Nhằm xác định tính an toàn của acid gambogic, bài viết nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm đánh giá độc tính cấp của acid gambogic đường uống trên động vật thực nghiệm.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐỘC TÍNH CẤP CỦA ACID GAMBOGIC TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Trần Thanh Tùng1, Trần Thị Thu Thủy2, Nguyễn Thị Thanh Loan1 Trường Đại học Y Hà Nội Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Nghiên cứu thực nhằm đánh giá độc tính cấp acid gambogic dùng đường uống động vật thực nghiệm Nghiên cứu độc tính cấp tiến hành theo Hướng dẫn Tổ chức Y tế Thế giới Chuột nhắt trắng chủng Swiss uống thuốc thử acid gambogic với liều tăng dần để xác định liều thấp gây chết 100% chuột (LD100) liều cao không gây chết chuột (LD0) Liều gây chết 50% chuột (LD50) acid gambogic khoảng tin cậy 95% tính dựa theo phương pháp Litchfied - Wilcoxon Kết nghiên cứu cho thấy liều 600 mg/kg mức liều thấp gây chết 100% chuột liều 100 mg/kg liều cao không gây chết chuột Ngoài ra, liều LD50 xác định 281,58 mg/kg với khoảng tin cậy 95% [277,99 mg/kg - 285,18 mg/kg] Từ khóa: Acid gambogic, độc tính cấp, động vật thực nghiệm I ĐẶT VẤN ĐỀ Acid gambogic thành phần nhựa Đằng hồng (Garcinia hanburyi Hook f., thuộc họ Guttiferae), thuốc đông y phân bố đặc hữu vùng Đông Nam Á có Việt Nam [1] Mặc dù phân lập xác định cấu trúc từ năm 60 kỷ trước đến năm 2004 hoạt tính chống ung thư acid gambogic ý Các nghiên cứu in vitro in vivo acid gambogic có tác dụng nhiều loại ung thư ung thư gan, ung thư dày, ung thư phổi ung thư vú [2 - 7] Cơ chế tác dụng acid gambogic có liên quan đến gây độc tế bào, ức chế tăng sinh, thúc đẩy trình tự chết tế bào cách hoạt hóa enzym caspase 3, ức chế gắn kết protein anti-apoptotic với peptid [7 - 9] Hiện nay, giới chưa có cơng trình cơng bố cơng nghệ phân lập acid gambogic qui mô công nghiệp mà có số phương pháp chiết xuất qui mơ phòng thí nghiệm Trong nghiên cứu này, acid gambogic phân lập từ nhựa Đằng hoàng trồng Phú Quốc, Kiên Giang Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Đến nay, chưa có nghiên cứu Việt Nam giới xác định độc tính acid gambogic dùng theo đường uống chiết xuất từ nhựa Đằng hoàng Nhằm xác định tính an tồn acid gambogic, nghiên cứu thực với mục tiêu: Đánh giá độc tính cấp acid gambogic đường uống động vật thực nghiệm II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Địa liên hệ: Nguyễn Thị Thanh Loan, Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Y Hà Nội Email: thanhloanfr89@gmail.com Ngày nhận: 12/4/2018 Ngày chấp thuận: 28/5/2018 TCNCYH 114 (5) - 2018 2.1 Vật liệu nghiên cứu Thuốc nghiên cứu Acid gambogic phân lập từ nhựa TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Đằng hoàng Phú Quốc, Kiên Giang vào tiếtu) số lượng chuột chết vòng 72 tháng 12/2015, với hiệu suất 5% Viện sau uống thuốc thử Tất chuột chết Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn mổ để đánh giá tổn thương đại thể Từ lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Acid xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định gambogic chiết xuất từ nhựa LD50 thuốc thử Sau tiếp tục theo dõi dung môi methanol với độ tinh khiết 92% tình trạng chuột đến hết ngày thứ 14 sau Thuốc thử hòa tan nước uống thuốc thử chuột uống Hoá chất máy móc phục vụ nghiên cứu - Kim đầu tù cho chuột uống - Cân điện tử nhãn hiệu hãng YMC Co.Ltd, Nhật Bản - Cốc chia vạch, bơm kim tiêm 1ml Xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu xử lý thống kê theo phương pháp xác định LD50 theo phương pháp Litchfied - Wilcoxon Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội vào tháng Động vật thực nghiệm 7/2017 Chuột nhắt trắng chủng Swiss, hai III KẾT QUẢ giống khỏe mạnh, trọng lượng 20g ± 2g Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột nhắt trắng uống acid Động