Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rpl16 ở một số mẫu giống nghệ (curcuna longa l ) có hàm lượng curcuminoids khác nhau

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÃ HỮU DŨNG “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH GEN RPL16 Ở MỘT SỐ MẪU GIỐNG NGHỆ (CURCUNA LONGA L.) CÓ HÀM LƢỢNG CURCUMINOIDS KHÁC NHAU” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Thái Nguyên, năm 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÃ HỮU DŨNG “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH GEN RPL16 Ở MỘT SỐ MẪU GIỐNG NGHỆ (CURCUNA LONGA L.) CÓ HÀM LƢỢNG CURCUMINOIDS KHÁC NHAU” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Lớp Khóa học Giáo viên hƣớng dẫn : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH - CNTP : K43 - CNSH : 2011 - 2015 : TS Nguyễn Văn Khiêm TS Nguyễn Văn Duy Thái Nguyên, năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Được trí ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm thời gian thực tập tốt nghiệp em thực đề tài “Nghiên cứu phân lập, giải trình tự phân tích gen rpl16 số mẫu giống nghệ (Curcuna longa L.) có hàm lƣợng curcuminoids khác nhau” Qua em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy TS Nguyễn Văn Khiêm TS Nguyễn Văn Duy tận tình hướng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực đề tài Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học suốt thời gian thực tập Em xin chân thành cảm ơn anh, chị Bộ môn giống Công nghệ sinh học Ban giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Trồng Chế biến thuốc Hà Nội - Viện Dược Liệu giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt thời gian thực nghiên cứu làm khóa luận Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ủng hộ, động viên để em có tự tin học tập nghiên cứu khoa học Em xin trân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Lã Hữu Dũng ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Danh sách mẫu nghệ, nguồn gốc ký hiệu 13 Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi rpl16 19 Bảng 3.3 Thành phản ứng PCR 19 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt 19 Bảng 4.1 Sự phụ thuộc giá trị mật độ quang vào nồng độ curcumin 22 Bảng 4.2: Kết phân tích hàm lượng Curcumin tổng số mẫu 23 Bảng 4.3: Hàm lượng DNA tổng số mẫu củ nghệ 25 Bảng 4.4 Kích thước khác biệt trình tự gene rpl16 mẫu giống nghệ 34 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: hình thái thân, (A); hoa (B) củ (C) Hình 2.2: Công thức hóa học số chất nghệ Hình 2.3: Quá trình hình thành di khối u tác động curcumin Hình 4.1: Phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng curcumin 22 Hình 4.2: Điện di DNA tổng số số mẫu nghệ 24 Hình 4.3: Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ mẫu nghệ 25 Hình 4.4 kết pha loãng DNA tổng số 18 mẫu nghệ 26 Hình 4.5: Điện di sản phẩm PCR gene rpl16 27 Hình 4.6: Sản phẩm PCR sau tinh 28 Hình 4.8 Trình tự gen rpl16 mẫu giống nghệ N9 (A) N18 (B) máy đọc trình tự 36 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT µg Micro gram µl Micro litre µM Micro Mole Bp base pair (cặp bazơ) CS cộng DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates Kb Kilobase mM Mili Mole Na2EDTA Ethylene diamine tetra acetate sodium NST Nhiễm sắc thể OD Optical density PCR polymerase chain reaction RNA ribonucleic acid TE Tris EDTA v MỤC LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài .2 