Nhằm có lựa chọn phù hợp trong các dạng chế phẩm có tính kháng viêm chứa Lược vàng ở liều an toàn, đề tài tiến hành đánh giá độc tính cấp và tác động kháng viêm của dịch chiết cồn của lá Lược vàng khô và cao đặc từ dịch ép lá Lược vàng tươi trên chuột.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC ĐỘNG KHÁNG VIÊM CỦA CAO ĐẶC TỪ DỊCH CHIẾT LÁ LƯỢC VÀNG KHÔ VÀ TƯƠI (Callisia fragrans (Lindl.) Woodson) Dương Quang Anh*, Trần Anh Vũ** TĨM TẮT Đặt vấn đề: Nhằm có lựa chọn phù hợp dạng chế phẩm có tính kháng viêm chứa Lược vàng liều an toàn, đề tài tiến hành đánh giá độc tính cấp tác động kháng viêm dịch chiết cồn Lược vàng khô cao đặc từ dịch ép Lược vàng tươi chuột Phương pháp nghiên cứu: Đánh giá độc tính cấp đường uống theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon Khảo sát độc tính cấp đường uống cao chuột đực cái, theo dõi tỉ lệ chết biểu độc tính 72 Đánh giá tác động kháng viêm bàn chân chuột carrageenan 1%, cho chuột uống cao, đo thể tích bàn chân chuột ngày Kết quả: Đối với cao đặc từ dịch chiết cồn khô LD50 11,93± 0,15 g/kg, tương đương 897.33g (886.77- 907.07) dược liệu tươi /kg thể trọng chuột Đối với cao đặc từ dịch ép tươi, không xác định LD50 liều tối đa không gây chết chuột LD0 6,5 g/kg (tương đương với 689,3 g tươi/kg thể trọng chuột) Cao đặc từ dịch chiết cồn khơ có tác dụng kháng viêm cấp với liều 181 mg/kg thực nghiệm gây phù chân chuột Cao đặc từ dịch ép tươi có tác dụng kháng viêm cấp với liều 111 mg/kg Cả loại cao thể tác động kháng viêm nhiên sau thời gian 48, 72 gây viêm, cao đặc từ dịch chiết khơ có tác dụng kháng viêm chậm so với lô đối chiếu sử dụng thuốc đối chiếu Celebrex®liều 25 mg/kg Cao đặc từ dịch ép tươi thể mức độ kháng viêm thể thuốc đối chiếu Celebrex® 25 mg/kg thời điểm 48 72 Kết luận: Cao đặc dịch chiết cồn từ khô dịch ép tươi có liều gây độc xa liều có tác dụng Cả có tác dụng kháng viêm cấp Điều sở để phát triển sản phẩm chứa Lược vàng có tác dụng kháng viêm từ nguồn nguyên liệu ổn định nước Từ khóa: Lược vàng, cao đặc, độc tính cấp, kháng viêm ABSTRACT STUDY ON ACUTE TOXICITY AND ANTI-INFLAMATORY OF THE CONCENTRATED EXTRACTS OF DRIED AND FRESH BASKET PLANT LEAVES Duong Quang Anh, Tran Anh Vu * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 188 -194 Introduction: To create suitable options among the anti-inflammatory products which contain basket plant at the safe doses, this study was conducted to evaluate chronic toxicity and anti-inflammatory effect of the concentrated extracts prepared from the liquid ethanol extract of dried basket plant leaves and from the juice of fresh basket plant leaves on mouse models Methods: The oral chronic toxicity was evaluated by Litchfield – Wilcoxon method After oral administration of single doses of extracts from the liquid ethanol of dried basket plant leaves or from the juice of fresh basket plant leaves, mortality and toxic signs in both sexes of mice were observed within 72 