Tiêu chuẩn hóa cao chiết và viên nang bổ dương hoàn ngũ thang

Đề tài này được tiến hành để khảo sát các thông số lý hóa, xác định sự hiện diện của các dược liệu, định lượng saponin, protein toàn phần trong cao chiết và thành phẩm để làm cơ sở cho các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng tiếp theo.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT VÀ VIÊN NANG BỔ DƯƠNG HOÀN NGŨ THANG Trương Hữu Nhàn*, Trần Thị Bạch Tuyết*, Phan Quan Chí Hiếu**, Nguyễn Phương Dung**, Bùi Mỹ Linh**, Phạm Thị Mỹ Nhung***, Trần Phúc Vinh*** TÓM TẮT Đặt vấn đề - Mục tiêu nghiên cứu: Bài thuốc Bổ dương hoàn ngũ thang (BDHNT) sử dụng điều trị phục hồi liệt vận động sau đột quị dạng thuốc sắc Để việc sử dụng thuốc tiện lợi hơn, bệnh viện Y học cổ truyền tỉnh Bình phước bào chế dạng viên nang Đề tài tiến hành để khảo sát thông số lý hóa, xác định diện dược liệu, định lượng saponin, protein toàn phần cao chiết thành phẩm để làm sở cho thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Cao chiết viên nang BDHNT cung cấp Bệnh viện Y học cổ truyền tỉnh Bình phước Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để xác định diện nguyên liệu chế phẩm Áp dụng phương pháp cân để định lượng saponin, protein toàn phần cao chiết chế phẩm Kết quả: Cao chiết viên nang BDHNT đạt yêu cầu độ ẩm, độ tro, pH, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn, độ rã, độ đồng khối lượng quy định Dược điển Việt Nam IV Trên hình ảnh sắc ký đồ chế phẩm cho thấy có diện loại dược liệu Hàm lượng saponin toàn phần cao chiết viên nang BDHNT 80mg/1 g 40 mg/viên Hàm lượng protein toàn phần cao chiết viên nang BDHNT 180mg/1 g 90 mg/viên Kết luận: Đã áp dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng phương pháp cân tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm chất lượng viên nang BDHNT Từ khóa: Bổ Dương Hồn Ngũ Thang, phương pháp sắc ký lớp mỏng, saponin toàn phần, phương pháp cân ABSTRACT STANDARDIZATION OF BO DUONG HOAN NGU THANG EXTRACT AND CAPSULE Truong Huu Nhan, Tran Thi Bach Tuyet, Phan Quan Chi Hieu, Nguyen Phuong Dung, Bui My Linh, Pham Thi My Nhung, Tran Phuc Vinh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No – 2012 : 207 –212 Background – Objectives: Bo Duong Hoan Ngu Thang (BDHNT) is a traditional remedy that have been used in the rehabilitation of motor deficit after stroke To increase user-friendly, Traditional Medicine Hospital in Binh Phuoc province have changed this remedy into capsule This study was conducted for determining technical standards and analysing main chemical components from Bo Duong Hoan Ngu Thang extract and capsule Materials & Methods: BDHNT extract and capsules were supplied by Traditional Medicine Hospital in Binh Phuoc provice Thin layer chromatography method was used to dertermine the presence of herbal medicines in BDHNT extract and capsules Results: BDHNT extract and capsules are fit to standards of humidity, ashes, pH, heavy metal residues, * Bệnh viện Y học Cổ truyền tỉnh Bình Phước ** Khoa Y học cổ truyền - Đại học Y Dược Tp HCM *** Công ty Cổ phần Dược phẩm Khang Minh Tác giả liên lạc: BS Trương Hữu Nhàn, ĐT: 0913109196 Email: truonghuunhan63@yahoo.com.vn Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 207 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 