Nghiên cứu tính chất biểu hiện của miRNA-141 và gene đích PTEN trên bệnh nhân ung thư vòm họng ở Việt Nam

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng miR-141 tăng biểu hiện 9,38 lần và biểu hiện PTEN giảm đáng kể trong các mẫu sinh thiết UTVH so với mẫu dịch phết lành tính. Trong nghiên cứu tiếp theo, nhóm nghiên cứu sẽ mở rộng số lượng mẫu, cũng như nghiên cứu trên các giai đoạn khác nhau của bệnh ung thư.

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA MIRNA-141 VÀ GENE ĐÍCH PTEN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG Ở VIỆT NAM Lao Đức Thuận*, Nguyễn Hoàng Danh, K’ Trọng Nghĩa, Quang Trọng Minh, Nguyễn Hoàng Nhật Minh, Hoàng Văn Nam, Lê Huyền Ái Thúy Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: thuan.ld@ou.edu.vn TÓM TẮT Gần đây, nhiều chứng cho thấy microRNA-141 (miR-141) có liên quan với ung thư vòm họng (UTVH) khả điều hòa biểu gene điều chỉnh khối u Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu biểu miR-141 bệnh nhân UTVH Việt Nam giới hạn Trong nghiên cứu này, sử dụng công cụ Tin-Sinh học, bao gồm: Pictar, TargetScan, miRDB, để dự đóa n gene đích miR-141 Kết là, PTEN (phosphatase and homolog tensin), đóng vai trị gây ung thư liên quan đến q trình sinh học dẫn đến UTVH, xác định đích trực tiếp miR-141 Sau đó, nhóm nghiên cứu đánh giá biểu miR-141 PTEN mẫu sinh thiết UTVH mẫu dịch phết lành tính Nghiên cứu chứng minh miR-141 tăng biểu 9,38 lần biểu PTEN giảm đáng kể mẫu sinh thiết UTVH so với mẫu dịch phết lành tính Trong nghiên cứu tiếp theo, nhóm nghiên cứu mở rộng số lượng mẫu, nghiên cứu giai đoạn khác bệnh ung thư Từ đó, làm sở để tiếp tục áp dụng đặc tính miR-141 PTEN chẩn đóa n, tiên lượng liệu pháp điều trị UTVH Từ khóa: Ung thư vịm họng, microRNA-141, PTEN INITIAL STUDY OF MiRNA-141 AND ITS POTENTIAL TARGETED PTEN EXPRESSION IN VIETNAMESE IN NASOPHAYNGEAL CARCINOMA PATIENTS Lao Duc Thuan*, Nguyen Hoang Danh, K’ Trong Nghia, Quang Trong Minh, Nguyen Hoang Nhat Minh, Hoang Van Nam, Le Huyen Ai Thuy Ho Chi Minh City Open University *Corresponding Author: thuan.ld@ou.edu.vn ABSTRACT Recently, accumulating evidences indicated that microRNA-141 (miR-141) is associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC) due to their abilities to affect the expression of genes that modulate tumorigenesis Unfortunately, there are still limit publication about miR-141 expression in Vietnamese nasopharyngeal cancer patients In this study, we adopted bioinformatics tools, such as Pictar, TargetScan, miRDB, etc to predict its target gene As the results, PTEN (phosphatase and tensin homolog gene), acts oncogenic role associated with biological processes lead to the nasopharyngeal carcinogenesis, was identified as the direct target of miR-141 Experimentally, we reported the evaluation of miR-141 and PTEN expression in NPC biopsy samples and non-cancerous swab 110 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học samples The present study demonstrated that miR-141 was upregulated 9,38 times and PTEN expression was significantly lowered in NPC biopsy samples compared to non-cancerous epithelial swab samples Our finding demonstrated that the miR-141 was upregulated and PTEN was down-regulated in NPC biopsy samples In the upcoming research, a larger clinical sample size from patients at each stage of the NPC will be performed to understand the expression pattern of the miR-141 and PTEN for further applied in early