hours The antiinflammatory activity was evaluated by carrageenan-induced mouse paw edema inflamation model Paw *Khoa Dược, Đại học Lạc Hồng Đồng Nai **Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Trần Anh Vũ ĐT: 0903 932 504 Email: trananhvubc@yahoo.com 188 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học volume was measured with a plethysmometer for consecutive days Results: The concentrated extract prepared from the liquid ethanol extract of dried basket plant leaves has an LD50 of 11,93± 0,15 g/kg which is equivalent to 897.33g (886.77- 907.07) of fresh basket plant leaves per kg of mouse body weight The concentrated extract prepared from the juice of fresh basket plant leaves doesn’t identify an LD50 and has a maximum non- lethal dose in mice ( LD0 ) of 6,5 g/kg which is equivalent to 689,3 g of fresh basket plant leaves per kg of mouse body weight When testing by carrageenan-induced mouse paw edema inflamation model, chronic anti-inflammatory effect of the concentrated extract prepared from the ethanol extract of dried basket plant leaves is 181 mg/kg The concentrated extract from the juice of fresh basket plant leaves shows chronic anti-inflammatory effect at the dose of 111 mg/kg Both of the concentrated extracts show anti-inflammatory effects, however after 48, 72 hours of inflammation, the concentrated extract prepared from the ethanol extract of dried basket plant leaves has lower anti-inflammatory effect than that of the reference medicine namely Celebrex® at the dosage of 25 mg/kg Anti-inflammatory effects of the concentrated extract prepared from the juice of fresh basket plant leaves is higher than that of the reference medicine (Celebrex®, at the dosage of 25 mg/kg) at the time periods of 48 and 72 hours Conclusions: The toxic doses of the concentrated extracts prepared from the ethanol extract of dried basket plant and from the juice of fresh basket plant leaves are far from the effective doses Both of these extracts also show chronic anti-inflammatory effects This result would be the foundation for the development of anti-inflammatory products containing basket plant from the local stable source of materials Key words: Callisia fragrans (Lindl.) Woodson, concentrated extract, acute toxicity, anti-inflamatory ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Viêm tình trạng hay gặp phải, ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe, làm giảm chất lượng sống Viêm kéo dài dẫn tới viêm mạn tính, hay tái phát khơng điều trị hay điều trị không cách Việc sử dụng thuốc kháng viêm tân dược thường gây nhiều tác dụng phụ tiêu hóa, tim mạch, thận,… Vì việc nghiên cứu thuốc kháng viêm có hiệu từ nguồn gốc dược liệu sẵn có ổn định nước điều cần thiết Đối tượng Gần Lược vàng người dân giới chuyên mơn quan tâm hiệu điều trị thực tế nhiều doanh nghiệp đầu tư trồng với qui mô lớn nước Mục tiêu đề tài đánh giá độc tính cấp tác động kháng viêm cao đặc