Nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của bài thuốc HA-02 trên động vật thực nghiệm

Để tìm hiểu một cách có khoa học và đầy đủ về tính an toàn của thuốc HA-02 làm cơ sở cho điều trị, bài viết nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu: Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của thuốc HA-02.

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP, ĐỘC TÍNH BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA BÀI THUỐC HA-02 TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Bùi Thanh Hà*; Trần Quốc Bảo*; Hồng Trung Vinh* Đồn Chí Cường*; Nguyễn Văn Chinh** TÓM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu tính an tồn thuốc HA-02 động vật thực nghiệm Phương pháp nghiên cứu: xác định độc tính cấp thuốc phương pháp Litchfield - Wilcoxon xác định độc tính bán trường diễn thuốc chuột nhắt trắng dòng Swiss Kết quả: chuột uống liều 75 g/kg cân nặng không xác định LD50 thuốc Với liều g/kg/ngày 60 g/ngày uống liên tục 15 - 30 ngày, thuốc không gây thay đổi có ý nghĩa thống kê số lượng hồng cầu, bạch cầu, hàm lượng hemoglobin, hoạt độ enzym SGOT, SGPT, hàm lượng ure creatinin so với lô chứng, thuốc không gây biến đổi tổ chức học tế bào gan, thận chuột nghiên cứu Kết luận: thuốc HA-02 khơng gây độc tính cấp cho chuột nhắt trắng không làm thay đổi chức tạo máu, chức gan, thận chuột thí nghiệm * Từ khoá: Y học Cổ truyền; Thuốc thảo mộc; Bệnh tăng huyết áp; Bµi thuèc HA-02 Studying the Acute Toxicity and Semi-Chronic Toxicity of Herbal Medicines HA-02 on Experimental Animals Summary Objective: The research examines the safety of HA-02 drug on experimental animals Subjects and methods: The acute and semi-chronic toxicities of the HA-02 drug were evaluated on 120 mice by the Litchfield - Wilcoxon’s method on hematopoietic function, liver function and kidney Results: With doses of 75 g/kg bw, HA-02 drug LD50 was not identified With the doses of g/kg and 60 g/kg per day for 15 - 30 consecutive days drinking, HA-02 drug was not significantly changed in number of erythrocytes, leukocytes, hemoglobin concentration, activity of SGOT, SGPT, urea and creatinine levels In addition, the HA-02 drug did not cause any change in histology of liver and kidney of experimental mice Conclusion: The HA-02 drug is not toxic for mice and mice hematopoietic function, liver function and kidney function were not changed * Key words: Traditional medicine; Herbal medicine; Hypertension; HA-02 ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng huyết áp (THA) bệnh nguy hiểm cã tỷ lệ tử vong cao để lại di chứng nặng nề tai biến mạch máu não, nhồi máu tim ảnh hưởng đến sống người bệnh trở thành gánh nặng kinh tế cho gia đình người bệnh xã hội * Bệnh viện Quân y 103 ** Bệnh viện Quân y 105 Người phản hồi (Corresponding): Bùi Thanh Hà (buitha103@gmail.com) Ngày nhận bài: 05/02/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 16/03/2015 Ngày báo đăng: 31/03/2015 50 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 Nghiên cứu tìm hiểu chế bệnh sinh phát triển loại thuốc có hiệu điều trị THA biến chứng THA nhiều nhà khoa học nước giới quan tâm từ lâu vấn đề vô cấp thiết Thực phương châm kết hợp hai y học, Bộ môn - Khoa Y học Cổ truyền, Bệnh viện Quân y 103 sở biện chứng luận trị theo lý luận Y học Cổ truyền (YHCT) nguyên nhân, chế bệnh sinh bệnh THA, đồng thời vận dụng kết nghiên cứu theo y học đại tác dụng dược lý vị thuốc xây dựng thuốc “HA-02” gồm 15 vị