Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rps16 ở một số mẫu giống Nghệ (Curcuma longa L.) có hàm lượng Curcuminoids khác nhau (Khóa luận tốt nghiệp)

Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rps16 ở một số mẫu giống Nghệ (Curcuma longa L.) có hàm lượng Curcuminoids khác nhau (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rps16 ở một số mẫu giống Nghệ (Curcuma longa L.) có hàm lượng Curcuminoids khác nhau (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rps16 ở một số mẫu giống Nghệ (Curcuma longa L.) có hàm lượng Curcuminoids khác nhau (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rps16 ở một số mẫu giống Nghệ (Curcuma longa L.) có hàm lượng Curcuminoids khác nhau (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rps16 ở một số mẫu giống Nghệ (Curcuma longa L.) có hàm lượng Curcuminoids khác nhau (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rps16 ở một số mẫu giống Nghệ (Curcuma longa L.) có hàm lượng Curcuminoids khác nhau (Khóa luận tốt nghiệp)

L I C

ng d n t n tình c a các th y, cô giáo, b

c h t em xin g i l i c i Ban giám hi ng

i h c Nông lâm Thái Nguyên, Ban ch nhi m khoa Công ngh sinh h c và Công ngh th c ph m cùng toàn th các th t cho em

nh ng ki n th t th i gian h c t p và rèn luy n t i

i h c Nông lâm Thái Nguyên

Em xin bày t lòng bi c n th y TS Nguy

TS Nguy ng d n em trong su t quá trình làm Khóa lu n

c c B môn Gi ng và Công Ngh Sinh

H c - Trung tâm Nghiên c u Tr ng và Ch bi n cây thu c Hà N i - Vi n

DANH M C B NG

X -1996 16

22

T 24

29

31

32

34

K 36

DANH M C HÌNH

5

8

8

8

9

11

-cis-diketone (1), s-trans cis-diketone (2), và enol (3) 12

ortho methoxyl 15

ng chu ng Curcumin 31

Hình 4.2: K t qu n di s n ph m tách chi t DNA t ng s các m u ngh 33

Hình 4.3: K t qu n di s n ph m PCR các m u Ngh 35

Hình 4.4: K t qu tinh s ch s n ph m PCR các m u Ngh 35

37

gen rps16 38

PCR polymerase chain reaction (ph n ng khu i gen)

OD Optical density (M quang)

Na2EDTA Ethylene diamine tetra acetate sodium

RNA ribonucleic acid

RE Restriction enzyme (Enzym gi i h n)

1

2

2

3

3

3

3

4

Curcuma longa L.) 4

4

5

7

Curcuminoids 11

11

12

2.3 T Nam 16

16

19

22

22

22

23

23

23

23

3.4.2 Thi 24

25

25

26

28

29

3.5.5 Phân tích gen rps16 30

PH N 4: K T QU VÀ TH O LU N 31

4.1 K t qu ng Curcumin trong c ngh 31

4.1.1 Xây d th chu ng Curcumin 31

ng Curcumin trong các m u ngh 32

4.2 K t qu tách chi t DNA t ng s t các m u nghiên c u 32

rps 35

4.4 K t qu tinh s ch s n ph m PCR 35

rps16 36

PH N 5: K T LU N VÀ KI N NGH 39

5.1 K t lu n 39

5.2 Ki n ngh 39

t

t

2.1. Curcuma longa L.)

2.1.2 hình thái

1 m vàT

-mang hoa

háng 3-5 [5] H

Hình 2.1

Hình 2.1: Hình thái cây, lá, hoa (a,b), ).

2.1.2.1 P

N urcuma domestica Val là N

hoàng; Turmeric; Sanfran des Inder;

Curcuma zendoaria (Berg) C

N

Curcuma thorelii Gagn là N ;

Curcuma piereama Gagn là N

Curcuma elata Rox l

Curcuma cochinchinesis Gagn là N

Curcuma alismataefolia Gagn là N

Curcuma angustifolia Roxb là N

Curcuma gracillima Gagn là N

rong t

(Curcuma), loài N Curcuma longa L.) [6].

N vàng

àng p

Idonesia, Malaysia,

, Yên MinhM

oC,dài N

staphylococ và vi trùng

NCurcumin

ân N

+ T

ngày, t

csCurcumin I

Mycobacterium, ngoài ra Curcumin I Salmonella paratyphi, Staphyllococus aureus Trychophyton gypcum.

