Nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của viên bổ xương khớp trên động vật thực nghiệm

Mục tiêu: nghiên cứu tính an toàn của viên bổ xương khớp trên động vật thực nghiệm. Phương pháp nghiên cứu: xác định độc tính cấp của thuốc và độc tính bán trường diễn của chế phẩm trên chuột nhắt trắng dòng Swiss theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27 tháng 10 năm 2015 và mô hình nghiên cứu theo OECD.

CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP, ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA VIÊN BỔ XƯƠNG KHỚP TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Nguyễn Thị Ngọc Diệp1, Văn Cơng Viên1, Đồn Chí Cường2 TĨM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu  tính an tồn của viên bổ xương khớp động vật thực nghiệm Phương pháp nghiên cứu: xác định độc tính cấp thuốc độc tính bán trường diễn chế phẩm chuột nhắt trắng dòng Swiss theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” Bộ Y tế ban hành theo định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27 tháng 10 năm 2015 mơ hình nghiên cứu theo OECD Kết quả: Độc tính cấp: với liều gấp 31 lần liều điều trị, thuốc khơng có độc cấp tính, khơng xác định LD50.- Độc tính bán trường diễn: với liều 500 mg/kg/ ngày liều 1000 mg/kg/ngày (tương đương với liều điều trị dự kiến viên/ngày liều viên/ngày người), uống liên tục 28 ngày 90 ngày, viên bổ xương khớp không ảnh hưởng đến phát triển trọng lượng chuột, không biến đổi số huyết học hồng cầu, tiểu cầu hàm lượng Hemoglobin, số đánh giá chức gan (hoạt độ SGOT, SGPT), chức thận (nồng độ BUN, creatinin) không gây biến đổi tổ chức học tế bào gan, thận, không gây độc bán trường diễn động vật thực nghiệm Kết luận: viên bổ xương khớp khơng gây độc tính cấp cho chuột nhắt trắng không làm thay đổi chức tạo máu, chức gan, thận chuột thí nghiệm Từ khoá: Y học cổ truyền; Giảm mật độ xương; Viên bổ xương khớp STUDYING THE ACUTE TOXICITY AND SEMI-CHRONIC TOXICITY OF VIÊN BỔ XƯƠNG KHỚP ON EXPERIMENTAL ANIMALS SUMMARY Objective: The research examines the safety of bổ xương khớp tablet on Viện Y Dược Học Dân Tộc Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Ngọc Diệp (ngocdiep.ng71@gmail.com) Ngày nhận bài: 12/4/2018, ngày phản biện: 25/4/2018 Ngày báo đăng: 30/6/2018 89 TẠP CHÍ Y DƯỢC THỰC HÀNH 175 - SỐ 14 - 6/2018 experimental animals Subjects and methods: The acute and semi-chronic toxicities of the bổ xương khớp tablet were evaluated on 96 mice by the OECD method on hematopoietic function, liver function and kidney Results: With doses of 31 times of treatment dose, Bổ xương khớp tablet is not acute toxic for mice, LD50 was not identified With the doses of 500 mg/kg and 1000 mg/kg per day for 28 – 90 consecutive days drinking, bổ xương khớp tablet was not significantly changed in number of erythrocytes, leukocytes, hemoglobin concentration, activity of SGOT, SGPT, BUN and creatine levels In addition, the bổ xương khớp tablet did not cause any change in histology of liver and kidney of experimented mice Conclusion: The bổ xương khớp tablet is not toxic for mice and mice hematopoietic function, liver function and kidney function were not changed Keywords: Traditional medicine; Osteopenia; Bổ xương khớp tablet ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày tuổi thọ cao thường kèm với bệnh lý mạn tính tuổi già, có bệnh loãng xương Loãng xương “căn bệnh âm thầm”, bệnh khơng biểu triệu chứng, người mắc bệnh khơng biết bị bệnh bị gãy xương Gãy xương loãng xương làm cho người bệnh đau đớn, khả vận động, khả sinh hoạt tối thiểu Các nghiên cứu nước nước điều trị loãng xương thuốc YHCT đem lại kết khả