thuốc đông dược để điều trị bệnh THA Bài thuốc có tác dụng bình can tiềm dương, tư bổ can thận âm, hoạt huyết, trừ đàm lợi thủy Để tìm hiểu cách có khoa học đầy đủ tính an tồn thuốc HA-02 làm sở cho điều trị, tiến hành đề tài với mục tiêu: Xác định độc tính cấp độc tính bán trường diễn thuốc HA-02 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu, phƣơng tiện đối tƣợng nghiên cứu * Nguyên liệu nghiên cứu: - Công thức thuốc HA-02: Thạch minh (Concha haliotidis) 20 g, Câu đằng (Ramulus cum uncariae uncis) 20 g, Thiên ma (Rhizoma gastrodiae) 15 g, Bạch thược (Radix paconiae alba) 15 g, Đương quy (Radix angelicae sinensis) 15 g, Xuyên khung (Rhizoma chuanxiong) 12 g, Ngưu tất (Radix achyranthis bidentatae) 12 g, Đại hoàng (Rhizoma rhei) g, Trạch tả (Rhizoma alismatis) 12 g, Ích mẫu (Herba leonuri) 20 g, Bình vơi (Stephania glabra) 12 g, Đỗ trọng (Cortex eucommiae) 15 g, 51 Chỉ xác (Fructus citri aurantii) 15 g, Tang ký sinh (Ramulus lorantoran parasiticus) 15 g, Đan sâm (Radix salviae militiorrhizae) 20 g - Dạng thuốc sử dụng: cao đặc tỷ lệ 2/1 - Thuốc bào chế Xí nghiệp Dược phẩm TW1 đạt Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV, Khoa Dược - Bệnh viện Quân y 103 cung cấp * Phương tiện trang thiết bị dùng nghiên cứu: Máy xét nghiệm huyết học tự động Coulter LH 780, máy xét nghiệm sinh hóa tự động AU5800 (Hãng Beckman Coulter), kính hiển vi * Đối tượng nghiên cứu: Chuột nhắt trắng dòng Swiss, trọng lượng 20 ± g/con: 120 Ban Cung cÊp động vật thí nghiệm - Học viện Quân y cung cấp, nuôi điều kiện phòng thí nghiệm Khoa Sinh lý, Học viện Quân y, ăn theo tiêu chuẩn động vật nghiên cứu, uống nước (đun sôi để nguội) tự Phƣơng pháp nghiên cứu * Thử độc tính cấp: Thực Khoa Sinh lý, Học viện Quân y theo phương pháp Litchfield Wilcoxon, quy định WHO Quy chế Đánh giá tính an tồn hiệu lực thuốc cổ truyền Bộ Y tế Tính liều LD50 theo phương pháp Behrens - Karber [1, 2, 4] Trước cho uống thuốc, chuột bị bỏ đói 18 Chia ngẫu nhiên chuột thành lô, lô 10 Lô chứng uống nước cất, lô thử uống thuốc với mức liều 15 g, 30 g, 45 g, 60 g, 75 g/kg thể trọng Mỗi chuột uống giờ/lần x lần/24 Nước cất thuốc thử đưa thẳng vào dày chuột kim cong đầu tù với thể tích 0,2 ml/10 g thể trọng chuột/lần TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 Theo dõi tình trạng chung số lượng chuột chết lơ 72 Tìm liều cao chuột không chết liều thấp gây chết 100% Tiếp tục theo dõi tình trạng chung chuột đến hết ngày thứ sau uống thuốc thử lần đầu * Thử độc tính bán trường diễn: Thực Khoa Sinh lý, Học viện Quân y theo phương pháp Abraham, quy định WHO Quy chế Đánh giá tính an tồn hiệu lực thuốc cổ truyền Bộ Y tế [1, 3, 4] Chia 60 chuột làm lô, lô 20 con: lô chứng: uống nước cất; lô thử 1: uống thuốc HA-02, liều g/kg/ngày (tương đương với liều dùng người); lô thử 2: uống thuốc HA-02, liều 60 g/kg/ngày (gấp 12 lần liều dùng người) Nước cất thuốc thử đưa thẳng vào dày chuột kim cong đầu tù vào buổi sáng từ - 10 giờ, lần/ngày với thể tích 0,2 ml/10 g thể trọng, uống liên tục 30 ngày Các tiêu theo dõi trước trình nghiên cứu: tình trạng chung, thể trạng chuột Đánh giá chức tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin Đánh giá chức gan thông qua định lượng số enzym: SGOT, SGPT Đánh giá chức thận thông qua định lượng ure, creatinin huyết tương chuột phương pháp quang động học đo hoạt tính enzym theo khuyến cáo Hội Hóa sinh lâm sàng Quốc tế Các thơng số theo dõi kiểm tra trước uống thuốc, sau 15 ngày 30 