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học: .3 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên nước .4 2.1.1 Nguồn gốc, phân bố đặc điểm thực vật học sinh thái nghệ vàng 2.1.2 Thành phần hóa học củ nghệ vàng 2.1.3 Tác dụng sinh học củ nghệ vàng 2.1.4 Một số nghiên cứu nước nghệ hoạt chất curcumin 2.2 Tình hình nghiên cứu nước 2.2.1 Nguồn gốc, phân bố nghệ vàng 2.2.2 Thành phần hóa học nghệ vàng 2.2.3 Tác dụng sinh học nghệ vàng .8 2.2.4 Một số nghiên cứu nước 11 Hiện có nhiều công trình nghiên cứu nghệ vàng hoạt chất giới 11 PHẦN ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 13 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 14 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 14 3.3 Nội dung nghiên cứu 14 vi 3.4 Hóa chất thiết bị 14 3.4.1 Hóa chất 14 3.4.2 Thiết bị 15 3.5 Phương pháp nghiên cứu 15 3.5.1 Phương pháp phân tích hàm lượng curcuminoids 15 3.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số .17 3.5.3 Phương pháp phân lập gen rpl16 lục lạp phương pháp PCR tinh sản phẩm PCR 18 Sử dụng Kít GeneAll® ExpinTM theo mô tả hãng GeneAll, Hàn Quốc 20 3.5.4 Phương pháp giải trình tự, xác đinh thị phân tử DNA nhận biết giống nghệ có hàm lượng curcumin cao 21 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Xác định hàm lượng curcumin củ nghệ .22 4.1.1 Xây dựng đồ thị chuẩn xác định hàm lượng curcuminoids .22 4.1.2 Kết xác định hàm lượng curcumin mẫu nghệ 23 4.2 Kết tách chiết DNA tổng số, phân lập, giải trình tự phân tích gen rpl16 24 4.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số 24 4.2.2 Kết phân lập, tinh sạch, giải trình tự phân tích gen rpl16 27 4.3 Kết thị phân tử DNA đặc trưng mẫu giống nhệ .36 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây nghệ vàng biết đến loại thuốc quý biết đến với loại gia vị thiếu ẩm thực Châu Á Trong công thức nấu ăn bên Nam Á, nghệ sử dụng làm chất tạo mầu, sử dụng đồ uống đóng hộp đồ nướng sản phẩm sữa kem, bánh ngọt, bánh quy,…Đây loại bột quan trọng hầu hết bột cà ri thương mại Hầu hết loại nghệ sử dụng dạng bột củ, số nơi sử dụng Mặc dù thường sử dụng dạng bột khô, nghệ sử dụng dạng tươi Nhìn chung nghệ sử dụng rộng rãi làm gia vị ẩm Châu Á Từ xa xưa, nghệ vàng xem thứ thuốc quý công dụng mà mang lại Nhân dân ta thường dùng để khử trùng, làm mờ sẹo làm lành vết thương Theo Đông y củ nghệ vàng có vị cay, đắng, tính bình có tác dụng hành khí, hoạt huyết, làm tan máu, tan ứ giảm đau chủ trị bệnh trướng đầy, bế kinh, bệnh sau đẻ, chấn thương, ung thũng Bên cạnh đó, nghệ giúp giảm cân, lưu thông lọc máu, giúp thể chống lại vi khuẩn kí sinh ruột Weir et al (2007) [32], khám phá khả kìm hãm tế bào ung thư nghệ vàng Trong nhiều nghiên cứu cho thấy hợp chất curcumin dẫn xuất Desmethoxycurcumin Bisdesmethoxycurcumin thành phần quan trọng thành phần tạo nên khả chữa bệnh nghệ Curcumin có loạt hiệu ứng sinh học bao gồm: chống viêm, chống oxy hóa (Shukla et al 2008)[28], hóa trị liệu, kháng sinh, kháng virus hoạt động virus Một số nghiên cứu nghệ cho thấy Trong tự nhiên curcuminoids phân bố khác củ nghệ Hàm lượng phụ thuộc vào giống, loài, giai đoạn sinh trưởng phát triển yếu tố ảnh hưởng đến môi trường, khí hậu, thổ nhưỡng Chọn lọc các thể có suất chất lượng cao để nhân nhanh phát triển giống phục vụ sản xuất điều mong muốn người trồng nghệ Về chất di truyền hàm lượng curcuminnoids củ nghệ liên quan đến gen quy định Các gen nằm NST nhân (như gen