Ngoài ra, N

-cis-diketone, s-trans-diketone và cis-cisenol Curcumin

-diketone, trans-diketone và enol (Hình 2.7) [16]

hydroxyl OH* c peroxyl ROO*, singlet oxygen, nitric oxide (NO) và peroxynitrite ONOO- Ngoài ra, Curcumin

Curcumin

Curcumin và bis demethoxyl Curcumin (Lin và cs 2001

Curcuminbenzo[a]pyrene (BAP) và 7,12 - dimethybenz[a]anthracene (DMBA) trên da

Curcumin

Curcumin CurcuminCurcumin

2O2

Curcumin[16]

CurcuminCurcumin (1 nhóm ortho methoxyl) và bis demethoxyl Curcumin (không có nhóm ortho methoxyl) (Hình 2.8).

Curcumin

ortho methoxyl

Curcumin

Aspergillus flavus, A parasiticus, Fusarium moniliforme và Penicillium digitatum,

Streptococus, Staphylococus, Lactobacillus, Helicobacter pulori

Theo Hergenhahn (2002), Curcumin

Curcumin

HIV-1 gây ra AIDS Theo Taher và cs (2000)

[27] C

[38]

[39]

Graham và cs 2010).

Curcumin cao, Hayakawa và cs (2011a) [21]

rps16 intron 2, petB intron 1, petB các loài trong chi Curcuma ài C longa

loài trong chi Curcuma

-999 và TNV-999- Curcumin

C

ty C

Curcumin

Curcumin

N

-4 sào N

ng khá N

[3]

P 3

ng nghiên c u là 19 m u gi ng Ngh vàng thu c loài Curcuma

-3.4.1.2

- Taq DNA polymerase (Biorad).

- Taq Buffer 10X (Biorad).

m c dung d ch g c có n chính xác kho ng 0,3 mg/ml T dung

d ch g c này, ti n hành pha loãng 4 l n, 5 l n, 10 l n, 20 l n, 50 l c các dung d ch có n khác nhau K t qu h p th ng v i

n ch t chu c s d xây d th chu n

Phân tích m u

C Ngh c r a s ch, thái thành lát nh , s y 50o n khô tuy i

c li u Ngh c xay nh , chuy n vào bình tam giác Thêm

50 ml c n tuy i, siêu âm trong 30 phút, sau c qua gi y l nh

m c 100 ml Thêm ti p 30 ml c n vào ph c li u, siêu âm ti p trong 15 phút, l c ti nh m c dung d ch m u th T dung

d ch này, hút chính xác 1ml chuy nh m c 100 ml, thêm c ng v a

t i v nh m c dung d ch m u th h p th quang, dung d ch này có n chính xác kho ng 0,1 mg/ml

h p th quang c a các m u chu n có n khác nhau

c sóng 430nm T các k t qu h p th quang (Abs) c, xây d ng

ng tuy n tính gi a n Curcumin và giá tr m quang (Abs).Ti p

t quang c a các m u th , t giá tr m i suy t

ng chu c n Curcumin có trong m u th

T ng (%) c a Curcumin có trong m u th

- Tính k t qu :

ng Curcumin c tính theo công th c:

C: N Curcumin có trong m u th t ng chu n (mg/ml)

C, 10.000 vòng/phút

.+

Isopropanol

o

.000 vòng/phút, Quá trình

+ DNA t ng s c hòa tan trong 50 µl H20 ho m TE

+ X lý b ng enzyme RNas lo i b h t RNA trong m u

- Ki m tra s n ph m DNA sau khi tách chiêt

+ chu n b gel agarose 0,8% (w/v): Cân 0,35 g agarose cho vào 50ml

c tr u v i loading buffer 6X vào t t c các

gi ng còn l i, ti n hành n di trên gel agarose 0,8%, v i hi n th 90V,

th i gian 30 phút trong dung d m TAE (1X) c nhu m trong Ethilium Bromide 4 µl (10 mg/ml) trong th i gian 30 phút,

c ki p nh b ng máy ch p và phân tích gel lo i Gel DocIt2c a Hãng UVP, Hoa K

rps16-F và rps16-R rps16 trong DNA nhân mã hóa cho

PCR (10X), Taq D F,

- n di s n ph m PCR:

S n ph n di trên gel agarose 0,8% hi n th 90V,

25 phút trong dung d m TAE (1X) c nhu m trong Ethidium Bromide 4 µl (10 mg/ml) trong th n

tích gel lo i Gel DocIt2c a Hãng UVP, Hoa K

®ExpinTM:

