Bài viết này trình bày quá trình giải trình tự, thu nhận chuỗi nucleotid, phân tích đặc điểm khung gen LMP-1 và thu nhận chuỗi gen ARN thông tin của 34 chủng EBV phân lập từ BN UTVMH ở Việt Nam. Trình tự nucleotid, đặc điểm cấu trúc phân tử gen LMP-1 và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của 34 chủng dựa vào dữ liệu gen ARN thông tin LMP-1 cũng được xây dựng, so với các chủng thế giới nhằm xác định phân nhánh của EBV Việt Nam.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC GEN LMP-1 VÀ MỐI QUAN HỆ NGUỒN GỐC PHẢ HỆ CỦA 34 CHỦNG VIRUT EPSTEIN-BARR TỪ BỆNH NHÂN UNG THƢ VÒM HỌNG Ở VIỆT NAM Lê Thanh Hà*; Nguyễn Lĩnh Tồn** Nguyễn Đình Phúc***; Lê Thanh Hòa**** TĨM TẮT Tách chiết ADN tổng số chứa hệ gen Epstein-Barr virut (EBV) từ mẫu mô sinh thiết 64 BN chẩn đốn ung thư vòm mũi họng (UTVMH) miền Bắc Trung Nam (Việt Nam) Bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi LPMP1F/LMP1R, thu nhận, dòng hóa giải trình tự 34 sản phẩm PCR Trình tự nucleotid 34 chuỗi gen LMP-1 có độ dài biến động từ 1.238 - 1.337 bp Kết phân tích gen LMP-1 34 chủng cho thấy có exon intron khung gen LMP-1, exon 268 bp; intron 76 - 78 bp; exon 87 bp; intron 76 -77 bp exon có độ biến động độ dài cao từ 728 - 827 bp Kích thước ARN thơng tin từ 1.083 - 1.182 bp, mã hóa protein LMP-1 có độ dài 353 - 387 a.a So sánh đối chiếu với chủng quốc tế đăng ký Ngân hàng Gen cho thấy, 34 chủng nghiên cứu Việt Nam có độ đồng cao với chủng China (Trung Quốc) chủng khác (NPC1, NPC2, NPC3) Việt Nam Phân tích phả hệ cho thấy 34 chủng nghiên cứu thuộc nhóm, đó, nhóm I: 20/34 thuộc nhóm gồm chủng di truyền China 1, nhóm I: 9/34 thuộc nhóm chủng di truyền China 2, Alaska North Carolina nhóm III: 5/34 thuộc nhóm chủng di truyền Med+ Med- * Từ khóa: Ung thư vòm mũi họng; EBV; Exon; Intron; LMP-1, Phả hệ STRUCTURE OF LMP-1 AND PHYLOGENETIC ANALYSIS OF 34 EBV STRAINS ISOLATED FROM NASOPHARYNGEAL CARCINOMA PATIENTS IN VIETNAM SUMMARY Genomic DNAs of Epstein-Barr virus were extracted from biopsy tissue of 64 patients with nasopharyngeal carcinoma Of 64 templates using PCR with primers LPMP1F/LMP1R, 34 products were successfully obtained, cloned and sequenced The entire LMP-1 sequence for 34 isolates was between 1,238 and 1,337 bp There were exons and introns inside the LMP1 frame of which, exon was 268 bp, itron was 76 -78 bp, exon was 87 bp, intron was 76 - 77 bp and exon was variable, between 728 and 827 bp The full length of mRNA varied between 1,083 and 1,182 bp, encoding for 353 - 387 amino acid Comparative analysis revealed that 34 EBV strains of the Vietnamese patients have highest identity and homology with China (China) and others of Vietnam (NPC1, NPC2, NPC3) Phylogenetic tree showed that there were groups, including group I of 20/34 strains clustered with the China 1; group II with 9/34 belonging to the China 2, Alaska and NC (North Carolina); and group III of 5/34 strains with the Med + and Med- * Key words: Nasopharyngeal carcinoma; EBV; Exon; Intron; LMP-1; Phylogeny * Bệnh viện Quân y 103 ** Học viện Quân y *** Viện Tai Mũi Họng Trung ương **** Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam Người phản hồi (Corresponding): Lê Thanh Hà (lethanhhash@yahoo.com) Ngày nhận bài: 24/01/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 12/02/2014 Ngày báo đăng: 25/02/2014 18 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 ĐẶT VẤN ĐỀ Epstein-Barr virut (EBV) loại Herpesvirut thuộc họ Herpesviridae, tồn thể người thường không gây triệu chứng lâm sàng EBV có tỷ lệ nhiễm cao cộng đồng tất người đến tuổi trưởng thành có khả mang EBV (Adham CS, 2012; Ai CS, 2012; Young, Rickinson, 2004) Trạng thái nhiễm tiềm tàng EBV tượng đặc trưng loại virut này, gặp điều kiện thuận lợi, chúng chuyển sang dạng hoạt động làm tăng nguy mắc số bệnh ung thư dày, UTVMH u lympho Burkitt (Kondo CS, 2012) Nhiễm tiềm tàng EBV tượng khởi đầu cho trình tiến triển ung thư (Kondo CS., 2012) Sự truyền nhiễm EBV chủ yếu đặc trưng biểu gen tiềm tàng, bao gồm EBNA-1, LMP-1, LMP-2 EBER (Junker, 2005) Trong gen protein ảnh hưởng đến tiến triển thành ung thư, LMP-1 có vai trò đặc biệt quan trọng, chứng minh có khả đơn phương gây ung thư chuột thực nghiệm (Shair CS, 2008) LMP-1 gen tiềm ẩn EBV phát có chức chuyển đổi thay đổi kiểu hình dòng tế bào lympho B Sản phẩm ARN thông tin LMP-1 kết ghép-nối (splicing) chuỗi exon 1, 3, chịu trách nhiệm tổng hợp protein LMP-1 (Ai CS., 2012) Protein LMP-1 có phân tử lượng 63 kDa, cấu tạo từ khoảng 386 axít amin, chia thành vùng: i) Vùng N tận (từ axít amin - 23): có vai trò gắn phần gốc protein LMP-1 vào nguyên sinh chất tế bào; ii) Vùng nhóm axít amin kỵ nước nằm liên quan đến chức tự liên kết; iii) Vùng C tận (từ axít amin 187 - 386): chứa 200 axít amin, có chức kích hoạt đường dẫn truyền tín hiệu gây chuyển dạng thay đổi kiểu hình tế bào lympho B Nếu loại bỏ đoạn LMP-1, làm EBV khả gây biệt hóa tế bào lympho B Kỹ thuật phân tích gen xác định ba vùng chức riêng biệt đầu tận C LMP-1 gọi CTAR (C-terminal activator regions), bao gồm CTAR1, CTAR2 CTAR3 (Young, Rickinson, 2004) EBV phân chia thành nhánh đại diện nhóm di truyền, bao gồm Raji, China 1, China 2, Alaska, Med+, Med(Mediterranean) NC (North Carolina), phân lập theo vùng địa lý, có xu hướng xâm nhập xuyên quốc gia (Mainou, Raab-Traub, 2006) Bài báo trình bày trình giải trình tự, thu nhận chuỗi nucleotid, phân tích đặc điểm khung gen LMP-1 thu nhận chuỗi gen ARN thông tin 34 chủng EBV phân lập từ BN UTVMH Việt Nam Trình tự nucleotid, đặc điểm cấu trúc phân tử gen LMP-1 mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 34 chủng dựa vào liệu gen ARN thông tin LMP-1 xây dựng, so với chủng giới nhằm xác định phân nhánh EBV Việt Nam ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 34 chủng EBV phân lập từ mô sinh thiết khối u 64 mẫu bệnh phẩm từ BN UTVMH (đã chẩn đốn xác định 21 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 dựa vào triệu chứng lâm sàng kết giải phẫu bệnh lý) Bệnh viện Tai Mũi Họng TW Phƣơng pháp nghiên cứu * Tách chiết ADN tổng số: Sử dụng kit tách chiết ADN tổng số (Hãng BIONEER, Hàn Quốc) QIAGEN (Mỹ) để tách chiết ADN tổng số chứa hệ gen EBV từ 64 mẫu bệnh phẩm UTVMH Tách chiết tinh ADN hệ gen EBV theo hướng dẫn nhà sản xuất Đo hàm lượng ADN quang phổ kế (Spectrophotometer) * Thực phản ứng PCR gen LMP-1: Thực phản ứng PCR