CURS1, CURS2, CURS3) gen nằm quan tử lục lạp Để xác định cá thể cho hàm lượng curcuminoids cao theo phương pháp thông thường thời gian, tăng chi phí, không xác phụ thuộc vào môi trường thời gian thu mẫu củ Chỉ thị phân tử DNA đoạn DNA thuộc gen hay đoạn gen nằm nhân hay lục lạp liên quan đến tổng hợp trao đổi chất tế bào Chỉ thị phân tử DNA đặc trưng cho giống nghệ có hàm lượng curcuminoids cao có tác dụng chẩn đoán xác nhanh cho hàm lượng curcuminoids cao kiểu gen quy định không phụ thuộc vào môi trường thời gian thu mẫu Chỉ thị phân tử DNA có xác tin cậy cao thông tin di truyền không phụ thuộc vào tuổi, điều kiện sinh lý môi trường (Kalpana et al 2004)[14] Chỉ thị phân tử DNA đặc trưng cho giống nghệ có hàm lượng curcumin cao có tác dụng chẩn đoán xác nhanh cho hàm lượng curcumin cao.Do đó, phạm vi luận văn tiến hành: “Nghiên cứu phân lập, giải trình tự phân tích gen rpl16 số mẫu giống nghệ (Curcuna longa L.) có hàm lƣợng curcuminoids khác nhau” 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu Nghiên cứu phân lập, giải trình tự phân tích gen rpl16 số mẫu giống nghệ (Curcuna longa L.) có hàm lượng curcumin tổng số khác thu thập Việt Nam 28 Hình 4.6: Sản phẩm PCR sau tinh Giếng M Marker DNA (1 kb), giếng – 18 mẫu nghệ N1 – N18 Qua Hình 4.6 ta thấy băng điện di có băng kích thước khoảng 0,26 kb giống sản phẩm PCR trước tinh Sau tinh sạch, sản phẩm PCR gửi mẫu sang Singapore để giải trình tự 4.2.2.3 Kết trình tự rpl16 Sau toàn kết giải trình tự gen rpl16 18 mẫu nghệ Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N1) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTCGCGGGCGAATATTGACTCTTTC (264 bp) Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N2) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTCGCGGGCGAATATTGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N3) 29 GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAGGA AGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGCATA TTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGATCCT TTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAATCT AAAGTTTCGCGGGCGAATATTGACTCTTTC (262 bp) Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N4) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAGGA AGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGCATA TTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGATCCT TTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAATCT AAAGTTTCGCGGGCGAATATTGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N5) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAGGA AGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGCATA TTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGATCCT TTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAATCT AAAGTTTCGCGGGCGAATNATTGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N6) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAGGA AGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTTTATGCATAT TTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGATCCTT TTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAATCTA AAGTTTCGCGGGCGAATATTGACTCTTTC 30 Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N7) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAGGA AGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTTTATGCATAT TTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGATCCTT TTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAATCTA AAGTTTCGCGGGCGAATATTGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N8) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTCGCGGGCGATAATTGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N9) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATATTATCAATATTGAATTTGTTATATA GGAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATG CATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGA TCCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTA ATCTAAAGTTTCGCGGGCGAAATATTGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N10) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AATAATCCATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAGGAA GATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGCATAT TTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGATCCTT 31 TTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAATCTA AAGTTTCGCGGGCGTTAAATTGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N11) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTCGCGGGCGAATTTGGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N12) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTCGCGGGCGAATATTGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N13) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTCGCGGGCGAATATTGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N14) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG 32 GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTCGCGGGCGAATATTGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N15) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTCGCGGGCGAATATTGNACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N16) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N17) GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTCGCGGGCGAATATTGGACTCTTTC Trình tự gen rpl16 (mẫu giống N18) 33 GTTTCTTCTCATCCAGCTCCATGACATATTACAGATACACACGGAA AAAATAATCCAATAAGACATTTATCAATATTGAATTTGTTATATAG GAAGATGTATGTACGGGATATACAGATAGAATGTTTCTATTATGC ATATTTATGGATTATAGATAATGTTTATAATGTTTTTTTATAATGAT CCTTTTTTTGACCCTTCTCAAAGGATGCCAAAATATTGTAATGTAA TCTAAAGTTTCGCGGGCGAATATTGGACTCTTTC Từ trình tự cho thấy nhóm giống nghệ có hàm lượng curcuminoids thấp có trình tự tương đương có kích thước 262 bp nhóm giống nghẹ có hàm lượng curcuminoids cao tương đương có kích thước 264 bp Từ cho thấy có khác nhóm giống nghệ thấy giõ sai khác tiến hành so sánh trình tự tất 18 mẫugiống nghệ phần mềm ClustalW2 trình bày Hình 4.7 34 Hình 4.7 Kết so sánh trình tự gen rpl16 18 mẫu nghệ phần mềm ClustalW2 Từ hình ảnh so sánh cho ta thấy hai nhóm giống nghệ có sai khác Nhóm giống nghệ có hàm lượng curcuminoids cao nhiều nucleotit loại Adelin vị trí số 50 51 Từ tìm thị phân tử DNA cho nhóm giống nghệ tổng hợp bảng 4.4 sau : 35 Bảng 4.4 Kích thƣớc khác biệt trình tự gene rpl16 mẫu giống nghệ STT Mẫu Hàm lƣợng curcumin Sự khác biệt trình tự gen rpl16 Khác biệt trình tự nucleotide Kích thƣớc gene N1 3,62 ± 0,02 GAAAAAAT 264 N2 2,05 ± 0,02 GAAAAAAT 264 N3 0,36 ± 0,01 GAAAAT 262 N4 0,38 ± 0,01 GAAAAT 262 N5 0,42 ± 0,02 GAAAAT 262 N6 0,48 ± 0,01 GAAAAT 262 N7 0,68 ± 0,01 GAAAAT 262 N8 1,98 ± 0,01 GAAAAAAT 264 N9 0,25 ± 0,02 GAAAAT 262 10 N10 6,35 ± 0,01 GAAAAAAT 264 11 N11 5,80 ± 0,01 GAAAAAAT 264 12 N12 5,75 ± 0,01 GAAAAAAT 264 13 N13 5,87 ± 0,01 GAAAAAAT 264 14 N14 4,27 ± 0,02 GAAAAAAT 264 15 N15 6,60 ± 0,01 GAAAAAAT 264 16 N16 7,25 ± 0,02 GAAAAAAT 264 17 N17 6,65 ± 0,02 GAAAAAAT 264 18 N18 8,32 ±0,02 