quan Bài thuốc Lục vị gia giảm làm tăng mật độ xương bệnh nhân loãng xương [1] Cao xương cá sấu điều trị trẻ bị bệnh tạo xương bất tồn có cải thiện mật độ khống xương Trên sở đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu chế phẩm viên bổ xương khớp, chế phẩm kết hợp cao xương cá sấu thuốc lục vị địa hồng hồn gia vị Cốt tối bổ Xun khung nhằm nâng cao 90 hiệu điều trị người bệnh giảm mật độ xương, lỗng xương Để tìm hiểu cách có khoa học đầy đủ tính an tồn viên bổ xương khớp, chúng tơi tiến hành đề tài với mục tiêu: Xác định  độc tính cấp độc tính bán trường diễn viên bổ xương khớp ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng chủng dòng Swiss albino, khỏe mạnh, từ -7 tuần tuổi, cân nặng 25 ± g, gồm giống đực cái, Viện Vaccin sinh phẩm y tế Nha Trang nuôi cung cấp, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Chuột ni dưỡng theo dõi chu đáo, ăn thức ăn tổng hợp xưởng sản xuất thức ăn động vật thí nghiệm cung cấp, nước uống tự CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC * Ngun liệu nghiên cứu Thành phần viên bổ xương khớp gồm cao xương cá sấu kết hợp với cao Lục vị địa hoàng hoàn gia vị với tỉ lệ 2:1 (2 phần cao xương, phần cao thuốc) Công thức thuốc Lục vị địa hoàng gia vị: Thục địa phần Hoài sơn phần Sơn thù phần Đan bì phần Trạch tả phần Bạch linh phần Cốt toái bổ phần Xuyên khung phần Các vị thuốc với tỉ lệ nấu thuốc thành cao, sấy khô, tán bột, làm thành viên nén Viên Bổ xương khớp: viên nén bao phim hình oval, màu trắng, mặt có vạch ngang, mặt trơn, có mùi thơm dược liệu, hàm lượng 750mg (gồm: 500 mg cao xương 250 mg cao thuốc), đóng lọ 30 viên; số lô 010516NC, ngày sản xuất 31/05/2016, hạn sử dụng 31/05/2019 Trung tâm sản xuất cao dược liệu công nghệ cao, công ty cổ phần BV Pharma TP Hồ Chí Minh sản xuất * Phương tiện trang thiết bị dùng nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Tiến hành phịng thí nghiệm Bộ mơn Dược lý – Trung tâm công nghệ Dược TP Hồ Chí Minh, Phịng khám đa khoa Tao Đàn Quận 1, Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện Quận - Tp Hồ Chí Minh Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2016 đến tháng 12/2016 Dụng cụ nghiên cứu: + Cân, vi phẫu + Kim cho uống có đầu tù + Đá CO2 (Cửa hàng Mai Hoa, Hồ Chí Minh) + Máy huyết học, sinh hóa tự động RX Daytona (Randox, Vương quốc Anh) + Kính hiển vi quang học (Labomed, Hoa Kỳ) Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu: Theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” Bộ Y tế ban hành theo định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27 tháng 10 năm 2015 mô hình nghiên cứu theo OECD [1], [2], [3], [4] Liều thuốc thử: Viên cao bổ xương khớp dự kiến định người lớn với liều: viên x 750 mg ngày Như vậy, khoảng 2250 mg/ ngày cho người có trọng lượng trung bình khoảng 55 kg, tương đương liều 40 mg/kg/ngày Ngoại suy liều điều trị chuột 40 x 12 = 480 mg/kg/ngày, làm trịn khoảng 500 mg/kg/ngày 91 TẠP CHÍ Y DƯỢC THỰC HÀNH 175 - SỐ 14 - 6/2018 2.1 Độc tính cấp (LD50) chết, tiếp tục theo dõi t� 0,53 32,85 ± 1,67 46,04 ± 0,71 17,48 ± 0,12 38,27± 0,55 15,68 ± 0,14 7,98 ± 0,65 457,71 ± 6,55 p > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 95 TẠP CHÍ Y DƯỢC THỰC HÀNH 175 - SỐ 14 - 6/2018 Sau 28 ngày, 90 ngày số huyết học lô thử so với lô sinh lý khơng có khác biệt, so với trước thử nghiệm khơng có khác biệt (p > 0,05) Các số theo dõi nằm giới hạn sinh lý bình thường [4] Điều chứng tỏ sau 28 ngày 90 ngày uống viên bổ xương khớp liều thử nghiệm, không làm thay đổi số huyết học chuột thực nghiệm 2.4 Chỉ số sinh hóa Bảng Khảo sát số sinh hóa sau 28 ngày Lơ Trước thử nghiệm (n = 12) ( X ± SD) Chỉ số