 1.2.2 Yêu cầu - Thu thập mẫu giống Nghệ phân tích hàm lượng Curcuminoids mẫu giống Nghệ - Nghiên cứu phân lập được, giải trình tự phân tích gen rps16 số mẫu giống Nghệ - Xác định thị phân tử gen rps16 nhận dạng mẫu giống có hàm lượng Curcuminoids khác 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài cung cấp thông tin trình tự gen rps16 lục lạp có sở xác định thị phân tử liên quan đến hàm lượng Curcuminoids giống Nghệ khác Việt Nam Trên sở thông tin nhà chọn giống Nghệ sử dụng để sàng lọc giống Nghệ có hoạt chất cao cho sản xuất 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Ý nghĩa thực tiễn: Chỉ thị phân tử gen rps16 áp dụng vào xác định nhanh giống Nghệ có hàm lượng Curcuminoids cao Giúp sinh viên củng cố hệ thống lại kiến thức học bổ sung vào kiến thức lý thuyết học thông qua hoạt động thực tiễn Giúp cho sinh viên nâng cao kiến thức, kỹ thực hành thu nhận kinh nghiệm thực tế tác phong làm việc khoa học phục vụ cho công tác nghiên cứu sau 37 Hình 4.5: Kết so sánh trình tự gene rps16 19 mẫu Nghệ phần mềm ClustalW2 Kết giải trình tự gene rps16 19 mẫu giống (C1-C19) cho thấy gene có độ dài khoảng 270-271 bp tương tự kích thước gene mẫu Nghệ có nguồn gốc từ Indonesia công bố Hayakawa đồng tác [21] Một đoạn trình tự gene máy đọc trình tự mẫu giống C4 38 (hàm lượng Curcuminoids (0,34%) C18 (6,56%) thể Hình 4.5 Trình tự gene mẫu giống thể Hình 4.6 (A) (B) Hình 4.6: Trình tự gen rps16 mẫu giống Nghệ C4 C18 máy đọc trình tự (A): mẫu giống C4, (B): mẫu giống C18 Trình tự gen rps16 mẫu giống Nghệ C3, C4, C5, C6, C7, C10 (có hàm lượng Curcumin thấp) có độ dài 270 bp Trong mẫu giống Nghệ C1, C2, C8, C9, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 (có hàm lượng Curcumin cao) có độ dài 271 bp Trên sở trình tự gen rps16 mẫu, nhận biết thị đặc trưng gen rps16 mẫu Nghệ có hàm lượng khác Mẫu giống có hàm lượng Curcumin thấp có thị đặc trưng AAAA Trong mẫu giống (hàm lượng Curcumin cao) có thị đặc trưng AAAAA Kết nghiên cứu cho thấy có số sai khác so với nghiên cứu Hayakawa đồng tác giả công bố gen rps16 mẫu giống Nghệ có hàm lượng Curcumin cao có nguồn gốc Indonesia dài 273 bp, với thị đặc trưng AAAAAAA [20] 39 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ nghiên cứu rút kết luận sau: Đã thu thập xác định hàm lượng Curcumin 19 mẫu củ Nghệ Kết qủa phân tích cho thấy 19 mẫu giống phân thành nhóm: nhóm I gồm giống có hàm lượng thấp (0,25- 0,62%): C3, C4, C5, C6, C7, C10; nhóm II gồm giống có hàm lượng cao (1,80- 8,26%): C1, C2, C8, C9, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17,C18 C19 Đã tách chiết DNA tổng số 19 mẫu Đã phân lập, giải trình tự phân tích gen rps16 từ 19 mẫu nghệ Đã xác định thị DNA đặc trưng gen rps16 cho mẫu giống Nghệ có hàm lượng Curcuminoids thấp AAAA, giống có hàm lượng cao AAAAA Gen rps16 có độ dài 270-271 bp 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục phát triển phương pháp thị phân tử để chọn lọc mẫu giống Nghệ cho suất chất lượng cao phục vụ cho sản xuất - Ứng dụng nghiên cứu đối tượng dược liệu quý khác Việt Nam mục đích sử dụng dược liệu an toàn hiệu - Tiếp tục thu thập thêm mẫu Việt Nam để nghiên cứu vùng trình tự khác gen, lục lạp để thiết lập mối quan hệ di truyền loài Nghệ TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Bộ Y tế & Bộ Khoa học công nghệ (2009) Bảo tồn phát triển nguồn gen giống thuốc Hội nghị tổng kết 20 năm thực nhiệm vụ bảo tồn nguồn gen giống thuốc (1988 - 2008), Tam Đảo Bộ y tế (2002), Dược điển Việt Nam (lần thứ 3), NXB Y học, Hà Nội Báo Hưng Yên, Vùng Chuyên canh Nghệ vàng, 23/11/2009 Báo Thanh Hóa , Xây dựng vùng sản xuất Nghệ phục vụ công nghiệp Dược, 12/12/2008 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiếu, Vũ Ngọc Lộ, Phạn Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Viện Dược Liệu (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, I: 894-895 Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học 1997 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam QIII, NXB Trẻ (in lần thứ 2) Trần Thị Lan, Hoàng Thị Sáu (2008), Công trình nghiên cứu khoa học tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc 1998 - 2008, Viện Dược Liệu, Bộ y tế, trang 287 - 294 Đỗ tất lợi (2004) Những thuốc vị thuốc Việt Nam, trang 227- 230 Nxb Y học 10 Vũ Ngọc Lộ, Phạm Thị Ánh Tuyết (1997), “thành phần hóa học tác dụng dược lý loài chi Curcuma Việt Nam”, tạp chí Dược liệu, Hà Nội 11 Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, NXB KH $ KT II Tài liệu tiếng Anh 12 Aoi K., Kaburagi K., Seki T., Tobata T., Sarak M and Kuroyanagi M (1986) Studies on the cultivation of turmeric (Curcuma longa L.): Varietal differences in rhizome yield and Curcuminoid content, Bulletin of National Institute of Hygienic Sciences, (104): 124-128 13 Aggarwal S., Takada Y., Singh S., Myers J.N and Aggarwal B.B (2004) Inhibition of Growth and Survival of Human Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Cells by Cur- cumin via Modulation of Nuclear FactorΚb Signaling, International Journal of Cancer,111(5): 679-692 14 Apavatjrut P., Anuntalabhochai S., Sirirugsa P., Alisi C (1999) Molecular markers in the identification of some early flowering Curcuma (Zingiberaceae) species Ann Bot 84, 529-534 15 Bharat B.A., Kumar A., Manoj S.A and Shishir S (2005) Curcumin Derived from Turmeric (Curcuma longa): a Spice for All Seasons, Phytopharmaceuticals in Cancer Chemopreventions, 350- 387 16 Chearwae W., Anuchapreedac S., Nandigama K., Ambudkar S.V and Limtrakul P.N (2004) Biochemical mechanism of modulation of