Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm khảo sát tỷ lệ đột biến gen CCR5-∆32 trên quần thể người Việt Nam khỏe mạnh và bệnh nhân nhiễm HBV. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN CCR5-∆32 HIẾM GẶP Ở NGƢỜI VIỆT NAM Nghiêm Xn Hồn*; Lê Hữu Song* TĨM TẮT Đột biến đoạn 32 bp gen CCR5 (CCR5-∆32) có liên quan đến nhiều bệnh lý nhiễm HIV, bệnh tự miễn… Tuy nhiên, đột biến chưa nghiên cứu nhiều Việt Nam Nghiên cứu tiến hành nhằm khảo sát đột biến CCR5-∆32 100 bệnh nhân (BN) nhiễm virut viêm gan B (HBV), bao gồm 50 BN viêm gan B mạn tính, 25 BN xơ gan, 25 BN ung thư gan 100 người khỏe mạnh làm nhóm chứng Xác định đột biến CCR5-∆32 kỹ thuật PCR Kết cho thấy: không phát đột biến 100 người khỏe mạnh 100 BN nhiễm HBV, đột biến CCR5-∆32 gặp người Việt Nam * Từ khóa: CCR5; Đột biến CCR5-∆32 CCR5-∆32 deletion is rare in Vietnamese population summary The CCR5 deletion mutation (CCR5-∆32) is associated with many diseases such as HIV, autoimmune diseases… However, it is still lack of data in Vietnamese population This study was investigated the prevalence of the CCR5 deletion mutation (CCR5- ∆32) in 100 patients infected with hepatitis B virus (HBV) including 50 patients with chronic hepatitis B, 25 patients with live cirrhosis, 25 patients with heppatocellular carcinoma and 100 healthy control The CCR5-∆32 was identified by using PCR assay The CCR5- ∆32 was identified by using PCR assay The result showed that there is not any case carried this mutation in our study and the CCR5-∆32 is rare in Vietnamese population * Key words: CCR5; CCR5-∆32 deletion ĐẶT VẤN ĐỀ Chemokine (C-C motif) Receptor (CCR5) thụ cảm thể hóa ứng động bạch cầu thuộc họ thụ cảm thể protein G xuyên màng, tất thụ cảm thể có domain xuyên màng (seven - transmembrane G-protein coupled receptors - GPCRs) [1, 2] Gen mã hóa cho CCR5 nằm cánh ngắn nhiễm sắc thể số 3, nơi tập hợp gen mã hóa cho nhiều thụ cảm thể hóa ứng động khác [2] Chemokine dạng thụ cảm thể chúng hình thành mạng lưới kiểm sốt, hoạt hóa tế bào lympho, đại thực bào tế bào hình Vì vậy, thụ cảm thể hóa ứng động đóng vai trò trung tâm đáp ứng miễn dịch chống lại nhiều tác nhân gây bệnh, đặc biệt đáp ứng viêm CCR5 đồng thụ cảm thể giúp HIV xâm nhập vào tế bào TCD4 đại thực bào, sở cho lây nhiễm HIV [2] * Bệnh viện TWQĐ 108 Người phản hồi (Corresponding): Lê Hữu Song lehuusongdr108@yahoo.com.vn 45 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Cho đến nay, có khoảng 74 đột biến gen mơ tả tìm hiểu, đó, đột biến CCR5-delta32 (CCR5-∆32) quan tâm nhiều [3, 4] Đột biến CCR5∆32 xuất nhiều chủng tộc người da trắng với 10 - 20% người mang kiểu gen dị hợp tử (CCR5/CCR5-∆32) 1% người mang kiểu gen đồng hợp tử (CCR5∆32/CCR5-∆32), lại không phát người châu Á, châu Phi, Trung Đông người Mỹ gốc Ấn [3, 4, 5] Sự khác tần suất xuất alen CCR5-∆32 chủng tộc giải thích, đột biến thích nghi có lợi lồi người tác nhân gây bệnh truyền nhiễm từ môi trường sống, lại yếu tố bất lợi phát triển số bệnh truyền nhiễm, có HIV [3] Theo Faure Royer-Carenzi (2008), phân bố alen đột biến phụ thuộc vào tính đa dạng di truyền vật chủ và/hoặc nhiều yếu tố môi trường nguồn bệnh tự nhiên, tạo bất lợi có lợi vật chủ mang đột biến [5] Đột biến đặc trưng đoạn 32 bp vùng gen mã hóa cho vùng nội bào thứ thụ cảm thể CCR5 tạo ba mã hóa kết thúc sớm dẫn đến protein khơng chức [4] Người ta cho đột biến CCR5-∆32 đóng vai trò ức chế HIV xâm nhập vào tế bào lympho T thay đổi đáp ứng miễn dịch số lượng phân tử trình diện kháng nguyên bề mặt tế bào liên quan đến nhiễm tiến triển đến giai đoạn AIDS BN nhiễm HIV [6] Việt Nam nước khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa, tỷ lệ bệnh truyền nhiễm nhiệt đới cao HIV, viêm gan B, C… Tuy