diagnosis and prognosis as well as therapeutic of NPC Keywords: Nasopharyngeal carcinoma, mircoRNA-141, PTEN TỔNG QUAN Ở Việt Nam, UTVH nằm loại ung thư phổ biến nhất, với 86.691 trường hợp (Age-standardized rate ASR = 1,2/100.000) 50,831 ca (ASR = 0,7/100.000) tử vong hàng năm Việt Nam1,2 Mặc dù, phương pháp chẩn đóa n UTVH cải thiện thời gian gần Tuy nhiên, hầu hết bệnh nhân UTVH chẩn đóa n với giai đoạn muộn, triệu chứng ban đầu không rõ ràng Do đó, việc tìm dấu chứng sinh học tiềm cho UTVH không cần thiết cho phát triển phương pháp chẩn đóa n mà phương pháp điều trị đầy hứa hẹn MiRNA (microRNA) phân tử RNA ngắn khoảng 20-23 nucleotide, khơng mã hóa; liên quan đến q trình điều hịa sau phiên mã nhiều gene3,4 MiRNA bảo tồn cao phát rộng rãi động vật, thực vật virus, tham gia vào nhiều trình tế bào bao gồm tăng sinh tế bào, biệt hóa, chuyển hóa, phản ứng stress q trình apoptosis4,5 miRNA điều hòa chức tế bào cách gắn vào trình tự vùng 3'-UTR (3’ untranslated region) mRNA đích, dẫn đến tăng cường ức chế biểu mRNA3,4,6 Trong thập kỷ vừa qua, chứng cho thấy miRNA có vai trị “oncogene” “tumor suppressor”, biểu bất thường (tăng giảm biểu hiện) miRNA góp phần vào q trình sinh ung người4,7-9 Sự biểu vượt mức miRNA gây ung thư, gọi onco-miRNA, phát nhiều loại ung thư người, bao gồm ung thư vịm họng, khơng phân tử mục tiêu cho điều trị mà dấu chứng sinh học quan trọng cho chẩn đóa n tầm sóa t ung thư1012 Trong số onco-miRNA, miR141, thành viên họ phân tử miR-200, nằm vị trí 12p13.31 (nt: 6964097-6964191, [+]), có vai trị quan trọng q trình sinh ung thư người13-17 Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy kết trái ngược vai trò miR-141 miRNA gây ung thư hay miRNA ức chế khối u loại ung thư khác Vì vậy, xác định rõ vai trò miR-141, đặc biệt mẫu lâm sàng, phát triển dấu chứng sinh học tiềm cho chẩn đóa n tiên lượng, ứng dụng vào điều trị lâm sàng Trong nghiên cứu miR-141 bệnh nhân UTVH, có vài nghiên cứu công bố MiR-141 khẳng định tăng biểu mẫu UTVH so với mẫu lành, ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào, trình apoptosis, tăng trưởng tế bào, di cư xâm lấn tế bào UTVH13 Mặt khác, dự đóa n gene đích miR-141, mà gene đích hoạt động gene gây ung thư gene ức chế khối u, kết hợp với miR-141, phát triển dấu 111 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 chứng sinh học tiềm cho chẩn đóa n điều trị nhắm đích Trong nghiên cứu trước đây, gene đích miR-141 xác định, bao gồm: BRD3, PTEN UBAP1; tham gia vào mạng lưới gene-miR-141 để đóng góp cho tiến triển UTVH13 Một nghiên cứu khác biểu miR-141 tăng đáng kể mô UTVH tham gia vào phát triển tế bào hình thành khối u qua trung gian BRD7 thơng qua ức chế đường truyền tín hiệu PTEN/AKT15 Do đó, miR-141 gene đích trở thành phân tử sinh học tiềm cho nghiên cứu dấu chứng sinh học cho tiên lượng, chẩn đóa n liệu pháp điều trị cho UTVH Trong nghiên cứu này, sử dụng nhiều phần mềm tin sinh học để xác định gene đích miR141, sau đó, miR-141 gene đích xác định thực nghiệm Kỷ yếu khoa học mẫu mô sinh thiết UTVH VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thu nhận mẫu vấn đề y đức Bộ mẫu sử dụng nghiên cứu bao gồm: 20 mẫu mô sinh thiết UTVH 20 mẫu dịch phết lành tính Bộ mẫu thu nhận từ bệnh nhân UTVH tình nguyện viên khỏe mạnh Bệnh viện Chợ Rẫy Tất mẫu gửi đến Khoa Mơ Bệnh Học, sau đó, chứng minh mô học phương pháp Immunohistochemistry (IHC) xác nhận UTVH Các mẫu sinh thiết UTVH kiểm tra dương tính với UTVH hematoxylin