Bài viết tiến hành thử nghiệm độc tính cấp và bán trường diễn của nguyên liệu ergocalciferol để đánh giá độ an toàn của ergocalciferol. Kết quả nghiên cứu cho thấy: đã xác định được độc tính cấp của ergocalciferol 1,2% do Viện Dinh dưỡng cung cấp trên LD50 = 2.025 mg/kg trọng lượng cơ thể.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA CHẾ PHẨM ERGOCALCIFEROL 1,2% Nguyễn Văn Long*; Chử Văn Mến* Đặng Trường Giang*; Lê Bạch Mai*** TÓM TẮT Ergocalciferol dạng tiền vitamin vitamin D hay cũn gọi vitamin D2 Khi hấp thu vào thể, ergocalciferol giúp thể hấp thu canxi photsphat Viện Dinh dưỡng chiết xuất thành công ergocalciferol từ Saccaromyces cerevisiae làm nguyên liệu sản xuất thuốc thực phẩm chức Trong nghiên cứu này, tiến hành thử nghiệm độc tính cấp bán trường diễn nguyên liệu ergocalciferol để đánh giá độ an toàn ergocalciferol Kết nghiên cứu cho thấy: xác định độc tính cấp ergocalciferol 1,2% Viện Dinh dưỡng cung cấp chuột nhắt trắng theo đường uống với LD50 = 2.025 mg/kg trọng lượng thể Với liều dùng 200 mg 400 mg/kg/24 giờ, uống liên tục 42 ngày, ergocalciferol không ảnh hưởng đến phát triển trọng lượng thỏ, không làm biến đổi điện tim thỏ, không làm biến đổi số huyết học (như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu hàm lượng hemoglobin) Các số đánh giá chức gan (hoạt độ AST, ALT), thận (nồng độ ure, creatinin) giới hạn bình thường * Từ khãa: Ergocalciferol; LD50; AST; ALT EVALUATION OF THE ACUTE AND SUBCHRONIC TOXICITY OF ERGOCALCIFEROL 1.2% SUMMARY Ergocalciferol is provitamin D or vitamin D2 After being absorbed into the body, ergocalciferol helps the body absorb calcium and phosphor Ergocalciferol has been successfully extracted from Saccaromyces cerevisiae in National Institute of Nutrition as raw material for drug and functional food production In this study, the acute and subchronic toxicity of ergocalciferol raw material have been evaluated The results showed that the acute toxicity of ergocalciferol 1.2% from National Institute of Nutrition on mice after oral administration of LD50 = 2.025 mg/kg body weight At the dosage of 200 mg and 400 mg/kg/24h on rabbit, continuously administrating for 42 days didn’t affect the normal increment of body weight of rabbit, didn’t change the electrocardiogram, hematological indices such as red blood cell, white blood cell, platelet and hemoglobin content, hepatic indices (AST, ALT activity), renal indices (urea, creatinin levels) were within normal limits * Key words: Ergocalciferol; LD50; AST; ALT * Học viện Quân y ** Viện Dinh dưỡng Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 16/11/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/12/2013 Ngày báo đăng: 16/12/2013 48 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ Ergocalciferol dạng tiền vitamin vitamin D, hay gọi vitamin D2, sản xuất lưu hành nhiều biệt dược deltalin, drisdol calcidol Ergocalciferol sử dụng chất bổ sung vitamin D Ergocalciferol chuyển hóa thể đẩy mạnh hấp thụ canxi phốt ruột non Do đó, nâng cao nồng độ canxi huyết nồng độ phosphat Tuy nhiên chế phẩm vitamin D2 thị trường đắt so với thu nhập người Việt Nam Hiện nay, Viện Dinh dưỡng, Bộ Y tế chiết xuất thành cơng ergocalciferol từ Saccaromyces cerevisiae góp phần hạ giá thành đảm bảo nguồn cung nước Để đánh giá độ an tồn, chúng tơi tiến hành thử độc tính cấp bán trường diễn sản phẩm NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU chia ngẫu nhiên thành 10 lô, lô 12 Trước cho chuột uống thuốc, chuột bị bỏ đói 16 Tính liều LD50 theo phương pháp Behrens - Karber [1, 2, 3] Chế phẩm nghiên cứu ergocalciferol cho uống với mức liều sau: - Lô thử 1: uống hỗn dịch ergocalciferol liều 600 mg/kg trọng lượng thể /24 - Lô thử 2: uống hỗn dịch ergocalciferol liều 900 mg/kg trọng lượng thể /24 - Lô thử 3: uống hỗn dịch ergocalciferol liều 1.200 mg/kg trọng lượng thể /24 - Lô thử 4: uống hỗn dịch ergocalciferol liều 1.500 mg/kg trọng lượng thể /24 - Lô thử 5: uống hỗn dịch ergocalciferol liều 1.800 mg/kg trọng lượng thể /24 - Lô thử 6: uống hỗn dịch ergocalciferol liều 2.100 mg/kg trọng lượng thể /24 - Lô thử 7: uống hỗn dịch ergocalciferol liều 2.400 mg/kg trọng lượng thể /24 Nguyên liệu, đối tƣợng nghiên cứu - Lô thử 8: uống hỗn dịch ergocalciferol liều 2.700 mg/kg trọng lượng thể /24 - Nguyên vật liệu: chế phẩm ergocalciferol 1,2% đạt tiêu chuẩn sở, Viện Dinh dưỡng cung cấp - Lô thử 9: uống hỗn dịch ergocalciferol liều 3.000mg/kg trọng lượng thể /24 - Đối tượng nghiên cứu: chuột nhắt trắng có trọng lượng thể từ 20,0 - 22,0 g; thỏ: 36 trọng lượng từ 1,8 - 2,2 kg/con Tất động vật thí nghiệm Ban Chăn nuôi, Học viện Quân y cung cấp, ni dưỡng điều kiện phòng thí nghiệm Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học quân sự, Học viện Quân y, ăn theo tiêu chuẩn thức ăn cho động vật nghiên cứu, nước (đun sôi để nguội) uống tự Phƣơng pháp nghiên cứu * Độc tính cấp: theo định số 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 Bộ Y tế WHO xác định độ an tồn cho chế phẩm có nguồn gốc thiên nhiên Chuột - Lô thử 10: uống hỗn dịch ergocalciferol liều 3.300mg/kg trọng lượng thể /24 * Độc tính bán trường diễn: theo phương pháp Abraham, quy định Tổ chức Y tế Thế giới Bộ Y tế hiệu lực an toàn thuốc [1, 3, 5] Chia thỏ thành lô, lô 12 con: - Lô chứng: uống dung dịch natri clorid 0,9%, liều 2,0 ml/kg/24 giờ, uống liên tục 42 ngày - Lô thử liều 1: uống ergocalciferol mức liều 200 mg/kg/24 giờ, uống liên tục thời gian 42 ngày - Lô thử liều 2: uống ergocalciferol mức liều 400 mg/kg/24 giờ, uống liên tục thời gian 42 ngày 51 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Cho tất thỏ nghiên cứu uống tim, xét nghiệm sinh hóa AST, ALT, ure, thể tích Thời gian uống liên tục creatinin Làm tiêu giải phẫu bệnh gan, 42 ngày Sau đó, kiểm tra lại cân nặng, điện lách, thận KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Độc tính cấp Bảng 1: Kết nghiên cu c tớnh cp n (mg/kg trọng l-ợng thể/24 giê) 600 12 12 900 12 11 1.200 12 10 1.500 12 1.800 12 2.100 12 6 2.400 12 2.700 12 10 3.000 12 11 3.300 12 12 Sau 72 uống chế phẩm, không thấy chuột thí nghiệm chết tất lơ nghiên cứu Tuy nhiên, chuột có biểu xù lơng, có tượng ngồi, phân bết lại hậu mơn Đến ngày thứ tư trở thấy xuất chuột chết (ở liều cao 3.300 mg/kg/24 sau ngày kể từ uống thuốc, chuột chết hoàn toàn) Toàn gan, lách, thận xung huyết nhẹ, dày có hơi, đọng lại thức ăn xung huyết Từ kết nghiên cứu trên, chúng tơi tính LD50 chế phẩm chuột nhắt trắng 2.025 mg/kg trọng lượng thể/24 Độc tính bán