Bài viết Xây dựng đối chứng chuẩn cho kĩ thuật qMSP xác định tỉ lệ methyl hóa promoter LINE-1 thiết kế được 2 cặp mồi khuếch đại trình tự tham chiếu cho LINE-1 và trình tự đích nhằm khảo sát tình trạng methyl hóa LINE-1. Bằng kĩ thuật tách dòng chúng tôi đã tạo ra được hai plasmid tái tổ hợp pRefLINE1 và pMe-LINE1 chứa đoạn DNA chuẩn đại diện cho hai trình tự trên của LINE-1 bị methyl hóa sau khi biến đổi bisulfite.
VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 65-73 Original Article Development of a Standard Control for qMSP to Analyze the Methylation Status of LINE-1 Phạm Anh Thuy Duong, Pham The Tung, Tran Thi Quynh Trang, Luu Thu Phuong, Vo Thi Thuong Lan* VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam Received 03 May 2021 Revised September 2021; Accepted September 2021 Abstract: Cancer screening is an important aspect of comprehensive health care, making a significant contribution to reducing the risk of death and the cost of treating patients Finding new tumor markers with high sensitivity and specificity is a trend in the research activities in Vietnam as well as all over the world Long interspersed element-1 (LINE-1), a large proportion of repeating DNA, is transposable to different positions in the genome LINE-1 activity is controlled through DNA methylation (the CpG is attached with CH3), whereby LINE-1 is highly methylated in normal cells However, in some types of cancer such as lung, breast, stomach, liver, rectum changes in the methylation status LINE-1 have been noticed To study the methylation status of the LINE-1 sequence, we used a quantitative methyl-specific PCR technique This method requires a standard calibrator to quantify the rate of methylation From the commercial methylated DNA (CpG Methylated Human Genomic DNA, Promega), we cloned two regions of the LINE-1 promoter corresponding to a reference sequence and an investigated one (target sequence) which are bisulfite transformed As a result, we have created two recombinant plasmids, pRef-LINE1 and pMe-LINE1 The plasmids were mixed at 10% of methylation and could be used as a standard control for analyzing the DNA methylation of specimens from patients Keywords: DNA methylation, DNA repeating sequence, LINE-1, quantitative methyl-specific-PCR (qMSP), tumor markers.* * Corresponding author E-mail address: vothithuonglan@hus.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4314 65 66 P A T Duong et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 65-73 Xây dựng đối chứng chuẩn cho kĩ thuật qMSP xác định tỉ lệ methyl hóa promoter LINE-1 Phạm Anh Thùy Dương, Phạm Thế Tùng, Trần Thị Quỳnh Trang, Lưu Thu Phương, Võ Thị Thương Lan* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 03 tháng năm 2021 Chỉnh sửa ngày tháng năm 2021; Chấp nhận đăng ngày tháng năm 2021 Tóm tắt: Sàng lọc sớm ung thư khía cạnh quan trọng chăm sóc sức khỏe tồn diện, đóng góp phần đáng kể việc làm giảm nguy tử vong chi phí điều trị cho người bệnh Tìm dấu ấn ung thư với độ nhạy độ đặc hiệu cao xu hướng hoạt động nghiên cứu Việt Nam giới Các trình tự lặp phân bố hệ gen (Long interspersed element-1, LINE-1) DNA lặp lại chiếm tỉ lệ lớn có khả vận động đến vị trí khác hệ gen (genome) Sự vận động LINE-1 kiểm sốt thơng qua chế methyl hóa DNA (phức CpG gắn thêm nhóm -CH3), theo LINE-1 bị methyl hóa cao tế bào bình thường Tuy nhiên, số loại ung thư phổi, vú, dày, gan, trực