vật thí nghiệm nuôi ngày trước gambogic với liều tăng dần từ liều 100 mg/kg nghiên cứu suốt thời gian nghiên đến liều 600 mg/kg Liều 600 mg/kg xác cứu điều kiện phòng thí nghiệm với đầy định mức liều thấp gây chết 100% đủ thức ăn chuẩn nước uống chuột liều 100 mg/kg liều cao không Phương pháp Nghiên cứu độc tính cấp thuốc thử acid gambogic tiến hành chuột nhắt trắng theo đường uống xác định LD50 theo phương pháp Litchfied - Wilcoxon [10 - 12]: gây chết chuột (gây chết 0% chuột) Kết nghiên cứu độc tính cấp theo liều acid gambogic dùng đường uống thể qua bảng Theo dõi sau 72 suốt 14 ngày nhận thấy lô chuột uống acid gambogic - Chuột nhắt trắng nhịn đói qua đêm, liều 100 mg/kg không xuất dấu hiệu chia thành lô khác nhau, lô 10 bất thường Dấu hiệu chậm vận động xuất Cho chuột uống thuốc thử với liều tăng dần để xác định liều thấp gây chết 100% chuột liều cao không gây chết chuột (gây chết 0% chuột) lô chuột uống acid gambogic liều từ 120 mg/kg đến liều 360 mg/kg Lô chuột bị tiêu chảy chậm vận động mức liều 480mg/kg Thời điểm chết - Theo dõi tình trạng chung chuột, chuột nhận thấy vòng 24 đầu trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu tiên sau uống thuốc thử với mức liều nhiễm độc (như nơn, co giật, kích động, khác 10 TCNCYH 114 (5) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Kết nghiên cứu độc tính cấp theo liều acid gambogic dùng đường uống Lô chuột n Liều dùng đường uống acid gambogic (mg/kg) Số lượng chuột chết Dấu hiệu bất thường khác Lô 10 100 Không Lô 10 120 Không Lô 10 240 Không Lô 10 360 Không Lô 10 480 Lô 10 600 10 Chuột chậm vận động, tiêu chảy Chuột chậm vận động, tiêu chảy Bảng Kết xác định LD50 acid gambogic dùng đường uống theo phương pháp Litchfied - Wilcoxon Liều dùng acid gambogic Số lượng chuột chết/ Tỷ lệ chuột đường uống (mg/kg) Tổng số chuột lô chết (%) (Y) 100 mg/kg 0/10 3,04 120 mg/kg 1/10 10 3,72 240 mg/kg 3/10 30 4,48 360 mg/kg 6/10 60 5,00 480 mg/kg 8/10 80 5,84 600 mg/kg 10/10 100 6,96 Probit LD50 (mg/kg) 281,58 Khoảng tin cậy 95% (mg/kg) [277,98 - 285,18] Kết bảng biểu đồ cho thấy: Liều gây chết 50% chuột hay LD50 xác định 281,58 mg/kg Khoảng tin cậy 95% LD50 277,99 mg/kg - 285,18 mg/kg TCNCYH 114 (5) - 2018 11 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Probit (tỷ lệ chuột chết (0%) 7,50 y = 4,312x - 5,5627 R2 = 0,9328 1,80 2,00 2,20 2,40 2,60 2,80 3,00 Log (liều dùng acid gambogic đường uống (mg/kg)) Biểu đồ Đồ thị tuyến tính để xác định LD50 acid gambogic dùng đường uống IV BÀN LUẬN Độc tính cấp (Acute toxicity) thuốc 30 phút 24 đầu, sau theo dõi độc tính xảy dùng liều thử ngày 14 ngày sau uống thuốc dùng lần [10] Nghiên cứu độc tính cấp thử ăn uống, hoạt động thần kinh, lại, leo nhằm cung cấp thông tin cho việc xếp loại trèo, tiết [3] Nếu động vật chết, động mức độ độc thuốc thử, dự đoán triệu vật mổ để đánh giá đại thể tổn thương chứng dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc quan [10; 14] cấp; thiết lập mức liều cho thử nghiệm Nghiên cứu độc tính cấp độc tính tác dụng phạm vi an acid gambogic thực giới toàn thuốc nghiên cứu Do vậy, nghiên cứu Quinglong Guo cộng thử độc tính cấp cần xác định liều an vào năm 2006 Tuy nhiên, nghiên cứu toàn; liều dung nạp tối đa; liều gây độc tính này, acid gambogic sử dụng theo quan sát được; liều thấp đường tiêm tĩnh mạch Kết nghiên cứu gây chết động vật thí nghiệm; liều LD50 (nếu Quinglong Guo cộng cho thấy tất xác định được); triệu chứng ngộ chuột thí nghiệm có số thay đổi độc điển hình quan sát động hành vi chậm chạp, giảm đáp ứng với vật khả hồi phục [13] LD50 kích thích từ bên ngồi Khơng có thay đổi thơng số quan trọng để đánh giá độc tính bệnh lý nhận thấy chuột nhắt thuốc Liều có tác dụng dược lý thường vào Chuột chết nhận thấy chủ yếu khoảng 1/10 liều LD50 (trong giới hạn từ 1/20 vòng 24 sau uống thuốc thử đến 1/5 LD50) Do