Nội dung bài viết trình bày về bằng kỹ thuật nhuộm băng G khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho B trẻ em tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM. Nghiên cứu tiến hành từ tháng 1/2012 đến tháng 5/2013 có 64 bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho B được cấy nhiễm sắc thể sử dụng mẫu tủy hoặc mẫu máu đủ tiêu chuẩn cấy.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP DỊNG LYMPHO B Ở TRẺ EM BẰNG KỸ THUẬT NHUỘM BĂNG G Nguyễn Trần Nam An*, Nguyễn Hồng Xuyến*, Phan Cao Thanh Thảo*, Trần Thị Trúc Thanh*, Phan Thị Xinh** TĨM TẮT Mục tiêu: Bằng kỹ thuật nhuộm băng G khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể (NST) trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho B (BCCDL‐B) trẻ em tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM. Đối tượng và phương pháp: Từ tháng 1/2012 đến tháng 5/2013 có 64 bệnh nhân (BN) BCCDL‐B được cấy NST sử dụng mẫu tủy hoặc mẫu máu đủ tiêu chuẩn cấy. Mẫu được cấy trong mơi trường RPMI‐1640 có bổ sung FBS, kháng sinh và PHA‐LCM. Tế bào được thu hoạch, chuẩn bị tiêu bản, xử lý với trypsin và nhuộm Giemsa. Kết quả: Trong 64 BN được cấy NST có 47 BN được cấy thành cơng chiếm tỷ lệ 73,4%. Kết quả phân tích NST đồ cho thấy 36,2% BN có bất thường NST thuộc nhóm tiên lượng tốt và 63,8% BN thuộc nhóm tiên lượng khơng tốt. Trong nhóm tiên lượng tốt, bất thường liên quan đến 12p chiếm tỷ lệ 23,4%, bất thường số lượng NST > 50 NST chiếm 12,8%. Có 10 BN có bộ NST bình thường chiếm 21,3%. Các chuyển vị t(1;19)(q23;p13), t(9;22)(q34;q11), t(4;11)(q21;q23) được phát hiện với tỷ lệ tương ứng là 6,4%, 4,2%, 2,1% thuộc nhóm tiên lượng khơng tốt. Kết luận: Kỹ thuật nhuộm băng G cho phép phát hiện hầu hết các bất thường NST gồm bất thường về cấu trúc và số lượng trong bệnh BCCDL‐B ở trẻ em. Mặc dù số mẫu chưa lớn nhưng kết quả của nghiên cứu góp thêm dữ liệu giúp các bác sĩ lâm sàng lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho BN BCCDL‐B trẻ em. Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng lympho B, bất thường nhiễm sắc thể, nhuộm băng G ABSTRACT DETECTION OF CHROMOSOMAL ABNORMALITIES IN CHILDHOOD B‐CELL ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA USING G‐BANDING Nguyen Tran Nam An, Nguyen Hong Xuyen, Phan Cao Thanh Thao, Tran Thi Truc Thanh, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 179 ‐ 183 Objective: To detect chromosomal abnormalities in childhood B‐cell acute lymphoblastic leukemia (B‐ALL) using G banding technique in Blood Transfusion and Hematology Hospital in Ho Chi Minh City. Subjects and Methods: From January 2012 to May 2013, 64 eligible bone marrow or blood samples were cultured in RPMI‐1640 medium supplemented with FBS, antibiotics and PHA‐LCM. Cells were harvested, prepared specimens, treated with trypsin and stained with giemsa Results: Among 64 patients, 47 patients (73.4%) were successfully harvested with enough metaphase cells to analyze. The results of karyotype analysis showed that 36.2% patients with abnormal chromosomes belong to the standard risk group and 63.8% of patients belong to the high risk group. In the * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932728115 ** Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh Email: phanthixinh@yahoo.com 179 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 standard risk group, 12p abnormalities and hyperdiploidy > 50 chromosomes were 23.4% and 12.8%, respectively. 10 patients were found with normal chromosomes, occupying 21.3%. The translocation of t(1;19)(q23;p13), t(9;22)(q34;q11), t(4;11)(q21;q23) were detected in 6.4 %, 4.2%, 2.1% respectively, which belong to the high risk group. Conclusions: G banding technique allows to detecting most structural and numerical chromosomal abnormalities in children B‐ALL. Although amount of samples are not large, the results of this study can help clinical doctor in selecting suitable regimen for treatment of B‐ALL patients. Keywords: B‐cell acute lymphoblastic leukemia, chromosomal abnormality, G‐banding. ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) đặc trưng bởi sự gia tăng quá mức của các tế bào lympho chưa trưởng thành, lấn át các tế bào bình thường trong tủy xương gây nhiễm trùng, thiếu máu, xuất huyết. BCCDL có nhiều thể khác nhau và có thể được phân loại dựa vào hình thái tế bào, dấu ấn miễn dịch và các kỹ thuật di truyền phân tử (5). Bệnh BCCDL chiếm 76% các bệnh bạch cầu ở trẻ em (5), tuy nhiên cũng gặp ở người trưởng thành và chiếm khoảng 20% bệnh bạch cầu cấp ở người lớn (5). Ngoài những nghiên cứu về lâm sàng, những hiểu biết ngày càng sâu sắc về bệnh trong lĩnh vực di truyền học phân tử, các bất thường NST và gen cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc chẩn đốn, phân nhóm tiên lượng, giúp lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp và theo dõi điều trị đối với BCCDL (2,9,10). Hơn 75% trường hợp BCCDL được đánh giá tiên lượng và phân nhóm điều trị dựa trên bất thường về số lượng NST, các kiểu tái sắp xếp NST chuyên biệt hay các thay đổi di truyền ở mức độ phân tử (5). Ngày nay, những kỹ thuật di truyền học phân tử như NST đồ, lai tại chỗ phát huỳnh quang (Fluorescent in situ hybridization: FISH) và RT‐PCR (reverse transcriptase‐polymerase chain reaction) đã trở thành những xét nghiệm thường quy trong chẩn đoán các bất thường NST và gen cho bệnh nhân (BN) ung thư máu nói chung và bệnh BCCDL nói riêng. Mặc dù, kỹ thuật FISH và RT‐PCR có độ nhạy cao và cho kết quả nhanh nhưng khơng khảo sát được tất cả các bất thường vì chỉ sử dụng đoạn dò đặc hiệu. 180 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Với kỹ thuật NST đồ, bộ nhiễm sắc thể được phân tích về số lượng, hình dạng, cấu trúc và các chuyển vị nhiễm sắc thể nên có thể phát hiện bất thường về số lượng NST, bất thường phức tạp. Có nhiều phương pháp nhuộm băng nhưng băng G được ưu tiên sử dụng tại các phòng xét nghiệm NST… Tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học (BVTMHH), kỹ thuật nhuộm băng G được sử dụng như là xét nghiệm thường quy giúp nhận diện hầu hết các kiểu bất thường NST. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng kết các bất thường NST để thấy được các dạng bất thường NST thường gặp trong BCCDL tại BVTMHH. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Sáu mươi bốn BN trẻ em (≤ 15 tuổi) được chẩn đốn BCCDL‐B dựa vào tủy đồ và dấu ấn miễn dịch có làm xét nghiệm NST đồ tại BVTMHH TP.HCM từ tháng 1/2012 đến tháng 5/2013. Chỉ có những BN được chẩn đốn BCCDL ngun phát mới được phân tích trong nghiên cứu này. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả loạt ca Phương pháp tiến hành Một đến 2 mL tủy xương hoặc 5 mL máu ngoại biên (nếu tế bào non hiện diện trong máu ≥ 10%) trong chống đông heparin 300UI được chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 1 tiếng đồng hồ. Đếm và cấy 2 x 107 tế bào trong 10 mL mơi trường RPMI‐1640 chứa 10% FBS, 1% Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 kháng sinh, bổ sung 300 μL PHA‐LCM (Phytohemagglutinin – lymphocyte ‐ conditioned medium). Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 1 ‐ 2 ngày đối với mẫu tủy và 2 ‐ 3 ngày đối với mẫu máu. Sau khi ngừng phân bào bằng dung dịch demecolcine, màng tế bào được phá hủy bằng dung dịch nhược trương KCl 0,075M và cố định với dung dịch Carnoy (Methanol: Acid Acetic = 1: 3). Cặn tế bào được rửa sạch và chuẩn bị tiêu bản NST. Tiêu bản sau khi nướng ở 600C trong 4 tiếng đồng hồ, được xử lý với trypsin 0,1% trong khoảng thời gian thích hợp, nhuộm Giemsa và đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học. Đối với mỗi BN, trung bình 20 tế bào được phân tích sử dụng phần mềm Ikaros (MetaSystems, Đức). Trong trường hợp cấy khơng mọc, mẫu sẽ được cấy lại khoảng 3 – 4 ngày sau khi cấy lần 1 dù BN đã được điều trị bằng corticosteroid. KẾT QUẢ Từ tháng 1/2012 đến tháng 5/2013 có 64 BN BCCDL‐B trẻ em được cấy NST và 47 BN cấy thành cơng chiếm tỷ lệ 73,4%. Kết quả phân tích NST đồ cho thấy trong 47 BN có 17 BN thuộc nhóm tiên lượng tốt chiếm 36,2%, 30 BN thuộc nhóm tiên khơng tốt chiếm tỷ lệ 63,8%. Kết quả phân nhóm tiên lượng của BN được trình bày ở Bảng 1. Nghiên cứu Y học đa bội >50 NST gặp trong 6 BN chiếm 12,8% (Hình 1). Hình 1: 60,XXY,+4,+5,+6,+7,+11,+13,+13,+17,+18,+21,+21,+ 21,+22 Bất thường liên quan đến 12p gặp trong 11 BN, chiếm 23,4% (Bảng 2), trong đó chuyển vị t(12;21)(p13;q22) gặp trong 9 BN (19,1%) gồm 4 BN có t(12;21)(p13;q22) đơn độc (Hình 2) và 5 BN có t(12;21)(p13;q22) đi kèm với bất thường khác như +21, add(4)(q35). Ngồi ra, có 1 BN có der(12)t(12;21)(p11;q11) và 1 BN có del(12)(p13) (Bảng 2). Bảng 2: BN BCCDL‐B trẻ em có bất thường liên quan đến 12p STT Nam Bảng 1: Bảng phân nhóm tiên lượng của BN BCCDL‐B trẻ em. Nhóm tiên lượng Kiểu bất thường Số BN % theo nhóm (%) tiên lượng >50 NST (12,8) Tốt Bất thường liên quan 11 (23,4) đến 12p 47 – 50 NST (14,9) NST bình thường 10 (21,3) t(9;22)(q34;q11) (4,2) Không tốt t(4;11)(q21;q23) (2,1) t(1;19)(q23;p13) (6,4) Các bất thường khác (14,9) Tổng 47 (100) 36,2 63,8 100 Những bất thường thuộc nhóm tiên lượng tốt gồm bất thường số lượng và bất thường về cấu trúc thường gặp liên quan đến 12p. Bộ NST Nữ 2010 2009 2008 2008 2009 2008 2001 2010 2010 10 2008 11 2008 Bất thường NST 46,XX,der(12)t(12;21)(p11;q11)[11]/ 46,XX[4] 46,XX,der(12)t(12;21)(p13;q22)[5]/ 47,XX,der(12)t(12;21)(p13;q22),+21[3]/ 46,XX[3] 46,XX,t(12;21)(p13;q22)[10]/ 46,XX[2] 46,XX,t(12;21)(p13;q22)[5] 46,XX,t(12;21)(p13;q22)[6] 46,XY,add(4)(q35),t(12;21)(p13;q22)[7]/ 46,XY,t(12;21)(p13;q22)/46,XY[6] 46,XY,del(12)(p13)[8]/46,XY[8] 46,XY,t(12;21)(p13;q22)[10]/46,XY[4] 47,XY,t(12;21)(p13;q22),+21[10] 47,XY,t(12;21)(p13;q22),+21[3]/ 46,XY,t(12;21)(p13;q22)[12] 47,XY,t(12;21)(p13;q22),+21[5]/ 46,XY,t(12;21)(p13;q22)[10]/46,XY[5] 181 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học Hình 2: Chuyển vị t(12;21)(p13;q22) Trong 30 BN thuộc nhóm tiên lượng khơng tốt, có 7 BN có bộ NST 47 – 50 NST (14,9%), 10 BN có bộ NST bình thường (21,3%), 6 BN có chuyển vị NST gồm t(1;19)(q23;p13), t(9;22)(q34;q11) (Hình 3), t(4;11)(q21;q23) với tỷ lệ tương ứng là 6,4%, 4,2%, 2,1%, và 7 BN có bất thường NST khác (Bảng 1). Chuyển vị t(1;19)(q23;p13) có 2 dạng cân bằng (Hình 4) và khơng cân bằng. Các bất thường NST khác gặp trong nghiên cứu này là del(X)(q26), +der(7)t(X;7), t(3;7)(q27;q32), del(2)(p22), del(8)(q21). Hình 3: Chuyển vị t(9;22)(q34;q11) Hình 4: Chuyển vị t(1;19)(q23;p13) cân bằng BÀN LUẬN Kết quả cấy mọc nghiên cứu trong chúng tôi là 73,4% cho thấy việc cấy NST thành công trong BCCDL‐B là khó khăn, phù hợp với nhận định của một số nghiên cứu khác (4). Thời gian từ lúc lấy mẫu cho đến lúc cấy là quan trọng, nếu để hơn 2 tiếng đồng hồ thường cấy thất bại hoặc sai lệch kết quả do dòng tế bào bình thường mọc nhiều hơn (8). Một số trường hợp khác ngay lúc chẩn đốn số lượng bạch cầu tăng cao cấy khơng mọc nhưng cấy lại sau 3 ‐ 5 ngày điều trị với corticosteroid làm giảm số lượng bạch cầu thì cấy thành cơng, cho thấy số lượng bạch cầu cao cũng là một yếu tố khơng thuận lợi cho việc cấy NST. Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng bất thường NST lúc chẩn đốn là một trong những yếu tố phân nhóm nguy cơ, có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị BCCDL‐B ở trẻ em (6,9). Kết quả phân tích trên 47 BN cho thấy bất thường NST thuộc nhóm tiên lượng tốt và không tốt tương ứng là 36,2% và 63,8% (Bảng 1). Chuyển vị t(12;21)(p13;q22) gặp trong 9 BN (19,1%) và là chuyển vị NST thường gặp nhất trong BCCDL‐B. Tỷ lệ của t(12;21) trong nghiên cứu này tương đồng với các nghiên cứu khác trên thế giới (10,1). Đa bội với số lượng NST > 50 chiếm 12,8% thấp hơn so với báo cáo của Mrózek K và các nghiên cứu 182 Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 khác (5,3) có thể do cỡ mẫu trong nghiên cứu còn nhỏ. Chuyển vị t(1;19), t(4;11) và t(9;22) chiếm tỷ lệ lần lượt là 6,4%, 2,1%, 4,2% tương đồng với các nghiên cứu khác trên thế giới (5,3). Các bất thường NST thuộc nhóm tiên lượng khơng tốt còn liên quan đến nhiều NST khác nhưng trong nghiên cứu này chúng tơi chỉ phát hiện thêm bất thường của NST X, 2, 3, 7, 8, còn các bất thường khác như t(2;8), t(8;14), t(8;22) và del(9p) chưa tìm thấy. Đây là số liệu ban đầu trên mẫu nghiên cứu nhỏ, cần nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn để có một dữ liệu đầy đủ về bất thường NST trên BCCDL‐B tại Việt Nam. Nghiên cứu Y học TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Bước đầu thực hiện nuôi cấy trên 64 BN BCCDL‐B cho thấy tỉ lệ cấy NST thành cơng trong BCCDL khơng cao, chỉ chiếm 73,4%. Tuy nhiên, kết quả phân tích NST đồ nhận diện được các bất thường NST đa dạng như đa bội, thiểu bội, bất thường cấu trúc NST khác ngoài 4 kiểu chuyển vị NST thường gặp nên thuận lợi cho việc phân nhóm tiên lượng. Cần có nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn, thời gian khảo sát dài hơn kết hợp với các kỹ thuật di truyền phân tử khác để có dữ liệu đầy đủ hơn về bất thường NST của BN BCCDL‐B trẻ em tại BVTMHH TP.HCM. 10 Carroll ƯL, Bhojwani D, et al (2003). Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia. ASH Education Book; 1: 102‐131. Hilden JM, Dinndorf PA, Meerbaum SO, et al (2006). Analysis of prognostic factors of acute lymphoblastic leukemia in infants: report on CCG 1953 from the Childrenʹs Oncology Group. Blood; 108:441‐451. Mrozek K, Heerema NA, Bloomfield CD, et al (2004). Cytogenetics in acute leukemia. Blood; 18: 115‐136. Padhi S, Sarangi R, et al (2011). Cytogenetic profile of pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL): analysis of 31 cases with review of literature. Caryologia; 64(1): 33‐41. Pui C‐H, et al (1998). Acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med; 339(9):605‐615. Pui C‐H, Relling MV, et al (2004). Acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med;350:1535‐1548. Raimondi SC (1993). Current status of cytogenetic research in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood; 81: 2237‐2251 Rooney DE (2000). Human Cytogenetics: malignancy and acquired abnormalities. Oxford University Press; 1:1‐26. Schultz1 KR, Pullen DJ, et al (2007). Risk‐and response‐based classification of childhood B‐precursor acute lymphoblastic leukemia: a combined analysis of prognostic markers from the Pediatric Oncology Group (POG) and Childrenʹs Cancer Group (CCG). Blood; 109:3926‐3935. Teitell MA and Pandolfi PP, et al (2009). Molecular Genetics of Acute Lymphoblastic Leukemia Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis; 4:175–198. Ngày nhận bài báo: Ngày phản biện: 15 tháng 8 năm 2013 04 tháng 9 năm 2013 Ngày bài báo được đăng: 22 tháng 10 năm 2013 183 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học ... kiểu b t thường NST. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng kết các b t thường NST để thấy được các dạng b t thường NST thường g p trong BCCDL tại BVTMHH. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... phân tích về số lượng, hình dạng, cấu trúc và các chuyển vị nhiễm sắc thể nên có thể phát hiện b t thường về số lượng NST, b t thường phức tạp. Có nhiều phương pháp nhuộm b ng nhưng b ng G được ưu tiên sử dụng tại các phòng xét ... ở trẻ em (5), tuy nhiên cũng g p ở người trưởng thành và chiếm khoảng 20% b nh b ch cầu cấp ở người lớn (5). Ngoài những nghiên cứu về lâm sàng, những hiểu biết ngày