GAAAAAAT 264 Kết giải trình tự gen rpl16 18 mẫu giống (N1-N18) cho thấy gen có độ dài khoảng 262-264 bp tương tự kích thước gen mẫu nghệ có nguồn gốc từ nước khác Indonesia, Nhật Bản công bố 36 Hayakawa đồng tác giả (Hayakawa et al., 2011a) Một đoạn trình tự gen máy đọc trình tự mẫu giống N10 (hàm lượng cucurminoids (0,25%) N18 (8,32%) thể Hình 4.8 Để xác định xác kích thước vạch băng đoạn sản phẩm PCR tiến hành xác định trình toàn mẫu sản phẩm khuếch đại (A) (B) Hình 4.8 Trình tự gen rpl16 mẫu giống nghệ N9 (A) N18 (B) máy đọc trình tự Từ Hình 4.8 cho thấy tín hiệu tốt, từ nucleotide số 20 – 40 tín hiệu không rõ ràng, bị nhiễu pick đỉnh chồng lẫn lên 4.3 Kết thị phân tử DNA đặc trưng mẫu giống nhệ Trên sở trình tự gen rpl16 Bảng 4.4 cho thấy nhóm giống nghệ có hàm lượng curcumin cao (1,98 – 8,32 %) gồm 12 mẫu: N1, N2, N8, N10, N11, N12, N13, N14, N15, N16, N17 N18 GAAAAAAT gene có chiều dài 264 bp, nhóm có hầm ượng curcuminoids thấp (0,25 – 0,68%) gồm mẫu: N3, N4, N5, N6, N7 N9 có thị phân tử GAAAAT gene có chiều dài 262 bp 37 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu rút số kết luận sau: 1) Đã xác định hàm lượng curcuminoids 18 mẫu nghệ có nguồn gốc từ 14 tỉnh Trong số 18 mẫu, có 12 mẫu có hàm lượng curcumin cao (1,98 – 8,32%), mẫu có hàm lượng curcumin thấp (0,25 –0,68%) 2) Đã phân lập giải trình tự gen rpl16 18 mẫu giống nghệ có hàm lượng curcumin khác 3) Đã xác định thị DNA gen rpl16 để nhận biết giống nghệ có hàm lượng curcumin cao GAAAAAAT có kích thước 464 bp, hàm lượng curcumin thấp GAAAAT có kích thước 262 bp 5.2 Kiến nghị Từ kết nghiên cứu đưa số kiến nghị sau: 1) Tiếp tục kiểm tra thị DNA gene rpl16 cảu mẫu giống nghệ khác 2) Tiếp tục xác định thị DNA gene khác lục lạp vùng ITS để nhận biết mẫu giống nghệ có hàm lượng curcumin khác 3) Tiếp tục phát triển phương pháp thị phân tử khác để xác định mẫu giống nghệ có hàm lượng curcumin cao 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiến, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, I: 894-895 Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trần Thị Lan, Hoàng Thị Sáu (2008), Công trình nghiên cứu khoa học tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc 1998 - 2008, Viện Dược liệu, Bộ Y tế, trang 287 – 294 Trần Thị Lan, “Thu thập, đánh giá đặc điểm nông sinh học hàm lượng Curcumin số mẫu giống nghệ vàng (Curcuma longa L.) Thanh Hóa”, Luận văn thạc sĩ, Đại Học Bách Khoa, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội Bộ Y Tế & Bộ Khoa học công nghệ (2009), Bảo tồn phát triển nguồn gen giống thuốc Hội nghị tổng kết 20 năm thực nhiệm vụ bảo tồn nguồn gen giống thuốc Tam Đảo(1988 – 2008) Lê Xuân Tiến (2008) “Nghiên cứu tổng hợp Hyrdrazinocurcumin Isoxaxolcurcumin – Khảo sát hoạt tính sinh học chúng”, Luận văn thạc sĩ, Đại Học Bách Khoa, II Tài liệu tiếng anh Aggarwal B.B., Kumar A., Aggarwal M.S., Shishodia S (2005), Curcumin derived from turmeric (Curcuma longa) : a spice for all seasons, CRC Press LLC, Aoi K., Kaburagi K., Seki T., Tobata T., Sarak M and Kuroyanagi M (1986), Studies on the cultivation of turmeric (Curcuma longa L.): 39 Varietal differences in rhizome yield and curcuminoid content, Bulletin of National Institute of Hygienic Sciences, (104), pp 124-128 Apavatjrut P, Anuntalabhochai S, Sirirugsa P, Alisi C (1999) Molecular markers in the identification of some early flowering Curcuma (Zingiberaceae) species