ngày uống thuốc - Mô bệnh học: sau 30 ngày uống thuốc, mổ chuột quan sát đại thể toàn quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan thận 50% chuột lô Các xét nghiệm vi thể thực Bộ môn - Khoa Giải phẫu bệnh Pháp y, Bệnh viện Quân y 103 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Thử độc tính cấp (LD50) thuốc HA-02 Bảng 1: Độc tính cấp thuốc HA-02 LƠ SỐ CHUỘT THÍ NGHIỆM LIỀU DÙNG (g/kg) THỂ TÍCH CHO UỐNG SỐ CHUỘT SỐNG/CHẾT SAU 72 GIỜ 10 Nước cất 0,2 ml x lần 10/0 10 15 0,2 ml x lần 10/0 10 30 0,2 ml x lần 10/0 10 45 0,2 ml x lần 10/0 10 60 0,2 ml x lần 10/0 10 75 0,2 ml x lần 10/0 Sau 72 uống thuốc, lô chứng lô thử với liều tõ 15 - 45 g/kg cân nặng, chuột hoạt động ăn uống bình thường, khơng bị khó thở, ngồi phân khơ Ở liều cao 60 - 75 g/kg cân nặng, hoạt động chuột giảm, khơng có tượng bỏ ăn 52 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 khó thở Khơng có chuột chết thời gian theo dõi, chưa xác định LD50 thuốc Thử độc tính bán trƣờng diễn thuốc HA-02 * Tình trạng chuột: Trong 30 ngày thí nghiệm, chuột nhóm hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, ăn uống tốt, phân khơ, lơng mượt, khơng có chuột bị chết có biểu bất thường * Ảnh hưởng thuốc đến phát triển trọng lượng chuột: Bảng 2: Trọng lượng chuột trước sau uống thuốc CÂN NẶNG (g) p THỜI GIAN Chứng (1) (n = 20) Thử (2) (n = 20) Thử (3) (n = 20) Trước thí nghiệm (a) 22,3 ± 1,67 21,5 ± 1,4 21,2 ± 1,2 Sau 15 ngày (b) 24,9 ± 1,1 24,1 ± 0,97 22,3 ± 1,1 Sau 30 ngày (c) 24,9 ± 1,1 24,1 ± 0,97 23,9 ± 1,06 p p1-2 > 0,05 p1-3 > 0,05 p2-3 > 0,05 pa-b > 0,05; pa-c > 0,05; pb-c > 0,05 So sánh trọng lượng thể chuột lô dùng thuốc HA-02 với lô đối chứng sinh học thời điểm thấy thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) So sánh thời điểm sau so với trước thấy trọng lượng thể chuột lô tăng, thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Chứng tỏ thuốc HA-02 mức liều khơng ảnh hưởng đến phát triển cân nặng bình thường chuột * Ảnh hưởng thuốc đến chức tạo máu chuột: Bảng 3: Chỉ số huyết học chuột sau thí nghiệm KẾT QUẢ (n = 10) CHỈ SỐ Hồng cầu (T/l) NGÀY THỨ Chứng (1) Thử (2) Thử (3) N15 (a) 7,1 ± 1,3 ± 1,7 6,56 ± 1,48 N30 (b) 6,9 ± 2,4 5,6 ± 1,5 6,44 ± 1,65 pa-b > 0,05 Bạch cầu (G/l) N15 (a) 6,9 ± 1,3 7,4 ± 1,89 7,1 ± 1,5 N30 (b) 7,9 ± 0,4 8,1 ± 0,5 7,1 ± 1,23 pa-b > 0,05 Hemoglobin (g/l) N15 (a) 11,6 ± 1,0 11,4 ± 1,34 10,7 ± 1,14 N30 (b) 12,3 ± 0,5 12,5 ± 0,8 10,9 ± 1,13 pa-b > 0,05 53 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 Tiểu cầu (G/l) N15 (a) 819 ± 133 714 ± 200 715 ± 234 N30 (b) 822 ± 205 884 ± 241 694 ± 224 pa-b > 0,05 So sánh lô thời điểm lô thời điểm thấy, số lượng hồng cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) nhóm chứng nhóm nghiên cứu Như vậy, thuốc HA-02 cho chuột uống liên tục thời gian 15 ngày 30 ngày mức liều không ảnh hưởng tới số lượng hồng cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin Chứng tỏ thuốc an toàn với chức tạo máu dùng kéo dài * Ảnh hưởng thuốc đến chức gan, thận chuột: Bảng 4: Các số sinh hóa máu chuột sau thí nghiệm KẾT QUẢ (n = 10) CHỈ SỐ Ure (mmol/l) NGÀY THỨ Chứng (1) Thử (2) Thử (3) N15 (a) 6,1 ± 1,1 6,1 ± 1,44 4,9 ± 1,11 N30 (b) ± 2,3 6,8 ± 1,3 5,43 ± 1,05 pa-b > 0,05 Creatinin (mmol/l) N15 (a) 32,7 ± 13,0 27,6 ± 6,63 32 ± 7,4 N30 (b) 38 ± 29,3 27,8 ± 4,2 30 ± 7,66 pa-b > 0,05 SGOT (u/l) N15 (a) 27,3 ± 5,65 25,2 ± 7,04 28,8 ± 7,2 N30 (b) 26,37 24,4 ± 7,7 28,7 ± 6,62 pa-b > 0,05 SGPT (u/l) N15 (a) 4,9 ± 