Nội dung của bài viết trình bày về quy trình giải trìn tự DNA để khảo sát tình trạng đột biến gen FLT3 trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy. Kết quả nghiên cứu cho thấy, quy trình khảo sát đột biến gen FLT3 đã được xây dựng thành công tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM, giúp việc phân nhóm tiên lượng tốt hơn cho bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 ĐỘT BIẾN GEN FLT3 TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP DỊNG TỦY KHƠNG CĨ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Phan Thị Xinh*,**, Hồng Anh Vũ* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Xây dựng quy trình giải trình tự DNA để khảo sát tình trạng đột biến gen FLT3 trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT). Đối tượng và phương pháp: Mẫu tủy xương của 18 bệnh nhân BCCDT khơng kèm bất thường nhiễm sắc thể được khảo sát đột biến gen FLT3 từ exon 14 đến exon 20 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ 05/2012 đến 05/2013. Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã khuếch đại vùng gen chứa các exon 14 đến exon 20 bằng một cặp mồi duy nhất, cho phép phát hiện hầu hết các kiểu đột biến của gen FLT3. Khảo sát trên 18 bệnh nhân, chúng tơi phát hiện 9 trường hợp (50%) có đột biến, bao gồm 6 trường hợp chèn đoạn của exon 14 và 3 trường hợp đột biến điểm của exon 16 và 20. Kết luận: Quy trình khảo sát đột biến gen FLT3 đã được xây dựng thành cơng tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM, giúp việc phân nhóm tiên lượng tốt hơn cho bệnh nhân BCCDT. Từ khóa: Gen FLT3, đột biến, bạch cầu cấp dòng tủy, nhiễm sắc thể đồ. ABSTRACT FLT3 GENE MUTATIONS IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA WITH A NORMAL KARYOTYPE Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 232 ‐ 236 Background: The aim of this study is to establish a DNA sequencing procedure for detection of FLT3 gene mutations in patients with acute myeloid leukemia (AML). Methods: Bone marrow samples of 18 AML patients with a normal karyotype were used for detection of FLT3 mutations from exons 14 to exon 20 at Blood Transfusion and Hematology Hospital from May 2012 to May 2013. Result: We successfully amplified FLT3 exons 14 to 20 using a single primer pair, which facilitate detection of almost all the known mutations in this gene. We found 9 mutations from 18 patients (50%), including 6 with internal tandem duplications within exon 14 and 3 with point mutations within exons 16 and 20. Conclusion: DNA sequencing for detection of FLT3 mutations was established at our hospital. This may help to improve the prognostic classification for AML patients. Key words: FLT3 gene, mutation, acute myeloid leukemia, karyotype. trong tủy xương. Về lâm sàng cũng như sinh ĐẶT VẤN ĐỀ học, BCCDT biểu hiện nhiều thể khác nhau Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) là gây khó khăn cho việc tiên lượng và điều trị. bệnh lý ác tính về máu, đặc trưng bởi sự tăng Nếu chỉ dựa vào các bất thường ở mức nhiễm sinh q mức và khơng biệt hóa của các tế bào sắc thể, BCCDT thường được phân thành tạo máu, gây tích tụ tế bào non trong máu và nhóm tiên lượng tốt, tiên lượng trung bình hay * Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh 232 ** Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM. ĐT: 0932728115 Email: Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 tiên lượng xấu(1,3). Theo cách phân chia này, những bệnh nhân khơng có bất thường về nhiễm sắc thể được cho là có tiên lượng trung bình. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây lại cho thấy rằng ngay trong nhóm bệnh nhân khơng có bất thường NST thì tiên lượng cũng khác nhau, tùy theo bệnh nhân có kèm theo các đột biến gen hay khơng. Gen FLT3 nằm trên nhiễm sắc thể 13, mã hóa cho thụ thể tyrosine kinase thuộc nhóm III. Đây là một trong những gen thường bị đột biến nhất trong các bệnh lý ác tính về máu(7). Đột biến thường gặp nhất của gen FLT3 là sự nhân đoạn nội tại (ITD: internal tandem duplication) thuộc exon 14 hay exon 15 của vùng cận màng(1). Các đột biến điểm tại codon 676 của exon 16 hay quanh vùng codon 835 của exon 20 cũng đã được báo cáo trong BCCDT(5). Các đột biến gen này là những đột biến tăng chức năng, góp phần quan trọng vào cơ chế bệnh sinh của BCCDT bằng cách làm cho thụ thể FLT3 được hoạt hóa liên tục, khơng còn phụ thuộc vào các phân tử truyền tín hiệu ngoại bào nữa. Bệnh nhân BCCDT với nhiễm sắc thể bình thường nhưng có mang đột biến gen FLT3 thì được xếp vào nhóm tiên lượng xấu. Mặt khác, việc ức chế hoạt tính của các protein FLT3 đột biến hứa hẹn là một mơ thức điều trị nhắm trúng đích phân tử hiệu quả trong tương lai(10). Chính vì thế, khảo sát tình trạng đột biến gen FLT3 trở nên quan trọng trong cả tiên lượng và điều trị cho bệnh nhân(8). Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình xác định đột biến gen FLT3 và mơ tả những kết quả ban đầu trên nhóm BCCDT tại Bệnh viện Truyền Máu – Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Khảo sát đột biến gen FLT3 được tiến hành trên 18 mẫu tủy xương của bệnh nhân bị BCCDT. Tất cả các bệnh nhân này khơng có bất Huyết Học Nghiên cứu Y học thường của bộ nhiễm sắc thể khi phân tích nhiễm sắc thể đồ. Phương pháp RT–PCR Mẫu tủy trong chống đơng EDTA được xử lý loại hồng cầu và RNA được tách chiết bằng RNeasy mini Kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được đo nồng độ bằng máy quang phổ kế spectrophotometer. DNA bổ sung (complement DNA hay cDNA) được tổng hợp từ 1 μg RNA với bộ hóa chất SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Mỹ). Chất lượng cDNA được kiểm tra bằng cách khuếch đại đoạn cDNA của gen beta‐actin dài 1180 bp. Để khuếch đại đoạn gen FLT3 từ exon 14 đến exon 20, chúng tôi thiết kế mồi xuôi FLT3‐F1 (5’‐ GACAACATCTCATTCTATGCAAC ‐3’) nằm trên exon 13 và mồi ngược FLT3‐R1 (5’‐ TTAGCATCAACCGGAATGCC ‐3’) nằm trên exon 22 bằng phần mềm Oligo 4.1, dựa trên trình tự chuẩn của gen FLT3 mang accession number NM_004119 trong GenBank. Polymerase dùng cho PCR là Takara Taq HS (Takara, Nhật Bản). Chương trình luân nhiệt thực hiện trên máy GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystems, Mỹ) trong 45 chu kỳ với nhiệt độ bắt cặp là 60oC. Sản phẩm PCR dài 1073 bp được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,2% có nhuộm ethidium bromide, tinh sạch bằng QIAquick Gel extraction kit (Qiagen, Mỹ). Giải trình tự chuỗi DNA Thực hiện phản ứng cycle sequencing các sản phẩm PCR đã được tinh sạch, theo hai chiều xuôi và ngược với BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ). Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi‐Di formamide, biến tính ở 960C trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP‐7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape. 233 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 KẾT QUẢ Để có thể khảo sát được các đột biến của gen FLT3, trước tiên chúng tơi chọn khuếch đại vùng mã hóa protein có chứa các exon từ 14 đến 20. Hình 1 cho thấy sản phẩm PCR tương ứng với kích thước mong đợi là 1073 bp. Sản phẩm PCR khi được giải trình tự đã cho kết quả phù hợp với gen FLT3 mang mã số NM_004119 trong GenBank. Việc khuếch đại thành công vùng gen này cho phép nhận diện hầu hết các kiểu đột biến điểm, mất đoạn hay chèn đoạn có thể xảy ra trên gen FLT3. Hình 1: Khuếch đại vùng gen FLT3 chứa exon 14 – 20. Kết quả giải trình tự DNA trên 18 bệnh được trình bày trong Bảng 1. Có 9 bệnh nhân mang đột biến gen FLT3, gồm 6 đột biến nhân đoạn nội tại của exon 14 và 3 đột biến điểm trên exon 16 và 20 (Hình 2). Hình 2: Hình ảnh các kiểu đột biến Bảng 1: Tình trạng đột biến gen FLT3 trong các mẫu nghiên cứu STT 10 11 234 Mã số nghiên cứu AML-02 AML-08 AML-22 AML-23 AML-44 AML-46 AML-47 AML-49 AML-51 AML-52 AML-57 Giới tính Nam Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Tuổi 46 10 37 34 17 35 23 14 65 Exon bị đột biến 14 20 14 14 16 Kiểu đột biến Không đột biến p.E611_F612ins13 Không đột biến Không đột biến p.D835H p.W603_E604ins8 Không đột biến p.Y597_E598ins28 Không đột biến p.N676K Không đột biến Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 STT 12 13 14 15 16 17 18 Mã số nghiên cứu AML-61 AML-78 AML-79 AML-93 AML-94 AML-95 AML-104 Giới tính Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Tuổi 41 53 68 11 54 52 BÀN LUẬN Các đột biến gen FLT3 vừa có ý nghĩa tiên lượng, vừa là đích nhắm phân tử hứa hẹn trong nghiên cứu điều trị BCCDT(3,9). Nghiên cứu này đã thành cơng trong việc xác lập quy trình hồn chỉnh để có thể xác định tình trạng có hay khơng có đột biến gen FLT3 cho bệnh nhân BCCDT tại Bệnh viện Truyền Máu – Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả ban đầu theo dõi bệnh nhân cho thấy tình trạng có đột biến gen FLT3 phù hợp với tiên lượng xấu. Bệnh nhân có mã số AML‐08, với kiểu đột biến p.E611_F612ins13 của exon 14, không đạt được lui bệnh sau đợt điều trị tấn cơng và đã tử vong. Trong tương lai, việc phát hiện đột biến FLT3 bằng kỹ thuật giải trình tự sẽ giúp chọn giải pháp ghép tủy cho những trường hợp tiên lượng xấu đã đạt được lui bệnh sau giai đoạn điều trị tấn cơng. Việc xác định được tình trạng đột biến của gen FLT3 cũng cho phép chúng ta có thể chọn bệnh nhân phù hợp tham gia các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng quốc tế với các thuốc mới nhắm đến FLT3 trong BCCDT. Kỹ thuật giải trình tự DNA trong nghiên cứu này cho phép khảo sát không chỉ riêng rẽ các exon 14, 15 và 20 mà tồn bộ vùng mã hóa protein từ exon 14 đến 20, tránh bỏ sót một số đột biến mới. Bước đầu khảo sát trên 18 bệnh nhân, chúng tôi phát hiện đột biến gen FLT3 trong 50% số trường hợp, so với 44% trong nghiên cứu của Schlenk và cộng sự thực hiện trên 438 bệnh nhân(6). Hơn nữa, chúng tôi phát hiện một trường hợp bệnh nhân có mang đột biến điểm của exon 16 (p.N676K), là đột biến gần đây được báo cáo trong nghiên cứu của Opatz và cộng sự khi sử dụng hệ thống giải Huyết Học Exon bị đột biến 14 14 20 14 Nghiên cứu Y học Kiểu đột biến Không đột biến p.V592_D593ins11 p.Y597_E598ins8 p.D835E Khơng đột biến Khơng đột biến p.F612_G613ins25 trình