Ann Bot 84, pp 529–534 Chattopadhyay I., Biswas K., Bandyopadhyay U., and Banerjee R K (2004), Turmeric and curcumin: Biological actions and medicinal applications Curr Sci 87, pp 44–50, Chearwae W., Anuchapreedac S., Nandigama K., Ambudkar S.V., Limtrakul P (2004), Biochemical mechanism of modulation of human P-glycoprotein (ABCB1) by curcumin I, II, and III purified from Turmeric powder, Biochemical Pharmacology, Chen W-F., Deng S-L., Zhou B., Yang L., Liu Z-L., (2006), Curcumin and its analogues as potent inhibitors of low density lipoprotein oxidation: Hatom abstraction from the phenolic groups and possible involvement of the 4-hydroxy-3-methoxyphenyl groups, 40, pp 526-535 Cintra1 MMDF., Pinheiro J.B., and Sibov S.T (2005), Genetic divergence among Curcuma longa L.Accessions, Crop Breeding and Applied Biotechnology, 5, pp 410-417 Daniel V., Limson J.L., Dairam A., Watkins G.M., Daya S (2004), Through metal binding, curcumin protects against lead- and cadmiuminduced lipid peroxidation in rat brain homogenates and against leadinduced tissue damage in rat brain, Journal of Inorganic Biochemistry 98, pp 266-275 Hayakawa H, Kobayashi T, Minaniya Y, Ito K , Miyazaki A, Fukuda T, Yamamoto Y (2011a) Development of a molecular marker to identify a 40 candidate line of turmeric (Curcuma longa L.) with a high Curcumin content American Journal of Plant Sciences, (2): 15-26 10 Hayakawa H., Kobayashi T., Minamiya Y., Ito K., Miyazaki A., Fukuda T., Yamamoto Y (2010), Molercular Indentification of Turmeric ( Curcuma longa, Zingiberaceae) with High Curcumin Content, Journal of Janpanese Botany, 85(5), pp 263-269 11 Hayakawa H., Minaniya Y., Ito K., Yamamoto Y., Fukuda T (2011b), Difference of Curcumin content in Curcuma longa L (Zingiberaceae) caused by hybridization with other Curcumaspecies American Journal of Plant Sciences, (2), pp 111-119 12 Jayaprakasha GK., Negi PS., Anadharamakrishman C and Sakariah K.K (2001) Chemical composition of tumeric oil a hyproduct for from tumeric oleorsin inductry and Its inhibitory activity against different fungi Z Natuforsch., 56, pp 40-44 13 Joshi RK, Kuanar A, Mohanty S, Subudhi E, Nayak S (2010) Mining and characterization of EST derived microsatellites in Curcuma long a L Bioinformation 5(3): 128-131 14 Kalpana J., Warude P.C and Bhushan P (2004), Molecular markers in herbal drugtechnology Current Science, 87(2), pp 159-165 15 Kapoor LD (1990) Handbook of Ayurvedic Medicinal Plants, CRC Press, Boca Raton, Florida, 185 16 Lin, J K.; Lin-Shia, S Y., (2001) Mechanisms of cancer chemoprevention by curcumin, Proc Natl Sci Counc Repub China B 25, pp 59– 66 17 Mahady G.B., Pendland S.L., Yun G And Lu Z.Z (2002) Tumeric (Curcuma longa L.) and curcumin inhibit the growth of Helico-bacter pylori, of group carcinogen Anticancer Res.,( 22), pp 4179-4181 41 18 Peter K.V., (2001), Hand book of herbs and spices, Woodhead Publishing Limited, Cambridge England 19 Pfeiffer E., Hohle S., Solyom, A., Metzler, M (2003), Studies on the stability of turmeric constituents J Food Eng 56, pp 257–259 20 Phan T., See P., Lee S., Chan S.Y (2001), Protective effects of curcumin against oxidative damage on skin cells in vitro: its implication for wound healing, J-Trauma 51, pp 927-931 21 Priyadarsini K.I., Mity D.K., Naik G.H., Kumar M.S., Unnikrishnan M.K., Satav J.G., Mohan H (2003), Role of phenolic O-H and methylene hydrogen