bacterial contamination… mentioned in VietNam Pharmacopea IV All medicinal herbals in BDHNT remedy were shown on thin layer chromatography plaques The total saponins of extract and capsules were 80 mg/1 g and 40 mg/capsule The total protein of extract and capsule were 180 mg/1 g and 90 mg/capsule Conclusion: Used thin layer chromatography and balanced methods to standardise and evaluate quality of BDHNT extract and capsule Keywords: Bo Duong Hoan Ngu Thang, thin layer chromatography method, balanced method, total saponin ĐẶT VẤN ĐỀ Đột quị nhóm bệnh gây tử vong cao tàn tật nặng nề phổ biến Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ khoa học kỹ thuật làm giảm tỉ lệ tử vong số BN đột quị, song song sống sót tàn phế tăng(7) Bệnh nhân sau đột quị thuộc loại đa tàn tật Tùy theo tình trạng khiếm khuyết thần kinh, nội dung phục hồi chức sau đột quị thường phục hồi nhận thức, phục hồi trí nhớ, phục hồi vận động Nội dung phục hồi chức vận động thường phổ biến quan tâm nhiều có liên quan chặt chẽ đến hoạt động sống lao động hàng ngày bệnh nhân(6) Bài thuốc BDHNT (gồm dược liệu Hoàng kỳ, Đương quy vĩ, Xích thược, Đào nhân, Xuyên khung, Hồng hoa, Địa long) có xuất xứ từ sách Y lâm cải thác, chuyên chữa chứng bệnh bán thân bất toại, nhãn oa tà, trở ngại ngôn ngữ, sau trúng phong YHCT (di chứng liệt nửa người, miệng méo, mắt xếch, nói ngọng đột quị – theo quan niệm tây y)(10), Tại Việt Nam, số tài liệu khoa học có đưa việc sử dụng thuốc BDHNT để phối hợp với phương pháp khác nhằm điều trị phục hồi liệt vận động bệnh nhân sau đột quị(2,6,9,5,8) Dạng bào chế cổ truyền thuốc BDHNT thuốc sắc nên có số bất lợi, như: mùi, vị thuốc khó uống; bảo quản, dự trữ dược liệu thường khó khăn, dễ bị ẩm mốc; nhiều thời gian ngày không phù hợp với nhịp sống công nghiệp Một chế phẩm sử dụng an tồn, có hiệu quả, tiện lợi phục hồi chức vận động bệnh nhân sau đột quị cần thiết Bệnh viện Y học cổ truyền tỉnh Bình Phước chuyển dạng thuốc thành viên 208 nang Nghiên cứu thực để tiêu chuẩn hóa chất lượng cao chiết viên nang BDHNT, tiền đề cần thiết cho thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu Các dược liệu (Hồng kỳ, Đương quy vĩ, Xích thược, Xuyên khung, Đào nhân, Địa long, Hồng hoa) đạt tiêu chuẩn theo DĐVN IV(3), riêng tiêu soi bột dược liệu Hoàng kỳ đạt yêu cầu theo Dược điển Trung Quốc (2005)(4) Cao khô BDHNT dạng cao khô: bột mịn, đồng nhất, màu nâu, mùi thơm dược liệu Mỗi g bán thành phẩm chứa: Hoàng kỳ 3463 mg, Đương quy vĩ 577 mg, Xuyên khung 288 mg, Xích thược (rễ) 433mg, Đào (hạt) 288 mg, Hồng hoa 288 mg, Địa long (Giun đất) 288 mg, magnesi stearat vừa đủ Viên nang BDHNT (lô sản xuất 020211NC, ngày sản xuất 15/02/2011) Thành phần dược liệu cho viên nang số gồm: Hoàng kỳ 2000 mg, Đương quy vĩ 333mg, Xuyên khung 166,6 mg, Xích thược (rễ) 250 mg, Đào (hạt) 166,6 mg, Hồng hoa 166,6 mg, Địa long (Giun đất) 166,6 mg, magnesi stearat vừa đủ Trang thiết bị, dụng cụ Tủ sấy Memmert, lò nung Carbolite CSF 1200 (Anh) FLF 11/14, bếp cách thuỷ Memmert ULM-500, kính hiển vi Olympus CH-20, cân phân tích Statorius, máy đo độ ẩm Shimadzu EB 340 MOC (Nhật), máy quang phổ UV – 1700 Shimadzu, cân Mettler AE 200, đèn tử ngoại Camag, lò nung Heraeus, tủ sấy JSON 20, máy chụp hình Panasonic, dụng cụ sắc ký