với cặp mồi LMP1-F LMP1-R để phát gen LMP-1 có mặt mẫu UTVMH (bảng 1) Sản phẩm thu giải trình tự trực tiếp sau dòng hóa Bảng 1: Trình tự nucleotid cặp mồi LMP1-F/LMP1-R điều kiện phản ứng PCR Tên mồi Trình tự nucleotid (5>3) điều kiện PCR LMP1-F ATGGAACGCGACCTTGAGAG LMP1-R TTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAAC 940C phút, 35 chu kỳ gồm bước: 940C phút, 550C phút, 720C phút, 720C 10 phút * Dòng hố sản phẩm, tách dòng, giải trình phân tích trình tự: Sản phẩm PCR đoạn gen LMP-1 mẫu sau tinh dòng hố vào plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen Inc.) Chọn lọc khuẩn lạc tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp theo quy trình Hãng Bioneer (Hàn Quốc) Trình tự nucleotid ADN plasmid tái tổ hợp mang khung gen LMP-1 giải trình máy tự động ABI-3100 Genetic Analyzer Xử lý chuỗi nucleotid chương trình SeqEd1.03, AssemblyLIGN1.9, MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) so sánh đối chiếu chương trình GENEDOC2.6, xác lập phả hệ chương trình MEGA5.0 (Tamura CS, 2011) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết phân tích đặc điểm gen LMP-1 Tồn 64 mẫu mô sinh thiết UTVMH tách chiết ADN tổng số Sử dụng ADN tổng số làm khuôn để chạy PCR với cặp mồi LMP1-F LMP1-R (bảng 1) Kết quả: 34/64 mẫu cho sản phẩm PCR chứa toàn gen LMP-1, 30 mẫu lại khơng phát LMP-1 (phản ứng PCR âm tính) (hình 1) Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen LMP-1 với cặp mồi LMP1-F/LMP1-R số mẫu UTVMH thạch agarose 1% (Ghi chú: M: thị phân tử ADN (ở sử dụng hệ gen Lamda cắt enzym giới 22 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 hạn HindIII); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương; Các mẫu ký hiệu S5, S7, S11, S16, H2, S9, S18, H9,S1, B4, B5, B6, B9, B10, B12, E61, H12, M12, M14: sản phẩm PCR mẫu UTVMH tương ứng) Sản phẩm PCR 34 mẫu EBV xác định trước sau intron dòng hóa giải trình tự để phân tích đặc intron Đối với exon 3, trình tự nucleotide điểm cấu trúc gen LMP-1 phân tích biến đổi chủng Đây đặc điểm nguồn gốc phả hệ Xác định giới hạn exon cần khai thác để phân tích biến đổi di intron phương pháp so sánh đối truyền (phân tử) chủng Với chiếu chuỗi nucleotid toàn khung phương pháp xác định vậy, gen LMP-1 với ARN thông tin chủng tiến hành thu thập chuỗi nucleotid exon Trung Quốc, chủng China (AY337723), chủng ghép lại để thu nhận có độ dài 1.116 bp Khi đối chiếu, phần tồn chuỗi nucleotid ARN thông tin intron intron 2, xác định dựa chủng Kết tổng hợp cấu trúc khoảng trống tạo chuỗi gen protein LMP-1 chủng EBV nucleotid chủng phần exon 1, Việt Nam trình bày bảng Bảng 2: Đặc điểm cấu trúc gen protein LMP-1 34 chủng EBV Vit Nam Ký hiệu chủng N-ớc/ độ dài độ dài ARN protein thông tin LMP1 (bp) (aa) Lãnh thổ phân lËp Toµn bé khung gen (bp) BC4 Việt Nam 1271 1116 364 268 78 87 77 761 BC5 Việt Nam 1303 1148 377 268 78 87 77 793 BC6 Việt Nam 1270 1116 364 268 78 87 76 761 EB4 Việt Nam 1301 1146 375 268 78 87 77 791 EB8 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 EB9 Việt Nam 1334 1179 386 268 78 87 77 824 EB10A Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 EB10B Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 EB61 