on the free radical reactions and antioxidant activity of curcumin, Free Radical Biology and Medicine 35, pp 475-484 22 Ravindran P.N., Babu K.N and Sivaranan K (2007) Turmeric: The Genus Curcuma Medicinal and Aromatic Plants Industrial Profles CRC Press, Boca Raton 23 Reddy A.P., Lokesh B.R (1992), Studies on spice principles as antioxidants in the inhibition of lipid peroxidation of rat liver microsomes, Molecular and Cellular Biochemistry 111, pp 117-124 24 Runothayanun P., Wirachwong P (2005), Development of tetrahydrocurcuminoid liposomes as an ingredient for cosmetic products, 7th ASCS conference Bangkok, Thailand 25 Sasaki Y., Fushimi H., Cao H., Cai S.Q and Komatsu K (2002), Sequence Analysis of Chinese and Japanese Curcuma Drugs on the 18S rRNA Gene and trnK Gene and the Application of Amplification- Refractory Mutation System Analysis for Their Authentication Biological & Pharmaceutical Bulletin, 25, (12), pp 1593-1599 26 Selvam C., Jachak SM., Thilagavathi R., Chakraborti AK (2005), Design, synthesis, biological evaluation and molecular docking of curcumin 42 analogues as antioxidant, cyclooxygenase inhibitory and anti- inflammatory agents , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15, pp 1793-1797 27 Shen L., Ji H-F.(2007), Theoretical study on physicochemical properties of curcumin, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 67, pp 619-623 28 Shukla P.K., Khanna V.K., Ali M.M., Khan M.Y., Srimal R.C (2008) Anti-ischemic effect of curcumin in rat brain, Neurochern Res 6/2008; 33(6), pp 1036-43 29 Sigrist M.S., Pinheiro J.B., Filho J.A and Zucchi M.I (2011) Genetic diversity of turmeric germplasm (Curcuma longa; Zingiberaceae) identifed by microsatellite markers Genetics and Molecular Research, 10 (1), pp 419-428 30 Srivatsava S and Nidhi M.(2009) Genetic Markers – A Cutting Edge Technology in Herbal Drug Research Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 1(1), pp 1-18 31 Tharachand C., Immanuel S.C and Mythili M.N (2012) Molecular markers in characterization of medicinal plants: An overview Research in Plant Biology, 2(2), pp 01-12 32 Weir N.M.,Selvendiran K.,Kutala V.K.,Tong L.,Vishwanath S.,Rajaram M.,Tridandapani S.,AnantS and Kuppusamy P (2007) CurcuminInducesG2/MArrestand Apoptosis in Cisplatin - Resistant Human Ovarian Cancer CellsbyModulating Akt andp38MAPK, CancerBiol- ogyandTherapy, (2), pp 178-184 33 Wright J.S (2002) Predicting the antioxidant activity of curcumin and curcuminoids J Mol Struct (Theochem.) , pp 207–217 [...]... cây nghệ ở các vùng khác nhau có sự chênh l ch rất l n từ 0,25% (mẫu giống N1 0) đến 8,32% (mẫu giống N1 8) Nghiên cứu của Trần Thị Lan [3] hàm l ợng curcumin tách chiết từ 11 mẫu giống nghệ thu thập từ 8 tỉnh khác nhau trên cả nước chia l m 2 nhám 24 nhóm có hàm l ợng curcumin cao l trên 1% và nhóm có hàm l ợng curcumin thấp l dưới 1% 4.2 Kết quả tách chiết DNA tổng số, phân l p, giải trình tự và phân. ..3 1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu + Thu thập các mẫu giống nghệ và phân tích được hàm l ợng curcuminoids trong các mẫu giống nghệ + Nghiên cứu tách chiết được DNA tổng số, tiến hành phản ứng PCR, tinh sạch, giải trình tự, phân tích được gen rpl16 + Xác được chỉ thị phân tử trên gen rpl16 nhận biết đối với các mẫu giống nghệ có hàm l ợng curcuminoids khác nhau 1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn... về