ALT (U/L) 72,28 ± 5,36 AST (U/L) 115,51 ± 7,19 Creatinin (mg/ dl) 0,53 ± 0,01 BUN (mg/dl) 66,99 ± 1,12 Lô sinh lý (n = 12) Lô thử (n = 12) Lô thử (n = 12) p ( X ± SD) ( X ± SD) ( X ± SD) 60,23 ± 2,30 105,65 ± 4,87 66,96 ± 2,80 137,58 ±12,65 76,27 ± 5,04 138,75 ± 19,52 >0,05 >0,05 0,57 ± 0,01 0,58 ± 0,02 0,55 ± 0,04 >0,05 54,75 ± 3,28 61,61 ± 3,98 57,99 ± 5,46 >0,05 Bảng Sự thay đổi số sinh hóa lô sau 90 ngày Lô Chỉ số ALT (U/L) AST (U/L) Creatinin (mg/dL) BUN (mg/dL) Lô sinh lý Lô thử Lô thử (n = 12) (n = 12) (n = 12) ( X ± SD) 60,57 ± 5,38 83,11 ± 7,08 0,60 ± 0,01 57,95 ± 2,99 ( X ± SD) 60,49 ± 6,58 106,99 ± 10,27 0,61 ± 0,01 56,18 ± 4,34 Sau 28 ngày 90 ngày số sinh hóa theo dõi AST, ALT, creatinin, BUN lô thử so với lơ sinh lý khơng có khác biệt, đồng thời so với trước điều trị thay đổi ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 96 ( X ± SD) 55,45 ± 2,29 98,24 ± 7,23 0,60 ± 0,02 43,68 ± 2,30 p > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 2.5 Quan sát hình thái đại thể quan Quan sát đại thể cho thấy sau 28 ngày 90 ngày thử nghiệm, quan tim, phổi, gan, thận hệ thống tiêu hóa chuột lơ thử nghiệm CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC khơng có tượng bất thường Toàn gan, thận màu đỏ tươi, bề mặt láng mịn, khơng có tượng phù nề hay sung huyết Đối chiếu với lơ sinh lý khơng có khác biệt kích thước, hình thái, màu sắc, độ đàn hồi Điều chứng tỏ sau 28 ngày 90 ngày uống viên bổ xương khớp không làm thay đổi hình thái gan, thận chuột (hình 3.1) 2.6 Quan sát hình thái mơ bệnh học gan, thận Bảng Tổng hợp kết phân tích mơ bệnh học gan lô chuột Lô Sinh lý Lô thử Lô thử Lô thử Lô thử Kết phân tích vi thể 6/6 mẫu gan bình thường, khơng phát hiện tởn thương 6/6 mẫu gan bình thường, khơng phát hiện tởn thương 6/6 mẫu gan bình thường, khơng phát hiện tởn thương 6/6 mẫu gan bình thường, khơng phát hiện tởn thương 6/6 mẫu gan bình thường, khơng phát hiện tởn thương Mơ gan bình thường, khơng phát tổn thương Hình Hình ảnh vi thể gan chuột lô sinh lý (chuột 4) sau 28 ngày, HE, x10 x 40 Hình Hình ảnh vi thể gan chuột lơ thử (chuột 7) sau 28 ngày, HE, x 10 x 40 Hình Hình ảnh vi thể gan chuột lô thử (chuột 11) sau 90 ngày, HE, x 10 x 40 97 TẠP CHÍ Y DƯỢC THỰC HÀNH 175 - SỐ 14 - 6/2018 Hình ảnh vi thể gan kính hiển vi với độ khuếch đại 10 lần 40 lần chuột lô sinh lý, lơ thử 1, 2, 3, có cấu trúc gan bình thường, khơng phát tổn thương tiểu thùy, quanh tĩnh mạch trung tâm quanh khoảng cửa (hình 1, 2, 3) Bảng 10 Tổng hợp kết phân tích mơ bệnh học thận lơ chuột sau 28 ngày Lơ Kết phân tích vi thể 4/6 mẫu thận bình thường, khơng phát tởn thương Sinh lý (Nước cất) 2/6 mẫu viêm thận-bể thận mạn tính có tượng thấm nhập nhiều lympho bào, tương bào mô kẽ quanh ống thận, bể thận kèm rải rác có ống thận bị phá hủy 4/6 mẫu thận bình thường, khơng phát tởn thương Lô thử 2/6 mẫu viêm thận-bể thận mạn tính có tượng thấm nhập nhiều lympho bào, tương bào mô kẽ quanh ống thận, bể thận kèm rải rác có ống thận bị phá hủy 4/6 mẫu thận bình thường, khơng phát tởn thương Lơ thử 2/6 mẫu viêm thận-bể thận mạn tính có tượng thấm nhập nhiều lympho bào, tương bào mô kẽ quanh ống thận, bể thận kèm rải rác có ống thận bị phá hủy Bảng 11 Tổng hợp kết phân tích mơ bệnh học thận lô chuột sau 90 ngày Lô Kết phân tích vi thể 6/6 mẫu viêm thận - bể thận mạn tính có tượng thấm nhập nhiều lympho bào, tương bào mô kẽ quanh ống thận, bể thận kèm rải rác có ống thận bị phá hủy Sinh lý Lô thử Lô thử 6/6 mẫu viêm thận - bể thận mạn tính có tượng thấm nhập nhiều lympho bào, tương bào mô kẽ quanh ống thận, bể thận kèm rải rác có ống thận bị phá hủy 6/6 mẫu viêm thận - bể thận mạn tính