trƣờng diễn Bảng 2: Trọng lượng thể thỏ trước sau uống thuốc Chøng Ergocalciferol liÒu (2) Ergocalciferol liÒu (3) (1) (2) (3) n 12 12 12 X 2,00 1,99 1,98 SD 0,12 0,13 0,12 (kg) Tr-íc thÝ nghiÖm (a) p p2-1 > 0,05 p3-2 > 0,05 p3-1 > 0,05 52 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 (1) Sau tuần (b) (2) (3) (4) (5) n 12 12 12 x 2,10 2,09 2,08 SD 0,12 0,13 0,12 n 12 12 12 x 2,22 2,21 2,20 SD 0,12 0,11 0,10 (6) p2-1 > 0,05 p3-2 > 0,05 p3-1 > 0,05 p2-1 > 0,05 Sau tuần (c) p p3-2 > 0,05 p3-1 > 0,05 pb-a < 0,05; pc-b < 0,05; pc-a < 0,05 So sánh trọng lượng thể thỏ hai lô dùng ergocalciferol với lô chứng sinh học thời điểm thấy thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) So sánh thời điểm sau so với trước thấy trọng lượng thể thỏ ba lơ tăng, thay đổi có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Kết chứng tỏ chế phẩm ergocalciferol mức liều không ảnh hưởng đến phát triển cân nặng bình thường thỏ Bảng 3: Điện tim thỏ sau dùng ergocalciferol T h ê i x Ð t L « E r g o c a l c i fE er rg oo lc a l c i f e r o p l iÒ u l iÒ u ( ) Tần số tim (CK/phút, x ± SD) t0 (a) 265,88 ± 37,62 260, 38 ± 50, 37 270,00 ± 33,82 p2-1 > 0,05 t3 (b) 264,00 ± 36,02 260,75 ± 49,29 270,63 ± 22,07 p3-2 > 0,05 t6 (c) 264,88 ± 37,10 259,50 ± 49,07 265,38 ± 33,50 p3-1 > 0,05 - pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 QRS (mV) t0 (a) 0,354 ± 0,063 0,356 ± 0,092 0.363 ± 0,066 p2-1 > 0,05 t3 (b) 0,355 ± 0,061 0,358 ± 0,089 0,361 ± 0,064 p3-2 > 0,05 t6 (c) 0,356 ± 0,061 0,359 ± 0,097 0,360 ± 0,052 p 3-1 > 0,05 pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 Sóng bất thường Khơng Khơng Khơng - So sánh lơ thời điểm thí nghiệm so sánh lô thời điểm, tần số biên độ điện tim thỏ thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Khơng có sóng bất thường điện tim lô thỏ thời điểm nghiên cứu Kết chứng tỏ chế phẩm ergocalciferol mức liều không ảnh hưởng tới điện tim thỏ Bảng 4: Số lượng hồng cầu thỏ lô nghiên cứu (n = 12) 52 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 T h ê i x Ð t (x1012/l, S è x ± SD) L« chøng (1) Ergocalciferol liÒu (2) Ergocalciferol liÒu (3) p t0 (a) 4,64 ± 0,41 4,94 ± 0,71 5,22 ± 0,75 p2-1 > 0,05 t3 (b) 5,06 ± 0,57 4,83 ± 0,59 5,24 ± 0,26 p3-2 > 0,05 t6 (c) 4,92 ± 0,50 4,80 ± 0,19 5,05 ± 0,24 p3-1 > 0,05 p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh lô thời điểm thí nghiệm so sánh lơ thời điểm, số lượng hồng cầu thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Bảng 5: Ảnh hưởng ergocalciferol huyết sắc tố thỏ (n = 12) H µ m t è T h ê i L« chøng (1) Ergocalciferol liỊu (2) Ergocalciferol liÒu (3) n = 12 n = 12 n = 12 t0 (a) 107,38 ± 7,35 110,00 ± 10,47 115,50 ± 14,37 p2-1 > 0,05 t3 (b) 115,63 ± 12, 12 109,13 ± 10,99 114,38 ± 8,09 p3-2 > 0,05 t6 (c) 111,63 ± 8,63 112,13 ± 6,38 113,75 ± 7,50 p3-1 > 0,05 p x Ð t p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh lơ thời điểm thí nghiệm lô thời điểm, hàm lượng huyết sắc tố thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Bảng 6: Ảnh hưởng ergocalciferol số lượng bạch cầu thỏ S è G/l) T h ê i L« chøng (1) Ergocalciferol liÒu (2) Ergocalciferol liÒu (3) n = 12 n = 12 n = 12 Trước thí nghiệm (a) 5,99 ± 2,10 5,91 ± 2,50 6,99 ± 0,82 Sau tuần (b) 6,29 ± 1,87 6,19 ± 1,96 