eosin (Hình 1) Tất mẫu sử dụng nghiên cứu kiểm tra mô học chấp thuận từ Hội đồng Y Đức Bệnh Viện Chợ Rẫy, định số: 516/BVCR-HDDD Hình Kiểm tra mơ học ung thư vịm họng chưa biệt hóa sử dụng để phân loại chức Phân tích Tin-sinh học Phần mềm miRBase database gene đích dự đóa n từ (http://www.mirbase.org/) sử phần mềm trực tuyến Pictar, dụng để thu nhận thông tin TargetScan 7.2 miRDB Sử dụng miR-141 Các gene đích tiềm phần mềm Cancer Gene Census đường truyền tín hiệu chúng (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/) xác định cách sử dụng phần Tumor suppressor database mềm Pictar Cùng với đó, vị trí gắn (https://bioinfo.uth.edu/ TSGene/) để miRNA gene đích xác định nhận diện gene đích “oncogene” phần mềm TargetScan 7.2 “tumor suppressor gene” DAVID 2008 Functional Annotation Tách chiết RNA tổng, Reverse Bioinformatics Microarray Analysis transcriptase PCR phát Tools (http://niaid.abcc.ncifcrf gov/) biểu miR-141 112 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học miRNA tách chiết từ mẫu mô Đánh giá biểu mRNA-PTEN sinh thiết UTVH mẫu dịch phết lành Để đánh giá biểu PTEN, tính kit mirVanaTMmiRNA việc phát cDNA mục tiêu Isolation Kit (Ambion, Life thực phương pháp ReverseTechnology), cDNA phiên mã Transcriptase PCR RNA tổng ngược từ khoảng ng RNA tổng chuyển thành cDNA việc sử dụng kit TaqMan® Advanced miRNA kit SensiFASTTM cDNA Synthesis cDNA Synthesis Kit Phát miR- Phản ứng tổng hợp cDNA bao gồm 141 thực phương pháp bước sau: 25oC 10 phút, 42oC Real-time PCR (qRT PCR), sử dụng 15 phút, 85oC phút giữ kit TaqmanTM Advanced miRNA 4oC, cDNA bảo quản -20oC assays kit (ThermoFisher Scientific) GAPDH sử dụng làm chứng nội The UniSp6 rRNA sử dụng làm nghiên cứu Trình tự cặp chứng nội cho phản ứng phát mồi sử dụng nghiên cứu miR-141 trình bày Bảng Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu Gene Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) TLTK Mồi xi CAGAAAGACTTGAAGGCGTAT PTEN Mồi 18 AACGGCTGAGGGAACTC ngược Mồi xuôi AATCCCATCACCATCTTCCA GAPDH Mồi 19 CCTGCTTCACCACCTTCTTG ngược Phân tích thống kê Kết thực nghiệm phân tích phần mềm Medcalc® Version 12.7.0.0 Tất giá trị p two-side nhỏ 0,05 xem có khác biệt Tất giá trị báo cáo Mean ± SD Sự biểu miR-141 phân tích qua trị số 2ΔΔCt Giá trị 2-ΔΔCt lớn nhỏ nhằm xác định tăng giảm biểu Phương pháp Chi-test sử dụng để xác định mối liên hệ biểu miR-141 UTVH Hơn nữa, mối tương quan biểu miR-141 nguy mắc UTVH ước tính cách tính tóa n giá trị OR, RR khoảng tin cậy 95% (CI) KẾT QUẢ Phân tích Tin-sinh học miR-141 dự đóa n gene đích miR-141 thuộc họ phân tử miR-200c, bao gồm thành viên: miR-200b, miR200c, miR-429, miR-141 miR200a Họ phân tử chia thành phân họ dựa tương đồng trình tự vùng “seed region” MiR-141 có tính bảo tồn cao nhiều loài khác nhau17, bao gồm: Pan troglodytes, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Macaca mulatta, Gorilla gorilla, Pongo pygmaeus, Pan paniscus, Monodelphis domestica Gene đích miR-141 dự đóa n từ phần mềm khác nhau, bao gồm: Pictar, TargetScan 7.2, miRDB TargetScan dự đóa n 896 gene, Pictar dự đóa n 422 gene miRDB dự đóa n 759 gene gene đích miR141 Chức gene dự đóa n từ phần mềm trên, phân tích phần mềm DAVID 2008 Functional Annotation Bioinformatics Microarray 113 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Analysis Tools Kết cho thấy rằng, hầu hết gene đích miR-141 tham gia vào nhiều đường truyền tín hiệu khác nhau, có vai trị quan trọng trình sinh ung thư, bao