lớp Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 mỏng, mỏng silica gel GF254, dụng cụ phá mẫu chưng cất đạm Phương pháp nghiên cứu Xác định độ khối lượng làm khô (DĐVN IV, Phụ lục 9.6): dùng g chế phẩm thử nghiệm, nhiệt độ 105oC 30 phút Xác định cắn không tan nước: thực với g chế phẩm, pha lọc bình nón 200 ml, rửa cắn giấy lọc giấy lọc không màu Làm khô giấy lọc nhiệt độ 105oC Xác định độ tro tồn phần, tro khơng tan acid, tro sulfat, tro tan nước (DĐVN IV, phụ lục 9.8, 9.7, 9.9, 9.10): dùng 1g chế phẩm Xác định độ pH (DĐVN IV, phụ lục 6.2): dùng dung dịch 10% chế phẩm Xác định kim loại nặng (DĐVN IV, phương pháp 3, phụ lục 9.4.8) Xác định giới hạn nhiễm khuẩn (DĐVN IV, phụ lục 13.6, trang PL-258): phương pháp đĩa thạch(3) Xác định độ rã (DĐVN IV, phụ lục 11.6): thực phép thử độ rã viên nén viên nang Xác định độ đồng khối lượng (DĐVN IV, phụ lục 9.6): phương pháp Định tính phương pháp SKLM (DĐVN IV, Phụ lục 5.4): xác định diện Hồng kỳ, Xích thược, Đương quy vĩ, Xuyên khung, Hồng hoa, Địa long Định lượng Định lượng saponin tồn phần (1) Cân xác khoảng 5g chế phẩm cho vào bình nón nút mài 250 ml, thêm 50 ml methanol (TT), đun sôi hồi lưu cách thủy 30 phút Để nguội, lọc lấy dịch methanol Chiết tiếp bã lần nữa, lần với 30 ml methanol 15 phút Gộp dịch chiết methanol đem bốc cách thủy đến cắn Hòa tan cắn với 20 ml nước cho vào bình chiết, tráng cốc với 10 ml nước Lắc kỹ bình chiết với n - butanol bão hòa nước lần, lần 20 ml Gộp dịch n-butanol cho vào Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Nghiên cứu Y học cốc cân bì, đem bốc cách thủy đến cắn Sấy cắn 100 – 105 oC Lấy để nguội bình hút ẩm cân nhanh Tính tỷ lệ cắn (hàm lượng saponin tồn phần) gam theo công thức: X ( mg / g )  a m Trong đó: X : Hàm lượng saponin toàn phần g; a : Khối lượng cắn thu sau sấy (mg); m : Khối lượng mẫu đem chiết trừ độ ẩm (mg) Định lượng protein (tiến hành theo phương pháp 1, phụ lục 10.9, DĐVN IV): Cân xác khoảng 0,5 g chế phẩm cho vào bình Kjeldahl, tiến hành vơ hóa chưng cất Dùng dung dịch acid sulfuric 0,1N (CĐ) dung dịch natri hydroxyd 0,1N (CĐ) Cơng thức tính: X (mg/g) = (b-a) x 1,4 x 6,25/P Trong đó: a, b : Thể tích dung dịch natri hydroxyd 0,1N (CĐ) dùng cho mẫu thử mẫu trắng (ml); P : Khối lượng bột đem thử nghiệm trừ độ ẩm (mg) KẾT QUẢ Tiêu chuẩn hóa tiêu lý hóa cao chiết viên nang BDHNT Bảng Độ ẩm cao viên nang BDHNT Số lần lặp lại thí Độ ẩm trung nghiệm bình (%) Cao BDHNT 4,3 Viên nang 4,2 BDHNT Chế phẩm Tiêu chuẩn ≤5 ≤5 Độ ẩm cao viên nang BDHNT đạt yêu cầu quy định Dược điển Việt Nam dành cho cao khô viên nang Bảng Độ tro, cắn không tan nước, pH, giới hạn kim loại nặng cao BDHNT Chỉ tiêu Cao BDHNT Tiêu chuẩn Tro toàn phần (%) 8,55 ≤ 10 Tro không tan acid (%) 5,0 ≤6 Tro sulfat (%) 4,8 ≤6 Tro tan nước (%) 1,9 ≤4 Cắn không tan nước (%) 24,85 ≤ 26 pH dung dịch 10% 4,35 4,0 – 5,5 Giới hạn kim loại nặng (ppm) < 20 ≤ 20 209 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học Độ tro, cắn không tan nước, pH dung dịch 10%, giới hạn kim loại nặng cao BDHNT đạt yêu cầu Dược điển Việt Nam Bảng Độ rã, độ đồng khối lượng viên nang BDHNT Chỉ tiêu Thời gian rã (phút) Khối lượng bột thuốc nang (g) % so với khối lượng trung bình Số lần lặp lại thí nghiệm 20 20 Trung bình 19,67 ± 0,52 0,5773 ± 0,0179 99,62 ± 3,09 Tiêu chuẩn ≤ 30 ±7,5% Thời gian rã độ đồng khối lượng viên nang BDHNT đạt yêu cầu Dược điển Việt Nam IV Định tính cao chế phẩm phương pháp sắc ký lớp mỏng Bảng Sắc ký đồ cao viên nang BDHNT so với nguyên liệu đối chiếu Nguyên liệu Hệ dung mơi khai triển Hồng kỳ CH3Cl-MeOH-H2O (65:35:10 lớp dưới) Địa long n-BuOH-CH3COOHH2O (40:10:10) Xuyên khung CH3Cl -MeOH-NH4OH (9:1:1 giọt) Số Số vết vết nguyên liệu cao viên đối chiếu nang Phát Số vết trùng nguyên liệu với cao viên nang n-BuOH-CH3COOHH2O (4:1:5) Toluen-EtOAc (9:1) CH3Cl-EtOAc-MeOHHCOOH (40:5:10:0,2) Hồng hoa Đương quy Xích thược Phun acid sulfuric 10%, sấy 100 C Quan sát ánh sáng thường đèn UV =366nm Phun ninhydric 0,1% / 90%, sấy105 C Phun dung dịch Dragendorff, phun tiếp acid sulfuric soi UV =366nm 8 1 Ánh sáng thường 2 soi UV =366nm Dung dịch vanillin 1%/acid sulfuric 10% 3 Trên sắc ký đồ chế phẩm cho thấy diện Hồng kỳ, Đương quy, Xích thược, Xun khung, Hồng hoa, Địa long cao viên nang BDHNT Chứng tỏ phương pháp chiết xuất bào chế giữ thành phần chủ yếu công thức cổ truyền Định lượng saponin protein toàn phần cao viên nang BDHNT Bảng Hàm lượng saponin toàn phần, protein toàn phần cao viên nang BDHNT Chỉ tiêu Saponin toàn phần Protein toàn phần Cao BDHNT (mg/1g) 126,1 190,5 Tiêu Viên nang Tiêu chuẩn chuẩn BDHNT (mg/viên) (mg/1g) (mg/viên) ≤ 80 62,0 ≤ 40 ≤ 180 98,8 ≤ 90 Mỗi gam cao khơ chứa 80 mg saponin 180 mg protein toàn phần 210 Mỗi viên nang chứa 40 mg saponin 90 mg protein toàn phần Giới hạn nhiễm khuẩn cao viên nang BDHNT Bảng Giới hạn nhiễm khuẩn cao viên nang BDHNT Cao Viên nang BDHNT BDHNT Chỉ tiêu Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại (CFU/g) Tổng số nấm mốc, nấm men sống lại (CFU/g) Tổng số Enterobacteria Salmonella, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa So với tiêu chuẩn DĐVN IV ≤ 10 ≤ 10 Đạt ≤ 102 ≤ 102 Đạt ≤ 500 ≤ 500 Đạt 0 Đạt Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Giới hạn nhiễm khuẩn cao viên nang BDHNT đạt mức theo quy định Dược điển Việt Nam Giới hạn nhiễm khuẩn Từ kết thu từ thực nghiệm, Chế phẩm BDHNT đạt tiêu chuẩn cần thiết dạng bào chế viên nang theo quy định hành, tiền đề để tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng đánh giá tính an tồn hiệu thuốc cách xác khách quan Dựa vào sở liều dùng thuốc sắc BDHNT tác giả Hồng Bảo Châu(6), dự kiến liều dùng cho bệnh nhân 18 viên/ngày (người cân nặng trung bình 50 kg) Liều tương đương với thang thuốc 58,5 g, gồm có: Hồng kỳ 36 g, Đương quy vĩ g, Xuyên khung g, Xích thược 4,5 g, Đào (hạt) g, Hồng hoa g, Địa long g Như vậy, so với dạng cổ truyền, dạng bào chế tiện dụng hơn, giảm 117 lần khối lượng thuốc sử dụng hàng ngày cho người bệnh.Từ kết thực nghiệm trên, đề nghị số tiêu chuẩn chất lượng cho viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang (bảng 7) sau: Bảng Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng viên nang Bổ dương hoàn ngũ thang Độ rã Độ đồng khối lượng Mất khối lượng làm khơ Định tính Định lượng saponin toàn phần protein Phải đạt yêu cầu qui định theo DĐVN IV KẾT LUẬN BÀN LUẬN Chỉ tiêu Tính chất Nghiên cứu Y học Yêu cầu chất lượng Viên nang số 0, bột thuốc nang màu nâu, mùi thơm dược liệu Không 30 phút ± 7,5% KLTB bột thuốc có nang Khơng q 9,0% (kl/kl) Hoàng kỳ Địa long Xuyên khung Hồng hoa Đương qui vĩ Xích thược Mỗi viên khơng hơn: 40,0 mg 90,0 mg Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền chúng tơi có số kết luận sau:- Cao chiết Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang đạt yêu cầu cao khô độ ẩm, độ tro, độ pH, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn theo yêu cầu quy định Dược điển Việt Nam IV.- Viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang đạt yêu cầu độ ẩm, độ rã, độ đồng khối lượn, giới hạn nhiễm khuẩn theo quy định Dược điển Việt Nam IV.- Trong cao chiết viên nang Bổ Dương Hồn Ngũ Thang có diện dược liệu Hoàng kỳ, Hồng hoa, Đương qui, Địa long, Xích thược, Xun khung - Hàm lượng saponin tồn phần khơng 80 mg/1g cao khơ khơng 40 mg/1 viên BDHNT.- Hàm lượng protein tồn phần khơng 180 mg/1g cao khơ khơng 90 mg/1 viên BDHNT.Những kết minh chứng cho thấy viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang sau chuyển dạng giữ thành phần tương tự dạng bào chế cổ truyền.Những kết thu từ nghiên cứu góp phần cho việc tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm tiêu chuẩn chất lượng viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang, phục vụ cho nghiên cứu triển khai có triển vọng đóng góp với cộng đồng lựa chọn điều trị phục hồi vận động sau đột quị TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Bộ mơn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội (1998), Bài giảng dược liệu, Trung tâm Thông tin Thư viện Đại học Dược Hà Nội, tr.141 Bộ Y tế (2007), Bệnh học điều trị nội khoa (kết hợp đông – tây y), Nxb Y học Hà Nội, tr 411 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam (lần xuất thứ 4), Nxb Y học Hà Nội, tr 182-183, 756, 762-763, 767-768, 782-783, 788, 933- 211 Nghiên cứu Y học 212 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 935, PL 129-131, 144, 176-177, 182-183, 189-190, 221, 226-227, 258 Chinese Pharmacopoeia Commission (2005), Pharmacopoeia of The People’s Republic of China People’s Medical Publishing House, pp 194-195 Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học Hà Nội, tr 67, 656, 706, 977-978 Lê Đức Hinh nhóm chuyên gia (2008), Tai biến mạch máu não Hướng dẫn chẩn đốn xử trí, Nxb Y học Hà Nội, tr 596-598 10 Nguyễn Văn Đăng (2006), Tai biến mạch máu não, Nxb Y học Hà Nội, tr.9 Thường Hỷ Lê Niên (2008), 410 phương thang đông y thực dụng, Nxb Tổng hợp TP Hồ Chí Minh, tr 43 Trần Văn Kỳ (2008), 205 thuốc đông y cổ truyền chọn lọc, Nxb Thanh Niên Vương Thanh Nhậm, Nguyễn Văn Nghĩa (2004), Y lâm cải thác, Nxb Tổng hợp TP Hồ Chí Minh, tr 7, 9, 95-97 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền ... thực nghiệm trên, đề nghị số tiêu chuẩn chất lượng cho viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang (bảng 7) sau: Bảng Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng viên nang Bổ dương hoàn ngũ thang Độ rã Độ đồng khối lượng... KẾT QUẢ Tiêu chuẩn hóa tiêu lý hóa cao chiết viên nang BDHNT Bảng Độ ẩm cao viên nang BDHNT Số lần lặp lại thí Độ ẩm trung nghiệm bình (%) Cao BDHNT 4,3 Viên nang 4,2 BDHNT Chế phẩm Tiêu chuẩn. .. IV.- Viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang đạt yêu cầu độ ẩm, độ rã, độ đồng khối lượn, giới hạn nhiễm khuẩn theo quy định Dược điển Việt Nam IV.- Trong cao chiết viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang