Bài viết trình bày việc đánh giá được độc tính cấp và bán trường diễn của viên nang cứng Kaviran trên động vật thực nghiệm. Phương pháp nghiên cứu: Chuột nhắt trắng được chia làm 8 lô, mỗi lô 12 con để thử độc tính cấp; thỏ chia 3 lô, mỗi lô 12 con để đánh giá độc tính bán trường diễn trên thỏ trong 42 ngày.
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Đánh giá độc tính cấp bán trường diễn động vật thực nghiệm viên nang cứng Kaviran bào chế từ nhàu, cúc hoa vàng sâm ngọc linh sinh khối Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Thị Thanh Hải Nguyễn Tùng Linh, Trịnh Nam Trung, Đỗ Quyết Học viện Quân y TÓM TẮT Mục tiêu: Đánh giá độc tính cấp bán trường diễn viên nang cứng Kaviran động vật thực nghiệm Phương pháp nghiên cứu: Chuột nhắt trắng chia làm lơ, lơ 12 để thử độc tính cấp; thỏ chia lô, lô 12 để đánh giá độc tính bán trường diễn thỏ 42 ngày; Kết quả: Kaviran dùng đường uống chuột nhắt trắng đến mức liều cao cho chuột nhắt uống 36g/kg KLCT/24h, sau 72 đến ngày khơng thấy chuột thí nghiệm chết Khi cho thỏ uống Kaviran liều 240mg 1.200mg/ kg/ 24 liên tục 42 ngày khơng nhận thấy có ảnh hưởng đến khối lượng thể, không biến đổi điện tim thỏ số huyết học (bạch cầu, hồng cầu, HST, tiểu cầu); số đánh giá chức gan (hoạt độ ALT, AST), thận (nồng độ creatinin, ure) giới hạn bình thường; đại thể mô bệnh học gan, thận, lách thỏ không nhận thấy dấu hiệu bất thường Kết luận: Chưa tìm thấy LD50 chuột nhắt trắng theo đường uống; Kaviran uống liều 240 1.200mg/ kg/ 24 42 ngày không ảnh hưởng đến khối lượng thể, số huyết học, chức gan, thận lách thỏ thực nghiệm Từ khóa: Kaviran, LD50, độc tính bán trường diễn ĐẶT VẤN ĐỀ Viên nang cứng Kaviran bào chế từ bột cao khô nhàu (180mg/viên), bột cao khô cúc hoa vàng (180mg/viên) bột cao khô sâm Ngọc Linh sinh khối (60mg/viên) Các nghiên cứu gần cho thấy nhàu cúc hoa vàng (CHV) có nhiều tác dụng sinh học q như: tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá, ức chế khối u, kháng khuẩn, chống nấm, chống viêm…[1], [2] Sâm Ngọc linh sinh khối (NLSK) có tác dụng tăng lực, tăng q trình nhận thức ghi nhớ, chống oxy hóa, bảo vệ gan [3] Hiện nay, chưa có chế phẩm thuốc kết hợp ba loại dược liệu Do đó, nhằm nghiên cứu bào chế loại thuốc từ ba dược liệu nhằm tăng cường miễn dịch, bảo vệ gan chống gốc tự do, nghiên cứu bào chế thành công viên nang Kaviran Tuy nhiên, qua trình chiết xuất, bào chế việc phối hợp ba thành phần dược liệu cơng thức bào chế làm thay đổi độc tính tác dụng chế phẩm so với Ngày nhận bài: 10/11/2020 Ngày phản biện: 23/12/2020 Ngày chấp nhận đăng: 28/12/2020 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 67 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG dược liệu ban đầu Do vậy, việc đánh giá độc tính cấp, bán trường diễn tác dụng sinh học động vật thực nghiệm cần thiết Trong nghiên cứu này, chúng tơi cơng bố kết đánh giá độc tính cấp bán trường diễn viên nang động vật thực nghiệm NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu, thiết bị động vật nghiên cứu - Nguyên vật liệu: Viên nang cứng Kaviran Học viện Quân y nghiên cứu sản xuất đạt tiêu chuẩn sở - Thiết bị: Máy xét nghiệm sinh hoá tự động Chemix 180, hãng Sysmex; máy xét nghiệm huyết học tự động XE2100, hãng Sysmex; máy điện tim NIHON KOHDEN Corporation (Đức) - Động vật thí nghiệm: Thỏ chủng Orytolgus cuniculus, giống, trưởng thành, khỏe mạnh, cân nặng 2,0 ± 0,2kg Chuột nhắt trắng chủng Swiss, hai giống, khỏe mạnh, cân nặng 20,0 ± 2,0g Động vật ni phịng thí nghiệm, ánh sáng tự nhiên, uống nước ăn thức ăn nấu chín, bảo đảm theo nhu cầu Phương pháp nghiên cứu Đánh giá độc tính cấp Tiến hành theo hướng dẫn Bộ Y tế, OECD WHO [4], [5], [6] Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô 12 Cho chuột uống viên nang cứng Kaviran với mức liều tăng dần Chuột ni dưỡng chu đáo, theo dõi tình trạng chung xác định tỷ lệ chuột chết 72 lô sau uống thuốc tiếp tục theo dõi đến ngày thứ Đánh giá độc tính bán trường diễn Tiến hành theo quy định WHO Bộ Y tế [4], [6] - Thỏ trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô 12 con: 68 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 + Lô chứng: uống dung dịch natri clorid 0,9%, liều 2,5 ml/kg/24 h + Lô thử liều 1: uống viên Kaviran mức liều 240mg/kg/24h + Lô thử liều 2: uống viên Kaviran mức liều 1200mg/kg/24h Tất thỏ nghiên cứu uống liên tục thời gian 42 ngày - Các tiêu đánh giá: + Sinh lý - dược lý: Theo dõi tình trạng chung, hoạt động, ăn uống, đặc biệt khối lượng thể (KLCT) điện tim + Huyết học: Hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, tiểu cầu + Sinh hóa: AST, ALT, ure, creatinin + Mơ bệnh học: Vào ngày thứ 42, giết thỏ, quan sát hình ảnh đại thể gan, lách, thận Sau sinh thiết tạng để nghiên cứu hình ảnh mơ bệ`nh học tại Khoa Giải phẫu bệnh - Học viện Quân y - Thời điểm xét nghiệm: Lấy máu xét nghiệm số sinh hóa, huyết học, ghi điện tim, thời điểm: xuất phát điểm, sau tuần, sau tuần Xử lý số liệu Các liệu phân tích phần mềm Microsoft excel 2007 Sự khác biệt giá trị trung bình lơ chuột đánh giá Duncan’s Multiple Range Test phần mềm SAS (α = 0,05) Quy ước: Khi so sánh nhóm, giá trị cột có ký tự (biểu thị theo a, b, c, d ) khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết đánh giá độc tính cấp viên nang Kaviran theo đường uống Chuột nhắt trắng phân chia ngẫu nhiên thành lô uống Kaviran với mức liều tăng dần Theo dõi tình trạng chuột, tỷ lệ sống chết lô 72 đến ngày sau uống thuốc Kết trình bày bảng 3.49 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Bảng Tỷ lệ chuột sống, chết sau 72 uống Kaviran STT Liều sử dụng (g/kg KLCT) n Số lượng động vật chết Số lượng động vật sống 10,80 12 12 14,40 12 12 18,00 12 12 21,60 12 12 25,20 12 12 28,80 12 12 32,40 12 12 36,00 12 12 Bảng cho thấy: Dùng Kaviran đến mức liều cao cho chuột nhắt uống 36g/kg KLCT/24h (gấp 50 lần liều dự kiến lâm sàng), lượng thuốc tạo thành dịch đặc cịn qua kim đầu tù Sau 72 khơng thấy chuột thí nghiệm chết tất lô nghiên cứu Sau ngày, giết chuột quan sát đại thể cho thấy trạng thái màu sắc tạng (Gan, thận, phổi, tim, lách) tất chuột khơng có phù nề, xuất huyết, không thay đổi màu sắc so với lơ chứng, lịng dày ruột khơng có xuất huyết hoại tử Như vậy, không xác định LD50 Kaviran theo đường uống chuột nhắt trắng Kết đánh giá độc tính bán trường diễn Kaviran Ảnh hưởng Kaviran đến khối lượng thể thỏ Bảng Ảnh hưởng Kaviran khối lượng thể thỏ, n=12 Khối lượng thể thỏ (kg) lô nghiên cứu Thời điểm nghiên cứu Chứng Kaviran liều Kaviran liều t0 2,05 ± 0,103 b 2,09 ± 0,061 b 2,08 ± 0,099 b > 0,05 t3 2,15 ± 0,098 a 2,16 ± 0,082 a 2,17 ± 0,069 a > 0,05 t6 2,18 ± 0,075 a 2,20 ± 0,060 a 2,22 ± 0,072 a > 0,05 p Giá trị cột có ký tự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Bảng cho thấy: KLCT thỏ hai lô dùng Kaviran lô chứng sinh học thời điểm khác biệt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 KLCT ba lô thỏ tăng dần sau tuần thứ tuần thứ tăng so với thời điểm ban đầu (p < 0,05) Tuy nhiên, KLCT thỏ tuần thứ tăng lên so với tuần thứ khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Ảnh hưởng Kaviran đến điện tim thỏ TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 69 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Bảng Ảnh hưởng Kaviran điện tim thỏ, n = 12 Thời điểm t0 t3 t6 t0 t3 t6 Sóng bất thường p t0 - t3 - t6 Lô chứng Kaviran liều Tần số tim (CK/phút, TB ± SD) 271,17 ± 25,01 272,42 ± 21,33 271,58 ± 15,19 271,83 ± 17,43 276,33 ± 25,92 270,17 ± 19,50 Biên độ QRS (mV) 0,733 ± 0,159 0,771 ± 0,196 0,754 ± 0,121 0,825 ± 0,225 0,738 ± 0,146 0,857 ± 0,230 Không Không > 0,05 > 0,05 Kaviran liều p 267,25 ± 29,26 267,67 ± 26,42 268,25 ± 30,25 > 0,05 0,783 ± 0,199 0,800 ± 0,165 0,808 ± 0,173 Không > 0,05 > 0,05 - Bảng cho thấy: So sánh lô thời điểm thí nghiệm lơ thời điểm, tần số biên độ điện tim thỏ thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Khơng có sóng bất thường điện tim lô thỏ thời điểm nghiên cứu Ảnh hưởng Kaviran đến số tiêu huyết học thỏ Bảng Chỉ số hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu tiểu cầu lô thỏ nghiên cứu (n = 12) Chỉ tiêu Bạch cầu (109/l) Hồng cầu (1012 /l) HST (g/l) Tiểu cầu (109/l) Thời điểm t0 t3 t6 t0 t3 t6 t0 t3 t6 t0 t3 t6 Chứng 9,86 ± 2,70 9,03 ± 1,92 9,21 ± 1,96 4,89 ± 0,03 4,45 ± 0,78 4,80 ± 0,53 11,42 ± 0,29 10,79 ± 1,54 11,56 ± 0,94 352,83 ± 82,79 345,42 ± 64,53 381,25 ± 99,49 Kaviran liều 9,93 ± 2,47 9,60 ± 2,59 9,41 ± 2,23 4,81 ± 0,16 4,96 ± 0,34 4,77 ± 0,51 11,12 ± 0,54 b 11,80 ± 0,70 a 11,41 ± 0,93 ab 349,58 ± 78,33 346,17 ± 57,07 373,67 ± 74,30 Kaviran liều 9,02 ± 1,64 8,92 ± 2,35 8,49 ± 1,74 4,67 ± 0,29 4,90 ± 0,63 4,85 ± 0,50 11,03 ± 0,82 11,47 ± 1,03 11,56 ± 0,82 299,33 ± 23,15 b 365,22 ± 85,27 a 373,42 ± 85,40 a p > 0,05 p3-1< 0,05 > 0,05 > 0,05 p2-1< 0,05 > 0,05 > 0,05 Giá trị cột số có ký tự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05), khơng ghi ký