nhiên, chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu đột biến gen Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm: Khảo sát tỷ lệ đột biến gen CCR5-∆32 quần thể người Việt Nam khỏe mạnh BN nhiễm HBV ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 100 BN viêm gan B, đó, 50 BN viêm gan B mạn tính, 25 BN xơ gan, 25 BN ung thư gan 100 người khỏe mạnh Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết ADN từ máu ngoại vi có chống đơng EDTA phenol chloroform, tủa ADN isopropanol Thực đột biến đoạn 32 nucleotide kỹ thuật PCR (Gero Hütter CS) [7] Các thành phần phản ứng sau: GoTaq Green Master Mix (Promega), mồi đặc hiệu khuếch đại gen CCR5 với trình tự CCR5-32F: 5′-CTCCCA GGAATCATCTTTACC-3′, CCR5’-32R: 5′-TCA TTTCGACACCGAAGCAG-3′ Chu trình nhiệt: 940C phút, sau 35 chu kỳ (940C/30 giây; 530C/30 giây; 720C/40 giây) 720C phút Nguyên lý phương pháp tóm tắt sau: mồi (mồi xuôi mồi ngược) đặc hiệu cho gen CCR5 thiết kế bao đoạn 32 bp dự kiến bị Điện di sản phẩm PCR gel agarose 3,5% để phân biệt kích thước băng ADN khuếch đại Trong trường hợp gen CCR5 không bị đoạn (dạng hoang dại wild type), sản phẩm PCR có kích thước 200 bp, bị đoạn 32 bp (dạng đột biến - mutation type) có kích thước 168 bp (hình 1) [7] 47 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Hình 1: Hình ảnh kết phân tích đột biến CCR5-∆32 (theo Gero Hütter CS) (Ghi chú: Marker = thang chuẩn; CCR5 (+/+) = thể hoang dại; CCR5 (+)/CCR5-∆32 = thể đột biến đoạn 32 bp dạng dị hợp tử; CCR5-∆32 (+/+) = thể đột biến đoạn 32 bp dạng đồng hợp tử) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết tối ƣu hóa điều kiện PCR Hình 2: Hình ảnh minh họa kết số mẫu sau điện di sản phẩm PCR thạch agarose 3,5% Hình ảnh điện di cho băng rõ nét, khơng có băng phụ, kích thước b»ng dự kiến, có băng với kích thước 200 bp (M = thang chuẩn; N = chứng âm) Kết giải trình tự Hình 3: Hình giải trình tự đoạn gen CCR5 cặp mồi CCR5-32F, R mẫu bệnh phẩm Không thấy đột biến đoạn 32 bp mẫu bệnh phẩm Tuy nhiên, vị trí nt 649 (NM_001100168.1) có thay đổi chèn thêm adenine 48 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Hình 4: So sánh kết giải trình tự gen CCR5 với ngân hàng gen Kết cho thấy đoạn gen thu có độ tương đồng cao (98%) với ngân hàng gen Hình 5: Hình ảnh số thay đổi đoạn gen thu so với ngân hàng gen So với ngân hàng gen, mẫu bệnh phẩm thu có điểm khác biệt Kết phân tích nhóm nghiên cứu Tất 200 mẫu, bao gồm 100 mẫu BN nhiễm HBV 100 người khỏe mạnh không thấy trường hợp mang gen CCR5 đột biến đoạn 32 bp BÀN LUẬN Bên cạnh vai trò đột biến CCR5-∆32 sinh bệnh học bệnh nhiễm trùng, người ta chứng minh vai trò quan trọng sinh bệnh học bệnh tự miễn gần cho yếu tố điều biến miễn dịch cấy ghép, bệnh mô ghép chống chủ (graft-versus-host disease - GVHD) [8, 9] Một kết nằm mong đợi điều trị bệnh kỷ HIV/AIDS đưa nhà khoa học quan tâm đến đột biến Đó nghiên cứu Hutter G CS cho thấy trường hợp điều trị HIV thành công phương pháp ghép tế bào gốc từ người cho có alen đột biến dạng đồng hợp tử CCR5-∆32/CCR5-∆32 [10] Trường hợp chữa khỏi HIV 49 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 thực chất thay hệ miễn dịch người bệnh hệ miễn dịch người cho có tế bào gốc mang gen đột biến dạng đồng hợp tử CCR5-∆32/CCR5-∆32 có khả miễn dịch tự nhiên với HIV, thơng qua ghép tủy người cho để tạo tế bào máu có tính đặc biệt đáng quan tâm, gần số nghiên cứu BN HIV/AIDS Việt Nam đề cập đến biến đổi Trong nghiên cứu đó, người ta thấy đột biến gen CCR5 vị trí S272P, G106R, C178R, W153C, R223Q S336I [11] Từ sở khoa học thú vị mà giới tìm thấy, chúng tơi hy vọng tìm vài đối tượng nhóm nghiên cứu có đột biến Tuy nhiên, với 200 đối tượng, bao gồm BN nhiễm HBV người khỏe mạnh, khơng tìm thấy đột biến đoạn Kết tương tự nghiên cứu khác phân bố elen CCR5∆32 giới