1,7 4,88 ± 1,35 4,4 ± 1,3 N30 (b) 4 4,8 ± 1,4 pa-b > 0,05 So sánh lô thời điểm lô thời điểm thấy, nồng độ ure, creatinin, SGOT, SGPT thay đổi ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, thuốc HA-02 cho chuột uống liên tục thời gian 15 ngày 30 ngày mức liều không ảnh hưởng tới nồng độ ure, creatinin, SGOT, SGPT máu chuột Chứng tỏ thuốc an toàn chức gan, thận dùng kéo dài * Ảnh hưởng thuốc đến mô bệnh học gan, thận chuột: - Quan sát đại thể: sau mổ chuột, quan sát thấy tổ chức gan, thận, tim, phổi, hệ thống tiêu hóa chuột lơ chứng lơ dùng thuốc bình thường, khơng có biểu xung huyết hay dấu hiệu bị tổn thương 54 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 - Quan sát mô bệnh học: Chứng (chuột 01CH-G) Thuốc (chuột 01Th1-G) Thuốc (chuột 01Th2-G) Hình 1: Hình ảnh mô bệnh học gan chuột Chứng (chuột 01Ch-T) Thuốc (chuột 02Th1-T) Thuốc (chuột 01Th2-T) Hình 2: Hình ảnh mô bệnh học thận chuột + Mẫu chứng: bè gan tiểu thùy gan không thay đổi cấu trúc Tế bào gan khơng bị tổn thương thối hóa, khơng có xâm nhập viêm Cuộn mạch tiểu cầu thận có cấu trúc bình thường, tế bào nội mô cuộn mạch nhỏ Khoang Bowman rõ Các tế bào ống thận nhau, rõ cấu trúc, tế bào biểu mơ ống thận bình thường Khe thận hẹp Mao mạch máu thành mỏng, tế bào nội mơ rõ Khơng phát thấy hình ảnh bệnh lý 55 + Mẫu thử (liều liều 2): thùy gan bè gan không thay đổi cấu trúc Tế bào gan khơng có tổn thương thối hóa Tĩnh mạch trung tâm không giãn, không xung huyết, khoảng cửa khơng có xâm nhập viêm Cấu trúc vùng vỏ, vùng tủy cầu thận bình thường, khơng thấy hình ảnh tổn thương Như vậy, thuốc HA-02 dùng đường uống liên tục 30 ngày không gây tổn thương gan, thận chuột TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 KẾT LUẬN - Độc tính cấp: với liều 75 g/kg cân nặng, khơng thấy có biểu độc cấp tính thuốc HA-02 chuột nhắt trắng Chưa xác định LD50 chuột nhắt trắng đường uống theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon - Độc tính bán trường diễn: với liều g/kg/ngày 60 g/kg/ngày (gấp 12 lần liều dùng người) uống liên tục 30 ngày, thuốc HA-02 không ảnh hưởng đến phát triển trọng lượng chuột, không biến đổi số huyết học hồng cầu, tiểu cầu hàm lượng hemoglobin, số chức gan (SGOT, SGPT), chức thận (ure, creatinin) giới hạn 53 bình thường Thuốc HA-02 không gây biến đổi tổ chức học mô gan, thận chuột nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế Quy chế Đánh giá tính an tồn hiệu lực thuốc Cổ truyền Quyết định số 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 1996 Đỗ Trung Đàm Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc NXB Y học 2006 Abrham WB Techniques of animal and clinical toxicology Med Pub Chicago 1978, pp.55-68 Turner A Screeningmethodsinpharmacology Academic Press New York and London 1965, pp.60-68 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 54 ... khoa học đầy đủ tính an tồn thuốc HA-02 làm sở cho điều trị, tiến hành đề tài với mục tiêu: Xác định độc tính cấp độc tính bán trường diễn thuốc HA-02 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu,... lô Các xét nghiệm vi thể thực Bộ môn - Khoa Giải phẫu bệnh Pháp y, Bệnh viện Quân y 103 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Thử độc tính cấp (LD50) thuốc HA-02 Bảng 1: Độc tính cấp thuốc HA-02 LƠ SỐ... ngày thứ sau uống thuốc thử lần đầu * Thử độc tính bán trường diễn: Thực Khoa Sinh lý, Học viện Quân y theo phương pháp Abraham, quy định WHO Quy chế Đánh giá tính an tồn hiệu lực thuốc cổ truyền