tự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Bảng cho thấy: Khi so sánh thời điểm có hồng cầu lô uống Kaviran liều thấp lô chứng thời điểm ban đầu (p < 0,05) huyết sắc tố lô Kaviran liều cao lô chứng thời điểm sau tuần (p < 0,05) Khi so sánh thời điểm khác lơ có 70 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG huyết sắc tố lô Kaviran liều thời điểm sau tuần tăng lên so với ban đầu, sau tuần lại giảm xuống tương đương với thời điểm ban đầu (p > 0,05) Ở lô uống Kaviran liều sau tuần tuần có tiểu cầu cao so với ban đầu, so với lô chứng không khác biệt (p > 0,05), cịn lại khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Ảnh hưởng Kaviran lên chức gan, thận thỏ thực nghiệm Bảng Nồng độ AST, ALT, Creatinin Ure lô thỏ (n = 12) Chỉ tiêu ALT (U/l) AST (U/l) Creatinin (mmol/l) Ure (mmol/l) Thời điểm Chứng Kaviran liều Kaviran liều t0 76,08 ± 11,82 71,67 ± 16,64 b 70,08 ± 17,80 b t3 84,79 ± 9,06 84,60 ± 6,47 a 83,98 ± 13,54 a t6 82,13 ± 12,96 81,56 ± 10,88 ab 78,30 ± 10,95 ab t0 48,91 ± 8,38 50,31 ± 12,01 52,28 ± 16,14 t3 46,80 ± 12,65 48,62 ± 11,94 47,99 ± 14,52 t6 49,34 ± 15,82 52,11 ± 15,89 57,98 ± 10,85 t0 121,11 ± 13,79 111,93 ± 16,50 110,41 ± 17,36 t3 117,78 ± 21,52 113,98 ± 13,13 109,73 ± 13,55 t6 115,93 ± 8,33 114,84 ± 14,12 114,60 ± 19,84 t0 6,61 ± 1,38 6,34 ± 1,46 5,74 ± 0,94 t3 6,20 ± 0,89 6,27 ± 1,09 6,23 ± 0,72 t6 6,65 ± 2,23 6,41 ± 2,23 6,62 ± 2,02 Giá trị cột số có ký tự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05), không ghi ký tự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Bảng cho thấy: So sánh lô thời điểm thí nghiệm lơ thời điểm hoạt độ enzym AST, ALT hàm lượng creatinin, ure máu thay đổi khơng có ý A B p > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 nghĩa thống kê (p > 0,05) Chỉ riêng nhóm dùng Kaviran liều liều 2, sau tuần có hàm lượng ALT cao thời điểm ban đầu (p < 0,05), sau tuần lại giảm xuống so với thời điểm ban đầu sau tuần khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Đại thể mô bệnh học gan, thận lách thỏ thí nghiệm C Hình Hình ảnh đại thể gan, thận, lách thỏ lô chứng sinh học (A), Kaviran liều (B), Kaviran liều (C) TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 71 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Hình cho thấy: Quan sát đại thể mắt thường kính lúp có độ phóng đại 25 lần cho thấy: Màu sắc, hình thái gan, lách thận lơ dùng Kaviran liều không khác so với lô chứng Kết đánh giá mô bệnh học trình bày bảng bảng Bảng Hình ảnh mơ bệnh học gan, thận lách thỏ thí nghiệm Lơ thỏ Hình ảnh mơ bệnh học gan, thận, lách thỏ đại diện nhóm thỏ Gan Thận Lách Lô chứng sinh học Kaviran liều (240mg/ kg/ 24h) Kaviran liều (1200mg/ kg/ 24h) Bảng Tóm tắt nhận xét mơ bệnh học gan, thận, lách thỏ thí nghiệm Lơ thỏ Vi thể - Gan: Có cấu trúc gồm tiểu thùy gan khoảng cửa Các tế bào gan bình thường - Thận: có vỏ vùng tủy Các tiểu cầu thận ống thận bình thường Mơ kẽ khơng có tổn thương Chứng sinh - Lách: Cấu trúc lách