Người ta cho đột biến CCR5-∆32 xuất phần lớn chủng tộc người da trắng với tỷ lệ 10 - 20% người mang kiểu gen dị hợp tử (CCR5/CCR5-∆32) 1% người mang kiểu gen đồng hợp tử (CCR5-∆32/CCR5-∆32) Trong đó, khơng phát chủng người châu Á, châu Phi, Trung Đông người Mỹ gốc Ấn [3, 4, 5] Đây thực điều đáng tiếc, ngày nay, y học phát triển, việc điều trị BN ung thư máu BN HIV/AIDS phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu đồng lồi điều hồn tồn thực được, vấn đề tìm người cho tủy phù hợp hệ thống HLA khó việc tìm người cho có kiểu gen đồng hợp tử CCR5-∆32/CCR5∆32 dường khó khăn quần thể người Việt Nam KẾT LUẬN Nhưng dù sao, với số số liệu giải trình tự đoạn gen quan tâm chúng tơi thấy có số thay đổi nucleotid đơn Do số liệu hạn chế, chúng tơi khơng bàn luận Tuy nhiên, kết Phương pháp phát đột biến CCR5∆32 kỹ thuật PCR xây dựng thành công Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108 Trong 200 đối tượng nghiên cứu, không phát trường hợp mang đột biến CCR5-∆32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Allen SJ, C.S, Handel TM Chemokine: receptor structure, interactions, and antagonism Annu Rev Immunol 2007, (25), pp.787-820 Alkhatib, G The biology of CCR5 and CXCR4 Current Opinion in HIV and AIDS 2009, 4, pp.96-103 Alison P Galvani, J.N The evolutionary history of the CCR5-D32 HIV-resistance mutation Microbes and Infection 2005, 7, pp.302-309 Gero Hütter M.N, Daniel Nowak, Stefan Klein, Harald Klüter and Wolf-K Hofmann The effect of the CCR5-delta32 deletion on global gen expression considering immune response and inflammation Journal of Inflammation 2011, (29), pp.1-8 Eric Faure, M.R.-C Is the European spatial distribution of the HIV-1-resistant CCR5-D32 allele formed by a breakdown of the pathocenosis due to the historical Roman expansion? Infection, Genetics and Evolution 2008, 8, pp.864-874 P Schliekelman C.G, M Slatkin, Natural selection and resistance to HIV Nature 2001, 411, pp.545-546 Hutter, G et al Long-term control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell 50 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 transplantation N Engl J Med 2009, 360 (7), pp.692-698 Fischereder M, L.B, Hocher B, Wuthrich RP, Rothenpieler U, Schneeberger H, Panzer U, Stahl RA, Hauser IA, Budde K et al CC chemokine receptor and renal-transplant survival Lancet 2001, 357, pp.1758-1761 Bogunia-Kubik K, Suchnicki K, Lange A CCR5 deletion mutation and its association with the risk of developing acute graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation Haematologica 2006, 91, pp.1628-1634 10 Hutter G N.D, Mossner M et al Treatment of HIV-1 infection by allogeneic CCR5-D32/D32 stem cell transplantation: a promising approach Retroviruses and Opportunistic Infections 2008 11 Luu, Q.P et al HIV type coreceptor tropism, CCR5 genotype and integrase Iihibitor resistance profiles in Vietnam: Implications for the introduction of new antiretroviral regimens AIDS Res Hum Retroviruses 28, (10), pp.1344-1348 Ngày nhận bài: 4/4/2013 Ngày phản biện đánh giá báo: 16/5/2013 Ngày báo đăng: 23/5/2013 51 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 52 ... đột biến gen mơ tả tìm hiểu, đó, đột biến CCR5-delta32 (CCR5-∆32) quan tâm nhiều [3, 4] Đột biến CCR5∆32 xuất nhiều chủng tộc người da trắng với 10 - 20% người mang kiểu gen dị hợp tử (CCR5 /CCR5-∆32) ... cứu có đột biến Tuy nhiên, với 200 đối tượng, bao gồm BN nhiễm HBV người khỏe mạnh, không tìm thấy đột biến đoạn Kết tương tự nghiên cứu khác phân bố elen CCR5∆32 giới Người ta cho đột biến CCR5-∆32. .. chủ mang đột biến [5] Đột biến đặc trưng đoạn 32 bp vùng gen mã hóa cho vùng nội bào thứ thụ cảm thể CCR5 tạo ba mã hóa kết thúc sớm dẫn đến protein không chức [4] Người ta cho đột biến CCR5-∆32