tràng… thay đổi tình trạng methyl hóa LINE-1 ghi nhận Để nghiên cứu tình trạng methyl hóa trình tự LINE-1, chúng tơi sử dụng kĩ thuật real-time khuếch đại đặc hiệu methyl Kĩ thuật cần có đối chứng chuẩn để định lượng tỉ lệ methyl hóa Từ DNA methyl hóa thương mại, chúng tơi nhân dịng phân tử (tách dịng) hai vùng promoter LINE-1 tương ứng với hai trình tự tham chiếu khơng chứa CpG trình tự có vị trí CpG bị methyl hóa Kết chúng tơi tạo hai plasmid tái tổ hợp pREF-LINE1 pMe-LINE1 Các plasmid mở vòng dạng thẳng, phối trộn theo tỉ lệ 10% methyl hóa sử dụng làm đối chứng chuẩn để phân tích mẫu bệnh phẩm Từ khố: methyl hóa DNA, trình tự DNA lặp, LINE-1, khuếch đại đặc hiệu methyl định lượng (qMSP), dấu ấn ung thư Mở đầu* Methyl hóa DNA chế di truyền ngoại gen, theo gốc methyl (-CH3) gắn vào cytosine phân tử DNA, làm thay đổi hoạt động không làm biến đổi trình tự gen Ở người, tượng methyl hóa DNA xảy cytosine đứng trước guanine phức CpG, phức thường tập trung vùng promoter gen gọi đảo CpG (CpG island) [1, 2] * Tác giả liên hệ Địa email: vothithuonglan@hus.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1094/vnuees.4314 Quá trình methyl hóa DNA đóng vai quan trọng việc trì chức bình thường tế bào: ức chế gen gây khối u (oncogene), trì bất hoạt nhiễm sắc thể X, ức chế yếu tố chuyển vị,… Khi methyl hóa diễn bất thường dẫn đến biến đổi làm phát sinh tế bào ác tính [3-5] LINE-1 yếu tố chuyển vị DNA, vận động thông qua phiên mã, tổng hợp cDNA tích hợp vào vị trí khác hệ gen Sự vận P A T Duong et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 65-73 động LINE-1 kiểm soát thơng qua chế methyl hóa DNA Trong tế bào bình thường LINE-1 chiếm tỉ lệ khoảng 17% genome, bị gắn nhiều gốc CH3 nên biểu chuyển vị phiên mã bị ức chế, góp phần trì ổn định cấu trúc hệ gen [6] Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy tình trạng methyl hóa LINE-1 xem yếu tố chẩn đoán, tiên lượng loại ung thư khác [7-9] Kĩ thuật MSP lựa chọn nhiều nghiên cứu phân tích tình trạng methyl hóa DNA ưu điểm đơn giản, đặc hiệu [10] Tuy nhiên cho phép kết luận có hay khơng có methyl hóa mà khơng xác định tỉ lệ allele bị methyl hóa (đại diện cho tế bào ác tính) so với allele khơng bị methyl hóa (tế bào lành) Để khắc phục nhược điểm này, kĩ thuật định lượng realtime PCR sử dụng SYBR green (hoặc Taqman) áp dụng, gọi kĩ thuật định lượng đặc hiệu methyl qMSP [11] Phương pháp phổ biến để tính tỉ lệ methyl hóa kĩ thuật qMSP sử dụng mẫu chuẩn biết trước tỉ lệ methyl hóa, sau thơng qua cơng thức quy đổi tương quan giá trị ngưỡng (Ct) thu sau thực để tính tỉ lệ methyl hóa mẫu quan tâm [12] Mẫu chuẩn plasmid chứa trình tự biết rõ vị trí C bị methyl hóa sử dụng DNA chuẩn methyl hóa vị trí C nhờ enzyme methylase Tuy nhiên việc sử dụng DNA methyl hóa enzyme gây tốn 67 kinh phí thời gian chuẩn bị, sai số lần thực tỉ lệ methyl hóa 100% khơng dễ dàng đạt Bởi vậy, nghiên cứu mong muốn tạo mẫu chuẩn tổ hợp plasmid tái tổ hợp xây dựng dựa trình tự đích cần khảo sát tình trạng methyl hóa (trình tự đích) trình tự tham chiếu đại diện cho LINE-1 hệ gen Thực tế, mẫu chuẩn dựa vào plasmid sử dụng phổ biến đáp ứng yêu cầu ổn định, độ đặc hiệu độ nhạy phù hợp giúp đánh giá tỉ lệ methyl hóa LINE-1 mẫu bệnh phẩm [11, 12] Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu CpG Methylated Human Genomic DNA DNA hệ gen nhân người methyl hóa tồn vị trí CpG enzyme CpG Methylase (M SssI) (Promega, Code