từ dịch chiết Lược vàng khô tươi, từ chọn lựa đề nghị liều an toàn, phát huy tác động kháng viêm dạng chế phẩm có chứa cao đặc Lược vàng Chuyên Đề Dược Lá Lược vàng tươi công ty Tâm Lan, Tây Ninh cung cấp, thu hoạch vào tháng 3, 8, 12 năm 2014, tháng năm 2015 Cây tươi giám định tên khoa học môn thực vật Trường đại học Dược Hà Nội (Phiếu giám định số 27/14/HUY/TVD) Mẫu thử cao đặc từ dịch ép Lược vàng tươi (cao Lược vàng tươi) từ dịch cồn 40% (cao Lược vàng khô) phương pháp ngấm kiệt Lược vàng khơ có độ ẩm khoảng 10%, xay nửa mịn Cao Lược vàng tươi có độ ẩm 9,4%, hiệu suất chiết 1,03%( kl/kl) Cao Lược vàng khơ có độ ẩm 9,0%, hiệu suất chiết 33,56% (kl/kl) Động vật nghiên cứu Động vật sử dụng nghiên cứu kháng viêm: Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 25 ± 2g ) cung cấp Viện Pasteur TP.HCM 189 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Động vật sử dụng nghiên cứu độc tính cấp: Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, 22 ± g) cung cấp Viện Vacxin Sinh phẩm Y tế Nha Trang Chuột ổn định tuần trước thực nghiệm, nuôi thực phẩm viên cung cấp viện Pasteur TP.HCM nước uống đầy đủ Hóa chất - Thuốc đối chiếu – Thiết bị Carrageenan (Sigma-Aldrich, Mỹ), thuốc đối chiếu Celebrex® (Celecoxib 200 mg/ viên, Pfizer) Máy đo thể tích chân chuột Plethysmometer, Ugo Basile, Italy Phương pháp nghiên cứu Đánh giá độc tính cấp đường uống Nguyên tắc: Chuột nhắt chia thành lô chuột lô, chuột lô nhận liều chất khảo sát Đánh giá phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết) chuột lô sau 72 Chuột tiếp tục theo dõi sau 14 ngày uống để ghi nhận triệu chứng bất thường (nếu có)(1,3,5) Thử nghiệm sơ khởi Khởi đầu từ liều cao qua kim cho uống Nếu liều gây chết 100% chuột thử nghiệm giảm liều xuống nửa liều đầu, giảm dần đến liều không gây chết thú vật (LD0) liều thấp gây chết 100% chuột thử nghiệm (LD100) Thử nghiệm xác định Chuột đạt tiêu chuẩn thử nghiệm chia thành lô, lô con, cho sử dụng thuốc liều khoảng LD0 LD100, chia theo cấp số cộng cách 10 - 30% để dãy liều thử bao gồm LD0, LD50 LD100 Quan sát chuột 72 sau dùng thuốc, ghi nhận số chuột sống, chết lô Ghi nhận triệu chứng bất thường sau dùng thuốc lơ Có trường hợp xảy ra: Trường hợp 1: Sau cho chuột uống mẫu thử, số chuột lô thử nghiệm bảo tồn, xác định liều cao bơm qua kim mà không làm chết chuột Liều kí hiệu Dmax liều tương đối an toàn DS dùng thực nghiệm dược lí 1/5 Dmax lớn 1/5 Dmax Trường hợp 2: Sau cho chuột uống mẫu thử, tỉ lệ tử vong 100% liều chết tuyệt đối – LD100 Tính tốn gây lơ thử nghiệm để tiếp tục xác định liều không làm chết vật – LD0 Từ đó, suy liều LD50 tính theo cơng thức Karber – Behrens(1,5) Tính LD50 theo phương pháp Karber – Behrens Nguyên tắc: Dựa vào liều gần liều chết 50% D1 D2 với tỷ lệ chết tương ứng a1, a2 Tính hiệu số d = D1 - D2 a2-a1 Áp LD50 D1 dụng công thức: (50 a1) d a2 a1 Trường hợp 3: Sau cho chuột uống mẫu thử, phân suất tử vong thấp 100%, không xác định liều gây chết