có tượng thấm nhập nhiều lympho bào, tương bào mô kẽ quanh ống thận, bể thận kèm rải rác có ống thận bị phá hủy Mơ thận khơng có tượng viêm, khơng phát sỏi 98 CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Hình Hình ảnh vi thể thận chuột lô sinh lý (chuột 4) sau 28 ngày, HE, x 10 x 40 Hình Hình ảnh vi thể thận chuột lơ thử (chuột 7) sau 28 ngày, HE, x10 x 40 Mơ thận khơng có tượng viêm, khơng phát sỏi Hình Hình ảnh vi thể thận chuột lô thử (chuột 10) sau 90 ngày, HE, x10 x 40 Mơ thận có tượng thấm nhập nhiều lympho bào, tương bào mô kẽ quanh ống thận, bể thận kèm rải rác có ống thận bị phá hủy Sau 28 ngày uống viên bổ xương khớp với liều 500 mg/kg liều 1000 mg/ kg, hình ảnh vi thể thận kính hiển vi với độ khuếch đại 10 lần 40 lần chuột lơ có số mẫu có thay đổi nhẹ Tuy nhiên so sánh lô với khơng có khác biệt Sau 90 ngày thử nghiệm, chuột lơ có tình trạng viêm thận - bể thận mạn tính với tượng thấm nhập nhiều lympho bào, tương bào mô kẽ quanh ớng thận, bể thận kèm rải rác có ống thận bị phá hủy Kết giải thích thời điểm trước đưa vào thử nghiệm có độ tuổi -7 tuần tuổi, thời điểm chuột tăng trưởng phát triển mạnh Sau 90 ngày thử nghiệm, chuột độ tuổi cao nên thận bị tổn thương tương ứng với tình trạng lão hóa, suy giảm chức thận theo độ tuổi So với lô sinh lý, số lượng mẫu thận chuột bị tổn thương lô thử 3, không thay đổi Điều chứng tỏ việc uống viên bổ xương khớp thời 99 TẠP CHÍ Y DƯỢC THỰC HÀNH 175 - SỐ 14 - 6/2018 gian 90 ngày không ảnh hưởng đáng kể đến cấu trúc vi thể thận Từ kết nghiên cứu trọng lượng cht, tình trạng chung chuột tuần, số huyết học, sinh hóa quan sát hình ảnh đại thể, hình ảnh mơ bệnh học gan thận chuột cho thấy khơng có khác biệt lô thử nghiệm với lô đối chứng suốt 28 ngày, 90 ngày uống thuốc liên tục liều thử Do kết luận viên bổ xương khớp không gây độc bán trường diễn động vật thực nghiệm KẾT LUẬN - Độc tính cấp: với liều gấp 31 lần liều điều trị, thuốc khơng có độc cấp tính, khơng xác định LD50 - Độc tính bán trường diễn: với liều 500 mg/kg/ngày liều 1000 mg/ kg/ngày (tương đương với liều điều trị dự kiến viên/ngày liều viên/ngày người), uống liên tục 28 ngày 90 ngày, viên bổ xương khớp không ảnh hưởng đến phát triển trọng lượng chuột, không biến đổi số huyết học, chức gan (AST, ALT), chức 100 thận (BUN, creatinin) không gây biến đổi tổ chức học tế bào gan, thận, không gây độc bán trường diễn động vật thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2015), “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”, Quyết định số 141/QĐ-K2ĐT, tr 8-23 OECD-407 (2008), Repeated Dose 28-Day Oral Toxicity Study in Rodents, Guidelines for the testing of chemicals OECD-408 (2008), Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents, Guidelines for the testing of chemicals OECD-420 (2001), Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Procedure, Guidelines for the testing of chemicals Mark A Suckow, Peggy Danneman, Cory Brayton, (2012), “Hematology”, The Laboratory Mouse, Boca Raton London New York Washington, D.C CRC Press  ... an tồn viên bổ xương khớp, tiến hành đề tài với mục tiêu: Xác định  độc tính cấp độc tính bán trường diễn viên bổ xương khớp ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt...c biệt lô thử nghiệm với lô đối chứng suốt 28 ngày, 90 ngày uống thuốc liên tục liều thử Do kết luận viên bổ xương khớp không gây độc bán trường diễn động vật thực nghiệm KẾT LUẬN - Độc tính cấp... độ xương bệnh nhân loãng xương [1] Cao xương cá sấu điều trị trẻ bị bệnh tạo xương bất tồn có cải thiện mật độ khống xương Trên sở đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu chế phẩm viên bổ xương khớp,