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 EB102 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 EB103 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 HN2 Việt Nam 1337 1182 387 268 78 87 77 827 HN9 Việt Nam 1271 1116 364 268 78 87 77 761 HN11 Việt Nam 1303 1149 376 268 78 87 76 794 HN12 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 HP1 Việt Nam 1301 1146 375 268 78 87 77 791 HP2 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 độ dài E1 (bp) độ độ dài ®é dµi E2 ®é dµi dµi E3 (bp) I1 (bp) I2 (bp) (bp) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 HP3 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 HP6 Việt Nam 1271 1116 364 268 78 87 77 761 MT7 Việt Nam 1333 1179 387 268 78 87 76 824 MT8 Việt Nam 1299 1146 375 268 76 87 77 791 (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) MT9 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 MT10 Việt Nam 1301 1146 375 268 78 87 77 791 MT12 Việt Nam 1301 1146 375 268 78 87 77 791 MT14 Việt Nam 1303 1148 374 268 78 87 77 793 S1 Việt Nam 1238 1083 353 268 78 87 77 728 S5 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 S7 Việt Nam 1268 1113 364 268 78 87 77 758 S9 Việt Nam 1271 1116 364 268 78 87 77 761 S11 Việt Nam 1337 1182 387 268 77 87 77 827 S16 Việt Nam 1334 1179 386 268 78 87 77 824 S17 Việt Nam 1304 1149 374 268 78 87 77 794 S18 Việt Nam 1300 1146 375 268 78 87 76 791 S20 Việt Nam 1303 1149 376 268 78 87 76 794 (1) (Ghi chú: ký hiệu in đậm: chủng EBV nghiên cứu; E: exon; I: Intron) Toàn khung gen LMP-1 34 chuỗi nghiên cứu có kích thước dao động từ 1.238 - 1.337 bp, exon 1: 268 bp, itron 1: 76 - 78 bp, exon 2: 87 bp, intron 2: 76 - 77 bp exon 3: 728 - 827 bp Từ đó, ARN thơng tin sau ghép exon với nhau, có độ dài từ 1.083 - 1.182 bp mã hóa cho protein LMP-1 353 - 387 a.a suy diễn Kết phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc EBV dựa vào trình tự gen LMP-1 Bằng chương trình GENEDOC 2.6 MEGA 5.0, ARN thơng tin gen LMP-1 (nucleotid axít amin) chủng Việt Nam giới sử dụng để phân tích phả hệ xác lập mối quan hệ chúng Để phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc chủng EBV phân lập nghiên cứu này, sử dụng 10 chủng EBV đăng ký Ngân hàng Gen, bao gồm chủng đại diện Âu-Mỹ (Raji, Alaska, Med-, Med+, NC), số chủng đại diện phân lập nước châu Á (China 1, China 2) số chủng Việt Nam (NPC1, NPC2, NPC3) Kết cho thấy: - Nhóm I: gồm phần lớn chủng EBV nghiên cứu (20/34), bao gồm chủng phân lập miền Bắc (ký hiệu HN, EB HP), miền Trung (ký hiệu MT) miền Nam (ký hiệu S) thuộc nhóm chủng di truyền China (Trung Quốc) với chủng Việt Nam nghiên cứu trước (NPC1, NPC2, NPC3) 23 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 - Nhóm II: 9/34 chủng thuộc nhóm chủng China 2, Alaska NC - Nhóm III: 5/34 chủng thuộc nhóm chủng Med+ Med- Mặt khác, trình tự nucleotid 34 chủng nghiên cứu với 10 chủng sử dụng tham khảo đưa vào chương trình GENEDOC 2.6 để phân tích đồng (identity) thành phần nucleotid tương đồng (homology) axít amin Khi so sánh 34 chủng nghiên LMP-1 nucleotid cứu với chủng quốc tế (Raji, Alaska, Med -, Med+, NC, China 1, China 2), kết cho thấy mức độ đồng trung bình cao với chủng China (gần 95% nucleotid 94% axít amin) Bên cạnh đó, 34 chủng nghiên cứu có đồng cao với chủng khác Việt Nam (NPC1, NPC2, NPC3) đăng ký Ngân hàng Gen: > 94% nucleotid khoảng 93% axít amin (tương đương với chủng China 1) LMP-1 axít amin 24 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 Hình 2: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng EBV Việt Nam giới sở trình tự ARN thông tin chuỗi gen LMP-1 thành phần nucleotid amino axít (Ghi chú: Sử dụng chương trình MEGA5.0 (phương pháp kết nối liền kề NJ, neighbour-joining, sử dụng độ tin cậy 1000 bootstrap) Chỉ số nhánh biểu độ tin cậy phương pháp; chủng giới đại diện cho nhánh di truyền EBV đóng khung) KẾT LUẬN Kondo S, Wakisaka N, Muramatsu M et - Kích thước tồn khung gen LMP-1 34 chuỗi nghiên cứu 1.238 - 1.337 bp, từ đó, ARN thơng tin có độ dài 1.083 1.182 bp, protein LMP-1 353 - 387 a.a, exon 268 bp, itron 76 - 78 bp, exon 87 bp, intron 76 - 77 bp exon 728 - 827 bp - Trong số 34 chủng nghiên cứu tham gia xây dựng phả hệ, 20/34 chủng thuộc nhóm I gồm chủng di truyền China 1; 9/34 thuộc nhóm chủng di truyền China 2, Alaska NC; 5/34 thuộc nhóm chủng di truyền Med+ Med- - 34 chủng nghiên cứu có mức độ đồng cao nucleotid axít amin với chủng China (Trung Quốc) chủng khác Việt Nam (NPC1, NPC2, NPC3) al Epstein-Barr virus latent membrane protein induces cancer stem/progenitor-like cells in nasopharyngeal epithelial cell lines Virology Journal 2012, 85 (21), pp.11255-11264 Shair HY, Schnegg CI and Traub NR Epstein-Barr virut latent membrane protein-1 effects on plakoglobin, cell growth and migration Cancer Res 2008, 68 (17), pp.6997-7005 Young LS and Rickinson AB EpsteinBarr virus: 40 years on Nature Review 2004, 4, pp.757-768 Mainou BA, Raab-Traub N LMP1 strain variants: biological and molecular properties J Virol 2006, 80 (13), pp.6458-6468 Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S) MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likeli-hood, evolutionary distance and maximum parsimony methods Mol Biol Evol 2011, 28, pp.2731-2739 TÀI LIỆU THAM KHẢO Adham M, Kurniawan AN et al Nasopharyngeal carcinoma in Indonesia: epidemiology, incidence, signs and symptoms at presentation Chin J Cancer 2012, 31 (4), pp.185-196 Ai J, Xie Z, Liu C, Huang Z and Xu J Analysis of EBNA-1 and LMP-1 variants in diseases associated with EBV infection in Chinese children Virology Journal 2012, (13), pp.1.743-1.751 Junker AK Epstein-Barr Virus Pediatrics in Review 2005, 26 (3), pp.79-84 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 26 ... nucleotid, phân tích đặc điểm khung gen LMP-1 thu nhận chuỗi gen ARN thông tin 34 chủng EBV phân lập từ BN UTVMH Việt Nam Trình tự nucleotid, đặc điểm cấu trúc phân tử gen LMP-1 mối quan hệ nguồn gốc phả. .. 5.0, ARN thơng tin gen LMP-1 (nucleotid axít amin) chủng Việt Nam giới sử dụng để phân tích phả hệ xác lập mối quan hệ chúng Để phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc chủng EBV phân lập nghiên cứu... dựa chủng Kết tổng hợp cấu trúc khoảng trống tạo chuỗi gen protein LMP-1 chủng EBV nucleotid chủng phần exon 1, Việt Nam trình bày bảng Bảng 2: Đặc điểm cấu trúc gen protein LMP-1 34 chủng EBV Việt