bình thường vùng tủy trắng tuỷ đỏ rõ Tuỷ trắng có nang lympho, trung tâm có học động mạch bút lông, bao xung quanh lưới tế bào võng Tuỷ đỏ gồm thừng lách (dây Billroth) xen kẽ với xoang tĩnh mạch lót lớp tế bào nội mơ Thừng lách có tế bào lympho, tế bào võng, mẫu tiểu cầu tế bào máu khác - Gan: Cấu trúc gan rõ tiểu thùy gan khoảng cửa Các tế bào gan bình thường thối hóa hạt nhẹ Kaviran liều - Thận: Vùng vỏ thận với tiểu cầu thận ống thận có cấu trúc bình thường (240mg/ - Lách: Vùng tuỷ trắng với nang lympho có tăng sinh nhiều lympho bào xếp xung quanh động mạch kg/ 24h) bút lông Vùng tuỷ đỏ giãn rộng với xoang mạch xung huyết, thấy có mẫu tiểu cầu 72 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Kaviran liều (1200mg/ kg/ 24h) - Gan: Cấu trúc gan rõ tiểu thùy gan khoảng cửa Các tế bào gan bình thường có thối hóa hạt nhẹ - Thận: Vùng vỏ thận với tiểu cầu thận ống thận có cấu trúc bình thường - Lách: Vùng tuỷ trắng với nang lympho có tăng sinh nhiều lympho bào xếp xung quanh động mạch bút long Vùng tuỷ đỏ giãn rộng với xoang mạch xung huyết, thấy có mẫu tiểu cầu BÀN LUẬN Việc đánh giá tính an toàn điều kiện bắt buộc chế phẩm bào chế từ dược liệu, qua trình bào chế xảy q trình hóa học làm thay đổi thành phần hóa học Thêm nữa, việc kết hợp nhiều dược liệu chế phẩm làm thay đổi tác dụng mà độc tính Do đó, cần đánh giá tính an tồn sản phẩm cuối cùng, cho dù liệu độc tính nguyên liệu dự báo trước Bảng cho thấy: Viên nang Kaviran uống với liều cao 36g/kg cân nặng (Gấp 50 lần liều dự kiến lâm sàng), sau 24 ngày khơng thấy bất thường khơng có chuột chết, chứng tỏ viên nang Kaviran có tính an tồn cao Căn theo liều thường dùng dược liệu hàm lượng hoạt chất viên, xác định mức liều dự kiến lâm sàng viên Kaviran viên/ ngày, từ tính liều thử thỏ (gấp lần liều dự kiến lâm sàng) Trong đó, mức liều 240mg/kg tương đương liều dự kiến lâm sàng, liều 1200mg/kg cao gấp lần liều dự kiến lâm sàng Hiện nay, thời gian thử độc tính bán trường diễn thường tính theo cách: Thời gian thử thuốc gấp - lần thời gian dự kiến lâm sàng Hoặc thử theo khoảng thời gian xác định: 14, 28 90 ngày Đối với viên Kaviran, thời gian dự kiến dùng người - 10 ngày Do vậy, theo cách tính thứ thời gian thử nghiệm 10 ngày x lần = 40 ngày Để thuận tiện cho việc thử nghiệm, đề tài lựa chọn thời gian thử nghiệm 42 ngày (6 tuần) Các lô thỏ đánh giá thời điểm ban đầu, sau tuần Kết thử nghiệm thỏ cho thấy: Chế phẩm Kaviran uống liên tục 42 ngày với mức liều 240mg 1200mg/kg/24h khơng thấy có biến đổi bất thường sinh hóa, huyết học mơ bệnh học (gan, thận, lách) KẾT LUẬN Không xác định LD50 Kaviran theo đường uống chuột nhắt trắng thử đến mức liều cao cho chuột nhắt uống 36g/ kg KLCT/24h (gấp 50 lần liều dự kiến lâm sàng) Kaviran uống liên tục 42 ngày với mức liều 240mg 1200mg/kg/24h thỏ thực nghiệm khơng thấy có biến đổi bất thường khối lượng thể, điện tim, số huyết học mô bệnh học (gan, thận, lách) SUMMARY Evaluation of the acute and