trình tự gen rpl16 ở l c l p trên có sở đó có thể hy vọng xác định chỉ thị phân tử DNA liên quan đến hàm l ợng curcuminoids trong các giống nghệ khác nhau ở Việt Nam Trên cơ sở thông tin này các nhà chọn giống nghệ có thể sử dụng để sàng l c các giống nghệ có hoạt chất cao cho sản xuất 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn: - Chỉ thị phân tử trên gen rpl16 có thể được áp dụng vào xác định nhanh các giống nghệ có. .. thị phân tử DNA nhận biết các giống nghệ có hàm l ợng curcumin cao Trình tự gen rpl16 của tất cả các mẫu giống được so sánh đối chiếu và xác định chỉ thị phân tử đặc trưng cho các giống có hàm l ợng curcumin khác nhau 22 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định hàm l ợng curcumin trong củ nghệ 4.1.1 Xây dựng đồ thị chuẩn xác định hàm l ợng curcuminoids Để xác định hàm l ợng curcumin tổng số, ... các mẫu giống nghệ có hàm l ợng curcuminoids khác nhau trên cơ sở trình tự gen rpl16 3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành - Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Giống và công nghệ sinh học và Khoa hóa Phân tích tiêu chuẩn-Viện Dược liệu - Thời gian nghiên cứu: 12/2014-6/2015 3.3 Nội dung nghiên cứu - Thu thập mẫu và xác định hàm l ợng curcumin trong các mẫu giống nghệ - Tách chiết DNA tổng số, ... các loài trong chi Curcuma và các giống trong loài C longa thu thập từ Việt Nam, Indonesia và Nhật Bản Hayakawa et al.(2011b)[11]đã phân tích gene matK của DNA l c l p (cpDNA) và đoạn ETS (external transcribed spacer) của DNA nhân mã hóa cho riboxom (nrDNA) Kết quả nghiên cứu đã cho thấy sự khác nhau về hàm l ợng curcumin trong số các dòng nghệ của loài C longa gây ra bởi lai và chuyển gen từ các loài... Tên giống Hàm l ợng ( %) (TB ± SD) Ghi chú: TB: Trung bình; SD: sai số chuẩn Từ kết quả Bảng 4.2, có thể chia các mẫu giống có hàm l ợng curcumin thành 2 nhóm Nhóm mẫu có hàm l ợng curcumin cao (1,98 – 8,32 %) gồm 12 mẫu: N1, N2, N8, N10, N11, N12, N13, N14, N15, N16, N17 và N18; nhóm mẫu có hàm l ợng curcumin thấp (0,25 – 0,68 %) gồm 6 mẫu: N3, N4, N5, N6, N7 và N9 Số liệu từ Bảng 3 cho thấy hàm l ợng... phản ứng và chu trình nhiệt được thể hiện l n l ợt trong các Bảng 3.3 và Bảng 3.4 Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại gene rpl16 trong DNA l c l p của loài nghệ C .longa Gene này được phân l p từ mẫu giống nghệ Indonesia có kích thước khoảng 0,26 kb Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi rpl16 Tên mồi Trình tự nucleotide (5’→3 ) Giá trị Tm Kích thước sản (oC) phẩm PCR (kb) RPL16- F GTTTCTTCTCATCCAGCTCC 54,92 RPL16- R... quả pha loãng DNA tổng số của 18 mẫu nghệ Từ giếng 1 – 18 tƣơng ứng với mẫu nghệ N1 – N18 27 Từ Hình 4.4 cho thấy sau khi pha loãng nồn độ DNA tổng số tương đối đều nhau khoảng 520 ng/ l thuận l i cho phản ứng PCR 4.2.2 Kết quả phân l p, tinh sạch, giải trình tự và phân tích gen rpl16 4.2.2.1 Kết quả phân l p gene rpl16 Từ các mẫu DNA tổng số tách được của 18 mẫu giống nghệ từ các tỉnh khác nhau trên... số, phân l p và giải trình tự gene rpl16 của các giống nghệ - Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến mức hàm l ợng curcuminoids khác nhau trên cơ sở trình tự gen rpl16 3.4 Hóa chất và thiết bị 3.4.1 Hóa chất 3.4.1.1 hóa chất cho tách chiết DNA - Đệm chiết DNA gồm: 4 % CTAB (w/v), 1,5 M NaCl, 100mM TrisHCl, 20 mM EDTA, 2% PVP (w/v), 2% β-Mercaptoethanol (βMercaptoethanol được bổ sung trước khi chiết)