tuyệt đối Đối với trường hợp này, suy liều LD50, xác định liều tối đa không gây chết chuột, gọi liều liều chết – LD0 Liều tương đối an toàn DS dùng cho thực nghiệm dược lí có giá trị 1/5 1/10 LD0 Đánh giá tác động kháng viêm(2,4) Chuột chia ngẫu nhiên thành lô điều trị với số lượng 10-12 chuột/lô Chuột lô đo thể tích chân phải thiết bị đo thể tích chân chuột trước tiêm carrageenan 1% để làm đối chứng (số đo trước viêm) Liều thử nghiệm kháng viêm đề nghị dựa LD50 hay LD0 xác định phần thử độc tính cấp kết hợp liều thực tế người dân sử dụng có hiệu Lơ thử: Tiến hành tiêm carrageenan 1% (50 µl) vào gan bàn chân phải uống cao đặc Lược 190 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 vàng theo liều tính Cho uống lần sau: trước tiêm carrageenan lúc chiều (ngày 1), trước đo thể tích chân chuột chiều (các ngày 3) trước thể tích chân chuột (ngày 4) Lơ thuốc đối chiếu: gây viêm uống viên Celebrex® liều 25 mg/kg thể trọng chuột theo phác đồ tương tự lô thử Nghiên cứu Y học Lô chứng: gây viêm uống nước cất theo phác đồ tương tự lơ thử Đo thể tích chân chuột thiết bị đo thể tích chân chuột vào thời điểm giờ, 24 giờ, 48 72 (đo trước cho uống mẫu thử) sau tiêm carrageenan 1% Tiến hành đo lần lấy giá trị trung bình Độ sưng phù chân chuột biểu thị mức độ viêm tính cơng thức: Mức độ giảm viêm chân chuột lô thử nghiệm so với lơ chứng tính theo cơng thức: % ức chế = (X-Y) / X * 100 X: mức độ viêm chân chuột lô chứng Y: mức độ viêm chân chuột lô đối chiếu, lô thử nghiệm Số liệu thực nghiệm thể số trung bình (M) ± sai số chuẩn giá trị trung bình (SEM) Xử lí số liệu phần mềm MS Excel 2010, xử lý thống kê dựa vào phép kiểm OneWay ANOVA t-test (phần mềm SigmaStat3.5) Kết thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% p < 0,05 so với lô chứng tương ứng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độc tính cấp đường uống Cao Lược vàng khô Thử nghiệm sơ khởi Thăm dò liều cao khơng gây chết thú thử nghiệm (LD0) liều thấp gây chết 100% thú thử nghiệm (LD100) Thử 60 chuột, chia thành 15 nhóm, nhóm 04 chuột, điều kiện cho uống 0,5 mL/20 g chuột, liều uống thay đổi theo nhóm 11; 11,1; 11,2; 11,3; 11,4; 11,6; 11,8; 12,0; 12,2; 12,3; 12,4; 12,5; 12,6; 12,7; 12,8 g/kg LD100: 12,7 g/kg Thử nghiệm xác định Thử 64 chuột, chia ngẫu nhiên chuột thí nghiệm thành lơ lơ 08 con, cho uống 0,5 mL/20 g chuột, liều thay đổi theo nhóm 11,4; 11,6; 11,8; 12,0; 12,2; 12,4; 12,6; 12,7 g/kg Theo dõi hoạt động chuột thí nghiệm sau dùng thuốc, ghi lại biểu ngộ độc mức độ nghiêm trọng, xuất độc tính, tiến triển dẫn tới phục hồi chết 72 Tính kết theo phương pháp Karber – Behrens Bảng 1: Kết thử độc tính cấp cao Lược vàng khô Lô Liều dùng (g/kg) 11,2 11,4 11,6 11,8 12 12,2 12,4 12,7 Tổng số (con) 8 8 8 8 Số chết (con) 1 4 % chết 0,00 3,85 10,00 35,29 58,82 84,21 95,83 100,00 Vậy LD50 = 11,93 (11,79 - 12,06) g/kg tương đương với 897,33 (886,77 – 907,07) g dược liệu tươi/kg thể trọng Cao Lược vàng tươi Kết độc