- (PCR binding buffer) vào 80

- Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 30 giây ly tâm

Ly tâm 10,000 vòng trong 30 giây

PH N 4

K T QU VÀ TH O LU N

B ng 4.1: S ph thu c c a giá tr m quang vào n Curcumin

4.2 K t qu tách chi t DNA t ng s t các m u nghiên c u

Sau khi chi t tách DNA t ng s a Doyle $ Doyle (1987) [19], ta ti n hành ki nguyên v n và tinh s ch c a DNA t ng

s c ph n ng PCR Hình 4.2 cho th ng s c a 19 m u Ngh

c chi t tách và x lý RNAse I

(a): M u Ngh C1-C10; (b): M u Ngh C11- C19

Ghi chú: Hình (a): gi ng 1-10 ng DNA t ng s c a các m u C1-N10.Hình (b): gi ng 11-19 ng DNA t ng s c a các m u C10-C19.Quan sát v n di (Hình 4.2) ta th y m u DNA sau khi chi t tách t các m u lá Ngh rõ nét, không b t gãy Các m u DNA

A260/A280 là ch s cho th nhi m c a các ch c protein

T l A260/A280 là 1,8 - tinh khi t theo tiêu chu n Qu c t

c tính theo công th c:

ph n ng PCR b ng tinh s ch s d ng kit GeneAll® ExpinTM K t qu tinh

s c ki m tra b n di trên gel agarose 0,8% (Hình 4.4)

Hình 4.4: K t qu tinh s ch s n ph m PCR các m u Ngh

Ghi chú: M: DNA marker, gi ng 1-19: s n ph c tinh s ch

Hình 4.5:

-[21]

- Ti p t c thu th p thêm các m u m i Vi nghiên c u các vùng trình t khác nhau trên gen, trên l c l thi t l p m i quan h di truy n gi a các loài Ngh

I

2

8

- 2008, trang 287 - 294

10

12 Aoi K., Kaburagi K., Seki T., Tobata T., Sarak M and Kuroyanagi M

(1986) Studies on the cultivation of turmeric (Curcuma longa L.): Varietal differences in rhizome yield and Curcuminoid content, Bulletin

of National Institute of Hygienic Sciences, (104): 124-128.

13 Aggarwal S., Takada Y., Singh S., Myers J.N and Aggarwal B.B (2004).Inhibition of Growth and Survival of Human Head and Neck SquamousCell Carcinoma Cells by Cur- cumin via Modulation of Nuclear Factor-

g, International Journal of Cancer,111(5): 679-692.

14 Apavatjrut P., Anuntalabhochai S., Sirirugsa P., Alisi C (1999)

(Zingiberaceae) species Ann Bot 84, 529-534

15 Bharat B.A., Kumar A., Manoj S.A and Shishir S (2005) Curcumin Derived from Turmeric (Curcuma longa): a Spice for All Seasons, Phytopharmaceuticals in Cancer Chemopreventions, 350- 387.

16 Chearwae W., Anuchapreedac S., Nandigama K., Ambudkar S.V and Limtrakul P.N (2004) Biochemical mechanism of modulation of human P-glycoprotein (ABCB1) by Curcumin I, II and III purified from

Turmeric powder, Biochemical Pharmacology.

17 Chen W.F., Deng S.L., Zhou B., Zang L., Liu Z.L (2005) Curcumin and its analogues as potent inhibitors of low density lipoprotein oxidation: H-atom abstraction from the phenolic groups and possible involvement of the 4-hydroxy-3 methoxyphenyl groups, National Laboratory of Applied Organic Chemistry, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

18 Coyne J.A and Orr H.A (2004) Patterns of Speciation in

Evolution, Vol 43, (2): 362-381.

19 Doyle JJ and Doyle J.L (1987) A rapid DNA isolation procedure for

small quantities of fresh leaf tissue Phytochemical Bulletin 19: 11-15.

20 Hayakawa H., Kobayashi T., Minamiya Y., Ito K., Miyazaki A., Fukuda T., Yamamoto (2010) Molercular Indentification of Turmeric (

Curcuma longa, Zingiberaceae) with High Curcumin Content, Journal

of Janpanese Botany, 85(5):263-269.

21 Hayakawa H., Kobayashi T., Minaniya Y., Ito K , Miyazaki A., Fukuda

T and Yamamoto Y (2011a), Development of a molecular marker to

identify a candidate line of turmeric (Curcuma longa L.) with a high Curcumin content American Journal of Plant Sciences, (2): 15-26.

22 Hayakawa H., Minaniya Y., Ito K., Yamamoto Y and Fukuda T.(2011b) Difference of Curcumin content in Curcuma longa L (Zingiberaceae) caused by hybridization with other Curcuma species American Journal of Plant Sciences, (2): 111-119.

23 Hergenhahn M., Soto U., Weninger A., Polack A., Hsu C H., Cheng, A.L and Rosl F., The chemopreventive compoud Curcumin is an efficient inhibitor of Epstein-Barr virus BL2F1 transcription in Raji DR-

LUC cells Mol Carcinogen., 2002, 33, 137-145.