N1231) Genomic DNA tách từ mẫu mô đúc nến (FFPE) cung cấp Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Các cặp mồi tổng hợp hãng IDT với trình tự sản phẩm khuếch đại trình bày Bảng Bảng Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu Cặp mồi MIP MSP Plasmid pGEM-T Mồi Trình tự (5’ – 3’) Ref-F Ref-R Me1-F Me1-R M13F GTA AGG GGT TAG GGA GT TAT TTG GGT GGG AGT GA CGG TTT AAG AAA CGG CGT AAC GAA ATT CCG TAA ACG GTA AAA CGA CGG CCA G M13R CAG GAA ACA GCT GTA 2.2 Phương pháp Xử lí bisulfite DNA: Xử lí DNA với bisulfite nhằm mục đích biến đổi C khơng bị methyl hóa thành U C bị methyl hóa giữ nguyên CpG Methylated Human Genomic Sản phẩm khuếch đại 85 bp 82 bp 237 bp (trình tự Me1) 240 bp (trình tự Ref) DNA genomic DNA xử lí bisulfite với kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research) theo hướng dẫn nhà sản xuất Kĩ thuật MSP: phản ứng PCR thực với cặp mồi MIP MSP từ khn DNA xử lí bisulfite, sử dụng GoTaq Green Master Mix 68 P A T Duong et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 65-73 (Promega) Nồng độ mồi sử dụng cho phản ứng 0,4 µM, lượng khn sử dụng µL sản phẩm sau xử lí cho phản ứng Điều kiện phản ứng: [95 oC 10 phút, 40 chu kì (95 oC 30 giây, 59 oC 30 giây, 72 oC 30 giây), 72 oC 5’] Sản phẩm điện di gel polyacrylamide 8% Tách dòng sản phẩm PCR: sản phẩm PCR tinh kit GeneJET PCR Purification (Thermo Scientific), sau tách dịng kit InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo Scientific) Tách chiết tinh plasmid: plasmid tinh kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific), sau cắt mở vịng enzyme ScaI (1 µg DNA, 1,5 µL enzyme (10 U/µL) 37 oC giờ) Plasmid điện di gel agaros 1% Sản phẩm dạng thẳng tinh kit GeneJET Gel Extraction (Thermo Scientific) Xác định số copy plasmid: nồng độ DNA xác định phương pháp đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm máy NanoDrop (ThermoFisher) Dựa vào nồng độ chiều dài đoạn DNA, số copy tính theo cơng thức sau: Số copy = (Ax1000x9,11x1011 copy/µL)/Y Trong đó: ng/µL 1000 bp DNA = 9,1x1011 copy/µL, A: nồng độ DNA plasmid, (ng/µL), Y: kích thước plasmid bao gồm đoạn chèn (bp) Kĩ thuật real-time PCR: phản ứng real-time PCR thực với cặp mồi MIP MSP từ plasmid cắt mở vòng sử dụng GoTaq qPCR Master Mix (Promega) Nồng độ mồi sử dụng cho phản ứng 0,4 µM, lượng khn sử dụng µL Điều kiện phản ứng [95 oC 10 phút, 40 chu kì (95 oC 30 giây, 59 oC 30 giây, 72 oC 30 giây)], tín hiệu huỳnh quang đọc bước 72 oC 30 giây Xác định tỉ lệ methyl hóa theo cơng thức Livak [12]: ΔΔCt(mẫu) = ΔCt(mẫu) – ΔCt(mẫu chuẩn), ΔCt(mẫu) = Ct(MSP mẫu) – Ct(MIP mẫu) ΔCt(mẫu chuẩn) = Ct(MSP mẫu chuẩn) – C(MIP mẫu chuẩn) Tỉ lệ methyl hóa mẫu = Tỉ lệ methyl hóa mẫu chuẩn x 2-ΔΔCt(mẫu) Tính tốn thống kê: phần mềm Graphpad Prism v9.0.0 (GraphPad Software LLC) sử dụng để lập đồ thị phân tích số liệu Giá trị p0,05), không vượt 5% Đây sở để sử dụng công thức 2ΔΔCt để xác định tỉ lệ methyl hóa LINE-1 40 ΔCt Giá trị Ct 30 20 10 pRef-LINE1 pMe-LINE1 0 10^2 10^4 10^6 SC4 Nồng độ plasmid (copies/phản ứng) A SC3 SC2 SC1 Các mẫu chuẩn B Hình Đánh giá phù hợp plasmid pRef-LINE1 pMe-LINE1 để sử dụng làm mẫu chuẩn A Đường chuẩn plasmid pRef-LINE1 pMe-LINE1 B: So sánh giá trị ΔCt mẫu chuẩn P A T Duong et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 65-73 71 Bảng Các thông số đường chuẩn pRef-LINE1 pMe-LINE1 Y = -3,546xX + 36,77 Y = -3,450xX + 35,26 -3,546 -3,450 P hệ số slope