tính cấp cao đặc từ dịch ép Lược vàng tươi trình bày Bảng Kết thăm dò: LD0: 11,2 g/kg Chuyên Đề Dược 191 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Bảng 2: Kết độc tính cấp cao Lược vàng tươi Mẫu Cao Lược vàng tươi Số Liều cho uống lượng (g cao/kg) chuột 26 13 6,5 10 10 10 Số Phân suất chuột tử vong chết (%) 20 10 Theo dõi sau 72 thử nghiệm, liều tối đa cho uống cao Lược vàng tươi 26 g cao/kg thể trọng chuột, phân suất tử vong 20%, không xác định liều gây chết tuyệt đối nên suy liều LD50 LD0 cao đặc từ dịch ép 6,5 g/kg (tương đương với 689,3 g tươi/kg thể trọng chuột) Các triệu chứng tử vong: Sau 30 phút uống cao Lược vàng, chuột nằm im, giảm hoạt động Chuột chết khoảng 6-8 sau uống cao Giải phẫu quan sát đại thể thấy có tình trạng xung huyết phổi gan Theo dõi tiếp tục chuột thử nghiệm 14 ngày thấy khơng tử vong thêm khơng có triệu chứng bất thường đại thể mổ quan sát chuột Đánh giá tác động kháng viêm cao đặc Lược vàng Liều kháng viêm đề nghị dựa kết thử độc tính cấp LD50 , LD0 Cao Lược vàng khô Theo kết khảo sát độc tính cấp cao Lược vàng khơ LD50 11,93 ± 0,15 g/kg, liều an toàn khoảng 1/20- 1/10 LD50 tương đương với 0,59-1,19 g/kg chuột Liều sử dụng thực tế có hiệu người dân sử dụng 2-3 g khơ (có độ ẩm khoảng 10,5 ± 0,5%) tương đương khoảng 0,62- 0,92 g cao đặc (độ ẩm 9,0 ± 0.5%) qui đổi qua liều chuột(1,5) (0,62g/ 0,085x 50- 0,92g/ 0,085x50) tương ứng với 145216 mg/kg Vậy đề nghị liều thử nghiệm đánh giá tác dụng kháng viêm cao Lược vàng khô 181 mg/kg Cao Lược vàng tươi Theo kết LD0 6,5 g/kg, liều tương đối an toàn khoảng 1/10- 1/5 LD0 tương đương với 0,65-1,30 g/kg chuột Liều sử dụng thực tế có hiệu người dân sử dụng 40-60 g tươi tương đương khoảng 0,38-0,57 g cao đặc (độ ẩm 9,4 ± 0.5%) qui đổi qua liều chuột(1,5) (0,38g/ 0,085x 50- 0,57g/ 0,085x50) tương ứng với 89- 134 mg/kg Vậy đề nghị liều thử nghiệm đánh giá tác dụng kháng viêm cao Lược vàng 111 mg/kg Đánh giá tác động kháng viêm cao đặc Lược vàng Bảng 3: Mức độ viêm chân chuột theo thời gian dùng cao đặc Lược vàng Lô TN n = 10-12 Chứng ® Celebrex 25 mg/kg Cao đặc từ dịch ép 111 mg/kg Cao đặc từ dịch chiết 181 mg/kg Sau 143,31 ± 9,36 100,22 ±10,67* 97,21 ± 9,07* 95,16 ± 9,35* Carrageenan chất sulfopolygalactocid, chiết xuất từ Chondrus crispus, có tác dụng gây viêm theo hai pha: pha đáp ứng nhanh sau 3-4 pha đáp ứng chậm kéo dài đến sau 72 giờ(2,4) Mức độ viêm lô chứng sau tiêm đạt 143,31% giảm dần sau 24 giờ, 48 72 sau tiêm 192 Mức độ viêm chân chuột (%) Sau 24 Sau 48 102,07 ± 7,37 92,08 ± 9,23 78,38 ± 7,65* 63,78 ± 7,55* 74,22 ±10,71* 47,67 ± 6,36* 75,13 ±10,34* 66,91 ± 8,28 Sau 72 70,82 ± 4,57 56,59 ± 6,37 45,24 ± 5,30* 63,33 ± 10,18 Kết điều trị mẫu cao thử thuốc đối chiếu bảng bảng cho thấy: Lơ điều trị thuốc đối chiếu Celebrex® (25 mg/kg) thời điểm khảo sát sau giờ, 24 giờ, 48 tiêm carrageenan có mức độ viêm chân chuột giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng, thể tác dụng kháng viêm (p