subchronic toxicity of kaviran capsule Objectives: To evaluate the acute and subchronic toxicity of Kaviran capsule Methods: Mice were divided into groups, each group included 12 mice to evaluate the acute toxicity; rabbits were divided into groups, 12 rabbits in each groups for the evaluation of subacute toxicity in 42 days Results: the median lethal dose, LD50 hasn’t been found with maximum oral dosage of 36 g/kg/24h on mice At the dosage of 240mg and 1200 mg/kg/24h on rabbit, continuously administrated for 42 days didn’t TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 73 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG affect the normal increment of body weight of rabbit, didn’t change the electrocardiogram, hematological indices such as red blood cell, white blood cell, platelet and hemoglobin content, hepatic indices (AST, ALT activity), renal indices (urea, creatinin levels) were within normal limits There were no abnormality on the liver, kidney and spleen of the rabbits macro-and micro-morphologically Conclusion: LD50 hasn’t been found with maximum oral dosage At the dosage of 240mg and 1200 mg/kg/24h on rabbit, continuously administrated for 42 days didn’t affect the functions of liver, kidney and spleen of the rabbits Key words: Kaviran, antioxydants, hepatoprotective effects TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Thị Vân Anh (2011) Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch chống oxy hóa cao nhàu thực nghiệm, Luận án Tiến sỹ y học, Trường Đại học Y Hà Nội Trần Vân Hiền, Trần Thanh Loan, Nguyễn Đặng Dũng cộng (2008), “Tác dụng chống oxy hóa, chống gốc tự flavonoid chiết xuất từ cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.)”, Tạp chí Y – Dược học quân sự, số -2008 Nguyễn Văn Long (2011), Nghiên cứu qui trình tạo sinh khối tế bào đánh giá số tác dụng sinh học sâm Ngọc linh sinh khối, Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y Đỗ Trung Đàm (2014), Phương pháp xác định độc tính thuốc, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 184-215 OECD 423 (2001), OECD guideline for testing of chemicals - Acute oral toxicity – Acute toxic class method World Health Organization (2000), General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional Medicine 74 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 ... việc đánh giá độc tính cấp, bán trường diễn tác dụng sinh học động vật thực nghiệm cần thiết Trong nghiên cứu này, cơng bố kết đánh giá độc tính cấp bán trường diễn viên nang động vật thực nghiệm. .. định LD50 Kaviran theo đường uống chuột nhắt trắng Kết đánh giá độc tính bán trường diễn Kaviran Ảnh hưởng Kaviran đến khối lượng thể thỏ Bảng Ảnh hưởng Kaviran khối lượng thể thỏ, n=12 Khối lượng... cứu qui trình tạo sinh khối tế bào đánh giá số tác dụng sinh học sâm Ngọc linh sinh khối, Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y Đỗ Trung Đàm (2014), Phương pháp xác định độc tính thuốc, Nhà xuất