24 Heubl G (2010) New Aspects of DNA-based Authentication of Chinese

Medicinal Plants by Molecular Biological Techniques, Planta Med 76:

1963-1974

25 Jayaprakasha G.K, Negi P.S., Anadharamakrishman C and Sakariah K.K (2001) Chemical composition of tumeric oil a hyproduct for from tumeric oleorsin inductry and Its inhibitory activity against different

fungi Z Natuforsch., 56: 40-44.

26 Kapoor L.D (1990) Handbook of Ayurvedic Medicinal Plants, CRC

Press, Boca Raton, Florida, 185

27 Kalpana J., Warude P.C and Bhushan P (2004) Molecular markers in

herbal drug technology Current Science, 87(2): 159-165.

28 Lin J.K., Lin-Shia S.Y (2001) Mechanisms of cancer chemoprevention

by Curcumin, Proc Natl Sci Counc Repub China B (25):59-66.

29 Mahady G.B., Pendland S.L., Yun G And Lu Z.Z (2002) Tumeric

(Curcuma longa L.) and Curcumin inhibit the growth of Helico-bacter pylori, of group 1 carcinogen Anticancer Res.,( 22): 4179-4181.

30 Masuda T., Maekawa T., Hidaka K., Bando H., Takeda Y and Yamagaguchi H (2001) Chemical studies on antioxidant mechanisms of Curcumin: analysis of oxidative coupling products from Curcumin nad

linoleate, J.Agic Food Chem.(49), 2539-2547.

31 Minami M., Nishio K., Ajioka Y., Kyushima H., Shigeki K., Kinjo K., Yamada K., Nagai M., Satoh K and Sakurai Y (2009) Identification of Curcuma plants and Curcumin content level by DNA Polymorphisms in

the trnS-trnfM intergenic Spacer in Chloroplast DNA, Journal of Natural

Medicines, 63, (1):75-79

32 Ravindran P.N., Babu K.N and Sivaranan K (2007) Turmeric: The Genus Curcuma Medicinal and Aromatic Plants Industrial Profles CRC Press, Boca Raton.

33 Roughley P.J and Whiting D.A (1973) Experiments in the biosynthesis

of Curcumin J Chem Soc., (20): 2379-2388.

34 Ruby A.J., Kuttan G., Dinesh Babu K., Rajasekharan K.N and Kuttan R.(1995) Antitumor and antioxidant activity of natural Curcuminoids

Cancer Lett.,( 94), 79-83.

35 Sasaki Y., Fushimi H., Cao H., Cai S.Q and Komatsu K (2002) Sequence Analysis of Chinese and Japanese Curcuma Drugs on the 18S rRNA Gene and trnK Gene and the Application of Amplification-

Refractory Mutation System Analysis for Their Authentication

Biological & Pharmaceutical Bulletin, 25, (12):1593-1599.

36 Shen L and Ji H.F (2007), Theoretical study on physicochemical

properties of Curcumin, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and

Biomolecular Spetroscopy, (67): 619-623

37 Sigrist M.S., Pinheiro J.B., Filho J.A and Zucchi M.I (2011) Genetic

diversity of turmeric germplasm (Curcuma longa; Zingiberaceae) identifed by microsatellite markers Genetics and Molecular Research,

10 (1): 419-428

38 Srivatsava S and Nidhi M (2009) Genetic Markers - A Cutting Edge

Technology in Herbal Drug Research Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 1(1): 1-18.

39 Tharachand C., Immanuel S.C and Mythili M.N (2012) Molecular

markers in characterization of medicinal plants: An overview Research

in Plant Biology, 2(2): 01-12.

rps16 rps

>1849327_Rps16_1 Rps16_F_

CCCCTAGAAACGTATAGGAGGTTTTATCCTCATACGGCTCGAACTC

GAGAAAAATTTTTCATTCGTACTCATAACTCAAGTTGGGTAATTCT

GACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCTAACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTCTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATCTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA

>1849336_Rps16_10 Rps16_F_

CGAGAAAATTTTTCATTCTTACTCTTAACTCAAGTTGGGTAATTCT

GACATAGTCCCAGGGGAATCCTTAAACATTTATTGAGCCGTCTCTAACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTCTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATCTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA

AACCTCTTTTGTTTGTCTCATCCCGAGTCAATTATTCTGATCCCTTTCTTGAGACAATTGAAAATAGTGTTTCCTTGTTCCGGAATCCTTTATCTTTCCTTTGTAAAATCATTGGGTTTAGAACATTACTTCGA

-Thái Nguyên, ngày