human P-glycoprotein (ABCB1) by Curcumin I, II and III purified from Turmeric powder, Biochemical Pharmacology 17 Chen W.F., Deng S.L., Zhou B., Zang L., Liu Z.L (2005) Curcumin and its analogues as potent inhibitors of low density lipoprotein oxidation: Hatom abstraction from the phenolic groups and possible involvement of the 4-hydroxy-3 methoxyphenyl groups, National Laboratory of Applied Organic Chemistry, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 18 Coyne J.A and Orr H.A (2004) Patterns of Speciation in Drosophila,” Evolution, Vol 43, (2): 362-381 19 Doyle JJ and Doyle J.L (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochemical Bulletin 19: 11-15 20 Hayakawa H., Kobayashi T., Minamiya Y., Ito K., Miyazaki A., Fukuda T., Yamamoto (2010) Molercular Indentification of Turmeric ( Curcuma longa, Zingiberaceae) with High Curcumin Content, Journal of Janpanese Botany, 85(5):263-269 21 Hayakawa H., Kobayashi T., Minaniya Y., Ito K , Miyazaki A., Fukuda T and Yamamoto Y (2011a), Development of a molecular marker to identify a candidate line of turmeric (Curcuma longa L.) with a high Curcumin content American Journal of Plant Sciences, (2): 15-26 22 Hayakawa H., Minaniya Y., Ito K., Yamamoto Y and Fukuda T (2011b) Difference of Curcumin content in Curcuma longa L (Zingiberaceae) caused by hybridization with other Curcuma species American Journal of Plant Sciences, (2): 111-119 23 Hergenhahn M., Soto U., Weninger A., Polack A., Hsu C H., Cheng, A.L and Rosl F., The chemopreventive compoud Curcumin is an efficient inhibitor of Epstein-Barr virus BL2F1 transcription in Raji DRLUC cells Mol Carcinogen., 2002, 33, 137-145 24 Heubl G (2010) New Aspects of DNA-based Authentication of Chinese Medicinal Plants by Molecular Biological Techniques, Planta Med 76: 1963-1974 25 Jayaprakasha G.K, Negi P.S., Anadharamakrishman C and Sakariah K.K (2001) Chemical composition of tumeric oil a hyproduct for from tumeric oleorsin inductry and Its inhibitory activity against different fungi Z Natuforsch., 56: 40-44 26 Kapoor L.D (1990) Handbook of Ayurvedic Medicinal Plants, CRC Press, Boca Raton, Florida, 185 27 Kalpana J., Warude P.C and Bhushan P (2004) Molecular markers in herbal drug technology Current Science, 87(2): 159-165 28 Lin J.K., Lin-Shia S.Y (2001) Mechanisms of cancer chemoprevention by Curcumin, Proc Natl Sci Counc Repub China B (25):59-66 29 Mahady G.B., Pendland S.L., Yun G And Lu Z.Z (2002) Tumeric (Curcuma longa L.) and Curcumin inhibit the growth of Helico-bacter pylori, of group carcinogen Anticancer Res.,( 22): 4179-4181 30 Masuda T., Maekawa T., Hidaka K., Bando H., Takeda Y and Yamagaguchi H (2001) Chemical studies on antioxidant mechanisms of Curcumin: analysis of oxidative coupling products from Curcumin nad linoleate, J.Agic Food Chem.(49), 2539-2547 31 Minami M., Nishio K., Ajioka Y., Kyushima H., Shigeki K., Kinjo K., Yamada K., Nagai M., Satoh K and Sakurai Y (2009) Identification of Curcuma plants and Curcumin content level by DNA Polymorphisms in the trnS-trnfM intergenic Spacer in Chloroplast DNA, Journal of Natural Medicines, 63, (1):75-79 32 Ravindran P.N., Babu K.N and Sivaranan K (2007) Turmeric: The Genus Curcuma Medicinal and Aromatic Plants Industrial Profles CRC Press, Boca Raton 33 Roughley P.J and Whiting D.A (1973) Experiments in the biosynthesis of Curcumin J Chem Soc., (20): 2379-2388 34 Ruby A.J., Kuttan G., Dinesh Babu K., Rajasekharan K.N and Kuttan R (1995) Antitumor and antioxidant activity of natural Curcuminoids Cancer Lett.,( 94), 79-83 35 Sasaki Y., Fushimi H., Cao H., Cai S.Q and Komatsu K (2002) Sequence Analysis of Chinese and Japanese Curcuma Drugs on the 18S rRNA Gene and trnK Gene and the Application of Amplification- Refractory Mutation System Analysis for Their Authentication Biological & Pharmaceutical Bulletin, 25, (12):1593-1599 36 Shen L and Ji H.F (2007), Theoretical study on physicochemical properties of Curcumin, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spetroscopy, (67): 619-623 37 Sigrist M.S., Pinheiro J.B., Filho J.A and Zucchi M.I (2011) Genetic diversity of turmeric germplasm (Curcuma longa; Zingiberaceae) identifed by microsatellite markers Genetics and Molecular Research, 10 (1): 419-428 38 Srivatsava S and Nidhi M (2009) Genetic Markers - A Cutting Edge Technology in Herbal Drug Research Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 1(1): 1-18 39 Tharachand C., Immanuel S.C and Mythili M.N (2012) Molecular markers in characterization of medicinal plants: An overview Research in Plant Biology, 2(2): 01-12 PHỤ LỤC Kết giải trình tự gen rps16 Trình tự gen rps16 (mẫu giống C1) >1849327_Rps16_1 Rps16_F_ CCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACTC GAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTCT GACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCTA ACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTC TTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATC TTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C2) >1849328_Rps16_2 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCAAACTCAAGTTGGGTAATTCT GACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCTA ACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTC TTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATC TTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C3) >1849329_Rps16_3 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTCT GACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCTA ACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTC TTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATC TTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C4) >1849330_Rps16_4 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTCT GACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCTA ACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTC TTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATC TTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C5) >1849331_Rps16_5 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTCT GACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCTA ACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTC TTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATC TTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C6) >1849332_Rps16_6 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTCT GACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCTA ACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTC TTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATC TTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C7) >1849333_Rps16_7 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTCT GACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCTA ACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTC TTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATC TTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C8) >1849334_Rps16_8 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTC TGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCT AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTT CTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTAT CTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C9) >1849335_Rps16_9 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTC TGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCT AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTT CTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTAT CTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C10) >1849336_Rps16_10 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGCGTCGAACT CGAGAAAATTTTTCATTCTTACTCTTAACTCAAGTTGGGTAATTCT GACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCTA ACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTC TTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATC TTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C11) >1849337_Rps16_11 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTC TGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCT AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTT CTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTAT CTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C12) >1849338_Rps16_12 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTC TGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCT AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTT CTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTAT CTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C13) >1849339_Rps16_13 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTC TGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCT AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTT CTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTAT CTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C14) >1849340_Rps16_14 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTC TGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCT AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTT CTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTAT CTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C15) >1849341_Rps16_15 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTC TGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCT AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTT CTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTAT CTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C16) >1849342_Rps16_16 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATT CTGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTC TAACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTT TCTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTA TCTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C17) >1849343_Rps16_17 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTC TGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCT AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTT CTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTAT CTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C18) >1849344_Rps16_18 Rps16_F_ (4-5A) CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTC TGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCT AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTT CTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTAT CTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 (mẫu giống C19) >1849345_Rps16_19 Rps16_F_ CCCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACT CGAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTC TGACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCT AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTT CTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTAT CTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA Trình tự gen rps16 19 mẫu giống nghệ C1- C19 Vị trí đậm, béo trình tự sử dụng làm thị đặc trưng Xác nhận giáo viên hướng dẫn Thái Nguyên, ngày tháng 06 năm 2015 Giáo viên hƣớng dẫn TS Nguyễn Văn Khiêm Giáo viên hƣớng dẫn TS Nguyễn Văn Duy