nên xác định LD50 Giá trị LD50 acid gambogic dùng theo từ nghiên cứu bắt đầu Theo đường tiêm tĩnh mạch chuột nhắt xác Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế (OECD định qua nghiên cứu 45,993 mg/kg với - Organisation for Economic Co-operation and khoảng tin cậy 95% 43,181 mg/kg - 48,450 Development), động vật thực nghiệm cần mg/kg Ngoài ra, nghiên cứu Quinglong theo dõi sau cho uống thuốc thử Guo cộng xác định liều 12 TCNCYH 114 (5) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thấp gây chết 100% dùng đường tiêm uống nên chưa tính số điều trị tĩnh mạch 60 mg/kg [14] Hiện nay, thuốc thử Tuy nhiên, liều LD50 cao gấp lần giới, acid gambogic dùng theo hai liều dùng độc tính bán trường diễn đường gồm đường uống đường tiêm tiêm không gây độc chuột với thuốc tĩnh mạch Tuy nhiên, thông số dược chống ung thư chứng minh động học acid gambogic chưa phần tính an tồn thuốc thử nghiên cứu cụ thể Vì vậy, chưa có quy đổi liều dùng đường uống liều dùng đường tiêm tĩnh mạch Đến nay, giới Việt Nam, chưa có cơng trình nghiên cứu LD50 acid gambogic dùng theo đường uống Đây nghiên cứu thực xác định giá trị LD50 acid gambogic dùng đường uống Trong nghiên cứu này, xác định LD50, nghiên cứu liều thấp gây chết 100% chuột (LD100) 600 mg/ kg, liều cao không gây chết chuột (LD0) 100 mg/kg Một thông số quan trọng chọn liều dùng lâm sàng LD0 hay gọi liều NOAEL (No observed adverse effect level), mức liều cao Trong nghiên cứu độc tính bán trường mà khơng gây tai biến quan diễn, liều dùng acid gambogic dùng sát Liều NOAEL giá trị quan chuột cống trắng chủng Wistar 20 mg/ trọng để xác định liều dùng kg/ngày 30 mg/kg/ngày Như vậy, liều LD50 lâm sàng đưa khuyến cáo việc sử thử nghiệm độc tính cấp gấp lần liều dụng thuốc lâm sàng [14] Các nghiên thử độc tính bán trường diễn Cùng với thử cứu tác dụng acid gambogic độc tính cấp độc tính bán trường diễn, giới acid gambogic có độc tính thơng số khác xác định nhằm đánh chấp nhận được, hoạt tính chống ung thư giá tổng quan tác dụng độc tính chọn lọc khả tác nhân hóa trị thuốc số điều trị (Therapeutic index) tiềm Như vậy, tính chọn lọc acid Chỉ số điều trị tỷ số liều chết trung bình gambogic giải thích phần kết (LD50) liều tác dụng dược lý có tác dụng nghiên cứu tính an tồn thuốc thử 50% số động vật thí nghiệm (ED50) Đây số quan trọng nhằm định xem có nên đưa thuốc sử dụng người hay khơng Nếu số điều trị lớn phạm vi điều trị lớn độc tính thấp [10] Thơng thường, thuốc thử có số điều trị lớn 10 đưa vào thử nghiệm lâm sàng Tuy nhiên, số thuốc chống ung thư có số điều trị nhỏ 10 xem xét đưa vào thử V KẾT LUẬN Kết nghiên cứu thử độc tính cấp động vật thực nghiệm acid gambogic dùng theo đường uống cho thấy: - Liều 600 mg/kg mức liều thấp gây chết 100% chuột - Liều 100 mg/kg liều cao không gây chết chuột (gây chết 0% chuột) nghiệm người sau cân nhắc lợi ích - Liều gây chết 50% chuột hay LD50 nguy Hiện nay, chúng tơi chưa có 281,58 mg/kg Khoảng tin cậy 95% LD50 liệu ED50 acid gambogic dùng đường 277,99 mg/kg - 285,18 mg/kg TCNCYH 114 (5) - 2018 13 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Lời cám ơn Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Bộ Công thương tài trợ kinh phí cho đề tài mã số CNHD.ĐT 061/15-17 TÀI LIỆU THAM KHẢO D.W.Ollis,M.V.J.Ramsay, I.O Sutherland (1965) The constitution of gambogic acid Tetrahedron, 21(6), 1453 - 1470 E.C.Van Meir, C.G.Hadjipanayis, A.D Norden et al (2010) Exciting New Advances in Neuro-Oncology: The Avenue to a Cure for ducer by a HTS assay Bioorganic & Medicinal Chemistry, 12, 309 - 317 Zhai.D., Jin.C., Shiau.C et al (2008) Gambogic acid is an antagonist of antiapoptotic Bcl-2-family proteins Molecular Cancer Therapeutics, 7(6), 1639 - 1646 Zhao.L., Guo.Q., You.Q et al (2004) Gambogic acid induces apoptosis and regulates expressions of Bax and Bcl-2 protein