tự thế hệ mới để tìm đột biến trên tồn bộ các exon trong bộ gen(4). Kết quả cho thấy quy trình kỹ thuật của chúng tôi trong nghiên cứu này đáng tin cậy, có thể ứng dụng để khảo sát thêm với số mẫu lớn hơn nhằm xác định được tần suất và phổ đột biến của gen FLT3 trên bệnh nhân Việt nam. Ngoài ra, cũng cần lưu ý rằng, ngồi đột biến gen FLT3 thì bệnh nhân BCCDT với bộ nhiễm sắc thể bình thường còn có thể mang các đột biến gen khác cũng ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh, như gen NPM1 và CEPBA(2,6). Trong thời gian tới, chúng tôi sẽ tiếp tục triển khai nghiên cứu đột biến các gen này để có đầy đủ cơ sở phân nhóm tiên lượng chính xác hơn cho bệnh nhân BCCDT. KẾT LUẬN Chúng tôi đã thành công trong việc xây dựng quy trình giải trình tự chuỗi DNA để xác định đột biến gen FLT3, giúp tiên lượng bệnh nhân BCCDT. Việc ứng dụng kỹ thuật này vào lâm sàng có thể cải thiện hiệu quả điều trị trong thời gian tới. TÀI LIỆU THAM KHẢO Breitenbuecher F, Schnittger S, Grundler R, Markova B, Carius B, Brecht A, Duyster J, Haferlach T, Huber C, Fischer T (2009). Identification of a novel type of ITD mutations located in nonjuxtamembrane domains of the FLT3 tyrosine kinase receptor. Blood 23;113(17):4074‐7. Fasan A, Haferlach C, Alpermann T (2013). The role of different genetic subtypes of CEBPA mutated AML. Leukemia doi: 10.1038/leu.2013.273. Mrozek K, Heerema NA, Bloomfield CD (2004). Cytogenetics in acute leukemia. Blood Rev;18(2):115‐36. Opatz S, Polzer H, Herold T, Konstandin NP (2013). Exome sequencing identifies recurring FLT3 N676K mutations in core‐ binding factor leukemia. Blood;122(10):1761‐9. Renneville A, Roumier C, Biggio V, Nibourel O, Boissel N, Fenaux P, Preudhomme C (2008). Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature. Leukemia; 22(5): 915‐31. 235 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Schlenk RF, Dưhner K, Krauter J, Frưhling S (2008). Mutations and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. N Engl J Med; 358(18):1909‐18. Stirewalt DL, Radich JP (2003). The role of FLT3 in haematopoietic malignancies. Nat Rev Cancer;3(9):650‐65. Su L, Gao SJ, Li W, Tan YH, Cui JW, Hu RP (2013). NPM1, FLT3‐ITD, CEBPA, and c‐kit mutations in 312 Chinese patients with de novo acute myeloid leukemia. Hematology 2013 Oct 25 [Epub ahead of print]. Swords R, Freeman C, Giles F (2012). Targeting the FMS‐like tyrosine kinase 3 in acute myeloid leukemia. Leukemia;26(10):2176‐85. 236 10 Testa U, Pelosi E (2013). The Impact of FLT3 Mutations on the Development of Acute Myeloid Leukemias. Leuk Res Treatment 2013:275760. Ngày nhận bài báo: 01/11/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2013 Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014 Chuyên Đề Nội Khoa ... bị đột biến 14 20 14 14 16 Kiểu đột biến Không đột biến p.E611_F612ins13 Không đột biến Không đột biến p.D835H p.W603_E604ins8 Không đột biến p.Y597_E598ins28 Không đột biến p.N676K Không đột biến. .. tần suất và phổ đột biến của gen FLT3 trên bệnh nhân Việt nam. Ngồi ra, cũng cần lưu ý rằng, ngồi đột biến gen FLT3 thì bệnh nhân BCCDT với bộ nhiễm sắc thể bình thường còn có thể ... bị đột biến 14 14 20 14 Nghiên cứu Y học Kiểu đột biến Không đột biến p.V592_D593ins11 p.Y597_E598ins8 p.D835E Không đột biến Khơng đột biến p.F612_G613ins25 trình tự thế hệ mới để tìm đột biến trên tồn bộ