6,91 ± 0,97 Sau tuần (c) 6,44 ± 1,80 6,05 ± 1,45 7,01 ± 0,71 p x Ð t p p2-1 > 0,05 p3-2 > 0,05 p3-1 > 0,05 pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh lơ thời điểm thí nghiệm so sánh lô thời điểm, số lượng bạch cầu thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 53 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Bảng 7: Ảnh hưởng ergocalciferol số lượng tiểu cầu thỏ (n = 12) T h ê i E r g o c a l c if E er rg oo lc aol lc i f e r p l iÒ u l iỊ u L « x Ð t t0 (a) 452,25 ± 123,83 437,63 ± 131,81 459, 38 ± 124,54 t3 (b) 503, 38 ± 83,25 441,25 ± 130,39 481,75 ± 204,42 t6 (c) 472,29 ± 168,91 451,00 ± 112,57 452,43 ± 89,62 p p2-1 > 0,05 p3-2 > 0,05 p3-1 > 0,05 pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh lô thời điểm thí nghiệm so sánh lơ thời điểm, số lượng tiểu cầu thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, chế phẩm ergocalciferol mức liều không ảnh hưởng tới số huyết học bình thường thỏ Bảng 8: Hoạt độ enzym AST (IU/l) lô thỏ nghiên cứu (n = 12) g lo c a l c i f e r o l E r g o c a l c i f eE rr o T h ê i L « ( L iÒ u L iÒ u n = 12 n = 12 n = 12 t0 (a) 57,51 ± 18,98 58,04 ± 19,58 58,09 ± 19,63 p2-1 > 0,05 t3 (b) 57,73 ± 17,06 57,65 ± 19,86 58, 31 ± 16,38 p3-2 > 0,05 t6 (c) 57,91 ± 18,84 57,70 ± 17,73 57,84 ± 17,27 p3-1 > 0,05 X Ð t p p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh lô thời điểm thí nghiệm so sánh lơ thời điểm, hoạt độ enzym AST thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Bảng 9: Hoạt độ enzym ALT (IU/l) lô nghiên cứu (n = 12) L « T h ê i E r g o c a l c i f Ee rr go ol c a l c i f e r o l ( l iÒ u l i Ò u( n = 12 n = 12 n = 12 t0 (a) 112,38 ± 16,52 111,75 ± 16,30 112,50 ± 16,58 p2-1 > 0,05 t3 (b) 112,13 ± 18,07 111,88 ± 14,50 112,75 ± 17,07 p3-2 > 0,05 t6 (c) 112,88 ± 20,36 112,00 ± 13,61 112,63 ± 12,48 p3-1> 0,05 p x Ð t p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh lơ thời điểm thí nghiệm so sánh lô thời điểm, hoạt độ enzym ALT thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, hoạt chế phẩm ergocalciferol cho thỏ uống đặn mức liều không ảnh hưởng tới hoạt độ enzym AST ALT Điều chứng tỏ chế phẩm an tồn khơng ảnh hưởng tới chức gan 54 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Bảng 10: Hàm lượng creatinin (mmol/l) máu thỏ lô nghiên cứu (n = 12) T h ê i x Ð t L « h ø n g E r g o c a l c i f1 e r E r o g l o c a l c i 2f e r o l p ( ( ( t0 (a) 53,75 ± 8,45 54,25 ± 9,68 53,38 ± 9,66 t3 (b) 53,63 ± 8,70 54,13 ± 8,48 54,25 ± 7,38 p2-1 > 0,05 p3-2 > 0,05 p3-1 > 0,05 t6 (c) 53,88 ± 8,82 p 54,25 ± 9,42 54,50 ± 8,42 pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh lô thời điểm thí nghiệm so sánh lơ thời điểm, hàm lượng creatinin máu thay đổi ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Bảng 11: Ảnh hưởng ergocalciferol ure máu thỏ (n = 12) T h ê i x Ð t N å n gu r e mmol/l, x± L« chøng (1) Ergocalciferol liÒu (2) Ergocalciferol liÒu (3) t0 (a) 3,51 ± 1,08 3,49 ± 1,13 3,46 ± 1,04 t3 (b) 3,53 ± 0,95 3,43 ± 0,84 3,44 ± 0,90 p3-2 > 0,05 t6 (c) 3,53 ± 1,16 3,50 ± 0,61 3,40 ± 0,87 p3-1 > 0,05 p p p2-1 > 0,05 pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh lô thời điểm thí nghiệm so sánh lơ thời điểm, hàm lượng ure máu thay đổi ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Chế phẩm ergocalciferol cho thỏ uống liên tục thời gian tuần tuần mức liều không ảnh hưởng tới nồng độ creatinin ure máu thỏ, chứng tỏ chế phẩm an toàn chức thận dùng kéo dài Để đánh giá chi tiết hơn, tiến hành nghiên cứu mô bệnh học gan, thận lách thỏ sau khoảng thời gian thí nghiệm * Mô bệnh học gan, thận lách thỏ thí nghiệm: - Quan sát đại thể: sau mổ thỏ, quan sát thấy hình thái gan, thận bình thường, ngun vẹn màu sắc hai lơ dùng ergocalciferol không khác so với lô chứng - Quan sát vi thể: sau quan sát đại thể, cắt rời gan, thận Sau đó, ngâm vào dung dịch formol 10%, làm tiêu quan sát kính hiển vi 55 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 (a) (b) (c) Hình 1: Hình ảnh gan thỏ thực nghiệm (HE, 100X) (a): lô dùng liều 1, (b): lô dùng liều 2; (c): lô chứng a c b Hình 2: Hình ảnh mơ bệnh học thận thỏ thực nghiệm (HE, 100X) (a): lô dùng liều 1, (b): lô dùng liều 2; (c): lô chứng - Lô chứng: bè gan tiểu thùy gan không thay đổi cấu trúc Tế bào gan trúc vùng vỏ, vùng tủy, cầu thận bình thường, khơng thấy hình ảnh tổn thương khơng có tổn thương thối hóa, khơng có Như vậy, ergocalciferol dùng đường uống xâm nhập viêm Cấu trúc vùng vỏ, vùng tủy, liên tục 42 ngày không gây tổn thương cầu thận bình thường, khơng có tổn thương gan, thận, lách thỏ - Lô thử (liều liều 2): thùy gan bè gan không thay đổi cấu trúc Tế bào gan KẾT LUẬN khơng có tổn thương thối hóa Tĩnh mạch Đã xác định độc tính cấp trung tâm khơng giãn, không xung huyết ergocalciferol chuột nhắt trắng theo Khoang cửa khơng có xâm nhập viêm Cấu đường uống với LD50 2,025 mg/kg/24 Với liều 200 mg 400 mg/kg/24 giờ, uống 56 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 liên tục 42 ngày, ergocalciferol 1,2% TÀI LIỆU THAM KHẢO không ảnh hưởng đến phát triển trọng lượng thỏ, không biến đổi điện tim thỏ, không hiệu lực thuốc cổ truyền Quyết định số biến đổi số huyết học hồng cầu, 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 1996 bạch cầu, tiểu cầu hàm lượng hemoglobin, số đánh giá chức gan (hoạt độ AST, ALT), thận (nồng độ ure, creatinin) giới hạn bình thường Hình ảnh mơ bệnh học gan, thận thỏ bình thường Bộ Y tế Quy chế đánh giá tính an tồn Đỗ Trung Đàm Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc Nhà xuất Y học Abrham W.B Techniques of animal and clinical toxicology, Med Pub Chicago, 1978, pp.55-68 Turner A Screening methods in pharmacology Academic Press New York and London 1965, pp.60-68 WHO Research guidelines for evaluating the safety and efficacy of herbal medicines Manila Philipin 1993, pp.35-41 57 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 58 ... góp phần hạ giá thành đảm bảo nguồn cung nước Để đánh giá độ an tồn, chúng tơi tiến hành thử độc tính cấp bán trường diễn sản phẩm NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU chia ngẫu nhiên thành... uống hỗn dịch ergocalciferol liều 2.700 mg/kg trọng lượng thể /24 - Nguyên vật liệu: chế phẩm ergocalciferol 1,2% đạt tiêu chuẩn sở, Viện Dinh dưỡng cung cấp - Lô thử 9: uống hỗn dịch ergocalciferol. .. 0,05) Chế phẩm ergocalciferol cho thỏ uống liên tục thời gian tuần tuần mức liều không ảnh hưởng tới nồng độ creatinin ure máu thỏ, chứng tỏ chế phẩm an toàn chức thận dùng kéo dài Để đánh giá