in human gastric carcinoma MGC-803 cells Biological and Pharmaceutical Bulletin, 27(7), 998 - 1003 Malignat Glioma A Cancer Journal for Clini- 10 OECD (2001) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clini- cians, 60, 166 - 193 cal Signs as Humane Endpoints for Experi- D.Duan, B.Zhang, J.Yao et al (2014) Gambogic acid induces apoptosis in hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells by tar- mental Animals Used in Safety Evaluation, acute oral toxicity, Environmental Health and geting cytosolic thioredoxin reductase Free Radical Biology & Medicine, 69, 15 - 25 L.H.Wang, Y.Li, S.N.Yang et al (2014) Gambogic acid synergistically potentiates cis- Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19 11 Patricia V Turner (2011) Administration of Substances to Laboratory Animals: Routes of Administration and Factors to Con- platin-induced apoptosis in non-small-cell lung sider Journal of the American Association for cancer through suppressing NF-κB and MAPK/HO-1 signalling British Journal of Can- Laboratory Animal Science, 50(5), 600 – 613 cer, 110, 341 J.Chen, H.Y.Gu, N.Lu (2008) Microtubule depolymerization and phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase-1 and p38 were involved in gambogic acid induced cell cycle 12 Van den Heuvel (1990) The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test, Fd Chem Toxicol, 28, 469 - 482 13 Lê Quang Cường, Nguyễn Ngô arrest and apoptosis in human breast carci- Quang Phạm Thanh Kỳ (2015) Thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng thuốc đông noma MCF-7 cells Life Sciences, 83, 103 y, thuốc từ dược liệu, 13 - 20 M.Thida, D.W.Kim, T.T.T.Tran et al (2016) Gambogic acid induces apoptotic cell death in T98G glioma cells Medicinal Chemis- 14 Đỗ Trung Đàm (2014) Phương pháp xác định độc tính thuốc 13 - 26, 199 - 228 try Letters, 26, 1097 - 1101 (2006) Toxicological Studies of Gambogic Acid and its Potential Targets in Experimental Animals Basic & Clinical Pharmacology & H.Z.Zhang, S.Kasibhatla, Y.Wang et al (2004) Discovery, characterization and SAR of gambogic acid as a potent apoptosis in- 14 15 Qinglong Guo, Qi Qi, Qidong You Toxicology, 99, 178 - 184 TCNCYH 114 (5) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary EVALUATION OF ACUTE TOXICITY OF GAMBOGIC ACID IN EXPERIMENTAL ANIMALS The present study investigated to evaluate the acute toxicity of gambogic acid in experimental animals The acute toxicity was studied base on guidance of World Health Organization Gambogic acid was administered single ordered dose progression via orally route The lowest lethal dose (LD0) and the lethal dose 100% (LD100) were determined A estimation of LD50 and a 95% confidence interval are calculated using the Litchfield and Wilcoxon method The results from studies demonstrated that the lowest lethal dose of gambogic acid administered by orally route is 100 mg/kg and the lethal dose 100% is 600 mg/kg In addition, the LD50 of gambogic acid was determined to be 281.58 mg/kg in mice The 95% confidence limit was found to fall in the range of [277.99 mg/kg - 285.18 mg/kg] Keywords: Gambogic acid, acute toxicity, experimental animals TCNCYH 114 (5) - 2018 15 ... thử nghiệm độc tính cấp gấp lần liều dụng thuốc lâm sàng [14] Các nghiên thử độc tính bán trường diễn Cùng với thử cứu tác dụng acid gambogic độc tính cấp độc tính bán trường diễn, giới acid gambogic. .. chứng dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc quan [10; 14] cấp; thiết lập mức liều cho thử nghiệm Nghiên cứu độc tính cấp độc tính tác dụng phạm vi an acid gambogic thực giới toàn thuốc nghiên cứu Do... dùng acid gambogic đường uống (mg/kg)) Biểu đồ Đồ thị tuyến tính để xác định LD50 acid gambogic dùng đường uống IV BÀN LUẬN Độc tính cấp (Acute toxicity) thuốc 30 phút 24 đầu, sau theo dõi độc tính