gồm: cell cyle, p53 signaling pathway, tight junction, Wnt signaling pathway, MAPK signaling pathway, Jak-STAT signaling pathway THẢO LUẬN UTVH bệnh phổ biến, xuất phát từ lớp biểu mơ vịm mũi họng với xuất cao miền Nam Trung Quốc Nam Á Theo số liệu toàn cầu tỷ lệ mắc tỷ lệ tử vong ung thư, UTVH xếp thứ số tất bệnh ung thư ác tính Việt Nam Cho đến nay, nhiều chứng cho thấy rối loạn chức miRNA có vai trị quan trọng tiến triển loại ung thư khác Biểu bất thường miR-141, nằm nhiễm sắc thể 12p13.31, ghi nhận nhiều loại ung thư, bao gồm: ung thư vịm họng, ung thư biểu mơ tế bào gan, ung thư đại tràng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư bàng quang, ung thư buồng trứng, ung thư vú miR-141 có vai trị kép ung thư, “oncogene” “tumor suppressor” thông qua số chế phân tử Trong nghiên cứu này, khẳng định miR-141 biểu cao mẫu sinh thiết UTVH so với mẫu dịch phết lành tính phương pháp qRT-PCR Tần số biểu miR141 mẫu bệnh 40,0%, so với 10,0% mẫu lành Giá trị 2-ΔΔCt (2-ΔΔCt = 9,38) xác định biểu miR141 cao 9,38 lần mẫu bệnh so với mẫu lành Sự tăng biểu Kỷ yếu khoa học miR-141 tương quan chặt chẽ với nguy mắc UTVH thông qua giá trị RR OR (p < 0,05) Trường hợp biểu dương tính với miR-141 có khả mắc UTVH cao gấp lần so với trường hợp khơng có biểu miR-141 (OR = 6,00; 95% CI = 1,08 - 33,28) KẾT LUẬN Bằng công cụ tin sinh học, bao gồm: Pictar, TargetScan, miRDB, DAVID 2008… sở liệu trực tuyến liệu gene ức chế khối u, liệu gene liên quan đến ung thư, chúng tơi khẳng định rằng: miR-141 tham gia điều hịa loạt đường tín hiệu liên quan đến tăng sinh, biệt hóa tế bào; Sự bất thường biểu miR-141 liên quan đến đường hình thành khối u vịm họng Gene đích chọn làm mục tiêu nghiên cứu đề tài PTEN (phosphatase and tensin homolog gene) Tiến hành thực nghiệm mẫu sinh phẩm người Việt Nam, khẳng định miR-141 tăng biểu gấp 9,38 lần mẫu UTVH so với mẫu lành PTEN giảm biểu mẫu UTVH so với mẫu lành Vì vậy, miR141 PTEN phân tử sinh học tiềm hướng tới sử dụng làm dấu chứng sinh học cho việc chẩn đóa n, tiên lượng UTVH cộng đồng người Việt Nam Trong nghiên cứu tiếp theo, nhóm nghiên cứu mở rộng số lượng mẫu, nghiên cứu giai đoạn khác bệnh ung thư, từ đó, áp dụng đặc tính miR-141 PTEN chẩn đóa n tiên lượng liệu pháp điều trị UTVH 114 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO BARTEL DP MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions Cell 2009; 136(2):215-33 CROCE CM, CALIN GA miRNAs, cancer, and stem cell division Cell 2005; 15;122(1):6-7 HE L, HANNON GJ MicroRNAs: Small RNAs with a big role in gene regulation Nat Rev Genet 2004; 5(7):522-31 MAHDAVIFAR N, GHONCHEH M, MOHAMMADIAN-HAFSHEJANI A, KHOSRAVI B, SALEHINIYA H Epidemiology and Inequality in the Incidence and Mortality of Nasopharynx Cancer in Asia Osong Public Health and Research Perspectives 2016;7(6):360-372 115 ... bao gồm: ung thư vịm họng, ung thư biểu mơ tế bào gan, ung thư đại tràng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư bàng quang, ung thư buồng trứng, ung thư vú miR-141 có vai trị kép ung thư, “oncogene”... UTVH bệnh phổ biến, xuất phát từ lớp biểu mơ vịm mũi họng với xuất cao miền Nam Trung Quốc Nam Á Theo số liệu toàn cầu tỷ lệ mắc tỷ lệ tử vong ung thư, UTVH xếp thứ số tất bệnh ung thư ác tính Việt. .. biểu bất thư? ??ng (tăng giảm biểu hiện) miRNA góp phần vào q trình sinh ung người4,7-9 Sự biểu vượt mức miRNA gây ung thư, gọi onco-miRNA, phát nhiều loại ung thư người, bao gồm ung thư vịm họng,