Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro và tính kích ứng da của dung dịch mafenid acetate (MA) trên các chủng vi khuẩn (VK) thường gặp trong bỏng trên thỏ thực nghiệm. Phương pháp: sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch để đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN IN VITRO VÀ TÍNH KÍCH ỨNG DA TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM CỦA DUNG DỊCH MAFENID ACETAT Lương Quang Anh*; Nguyễn Như Lâm*; Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Tồn** TĨM TẮT Mục tiêu: đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro tính kích ứng da dung dịch mafenid acetate (MA) chủng vi khuẩn (VK) thƣờng gặp bỏng thỏ thực nghiệm Phương pháp: sử dụng phƣơng pháp khuếch tán thạch để đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro thỏ khỏe mạnh đƣợc đắp thuốc da lƣng theo dõi điểm kích ứng da sau 72 tiếp xúc Kết quả: thuốc có tác dụng kháng khuẩn Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Sarcina lutea Đồng thời, thuốc có tác dụng kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập đƣợc Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia Tuy nhiên, VK phát triển mạnh tiếp xúc với dung dịch MA có nồng độ < 5% Điểm kích ứng đắp thuốc lƣng thỏ thí nghiệm Kết luận: dung dịch MA 5% có tác dụng kháng khuẩn tốt với nhiều chủng VK, có trực khuẩn mủ xanh phân lập đƣợc Viện Bỏng Quốc gia khơng kích ứng sử dụng thỏ * Từ khóa: Mafenid acetat; Tác dụng kháng khuẩn; Kích ứng da Evaluation of Antibacterial Activities In Vitro and Skin Irritation of Mafenide Acetate Solution on Rabbits Summary Objectives: Evaluation of antibacterial activities in vitro and skin irritation of mafenide acetate (MA) solution on rabbits Methods: Determination of antibacterial activities in vitro by the agar well diffusion method Assessment of skin irritation grade on healthy rabbits that were topically applied the drug on its back after 72 hours of contact Results: The drug had effectiveness on Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Sarcina lutea With regard to Pseudomonas aeruginosa isolated from samples obtained at Intensive Care Unit, MA solution showed its germicide similarly Conversely, the baterium kept with its powerful growth when the drug at doses below 5% was applied on The skin irritation grade was at zero Conclusions: The drug showed good antimicrobial activities on some bacteria species including Pseudomonas aeruginosa isolated from our hospital It had no skin irritation when applied on experimental rabbits * Key words: Mafenide acetate; Antibacterial activities; Skin irritation * Viện Bỏng Qu c gia ** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Lương Quang Anh (luongquanganh@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 27/05/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 09/09/2015 Ngày báo đăng: 18/09/2015 17 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ Tại Việt Nam, nhiễm khuẩn bỏng trở thành vấn đề lớn, ảnh hƣởng trực tiếp đến chất lƣợng điều trị bệnh nhân (BN), tình trạng thiếu thuốc kháng khuẩn chỗ thực có hiệu Trong đó, trực khuẩn mủ xanh VK Gram âm hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện, đặc biệt BN bỏng Điều trị vết thƣơng, vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh khó khăn VK có khả đề kháng cao hầu hết thuốc kháng sinh, đặc biệt chủng đa kháng kháng sinh, làm tăng chi phí điều trị nhƣ làm tăng tỷ lệ tử vong BN bỏng [1, 2, 3] MA thuốc thuộc nhóm sulfamid đƣợc sử dụng trung tâm điều trị bỏng giới Đây thuốc có độ an tồn cao, hiệu diệt khuẩn tốt, có trực khuẩn mủ xanh MA chủ yếu sử dụng dƣới dạng dung dịch dạng kem, dùng đơn lẻ kết hợp với thuốc kháng khuẩn khác Viện Bỏng Quốc gia bào chế thành công dung dịch MA 5% đạt tiêu chuẩn sở Vì vậy, nghiên cứu đƣợc thực nhằm: Bước đầu đánh giá tác dụng háng huẩn in vitro tính ích ứng da chế phẩm, làm sở hoa học cho việc ứng dụng chế phẩm điều trị BN bỏng NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu đối tƣợng nghiên cứu * Nguyên vật liệu: - Dung dịch MA 5% Viện Bỏng Quốc gia sản xuất, đạt tiêu chuẩn sở 18 - Thuốc đối chiếu: streptomycin sulfat 16 IU/ml thử kháng khuẩn VK Gram (-), benzathin penicillin 20 IU/ml thử kháng khuẩn VK Gram (+) Môi trƣờng canh thang nuôi cấy vi sinh vật gồm: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt 0,3%, nƣớc vừa đủ 100 ml Môi trƣờng thạch thƣờng gồm: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt 0,3%, thạch 1,6%, nƣớc vừa đủ 100 ml * Đ i tượng nghiên cứu: - Chủng vi sinh vật kiểm định Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Đại học Dƣợc Hà Nội cung cấp, bao gồm: VK Gram (-): Escherichia coli (EC), Proteus mirabilis (Pro), Shigella flexneri (Shi), Salmonella typhi (Sal), Pseudomonas aeruginosa (Pseu) VK gram (+): Staphylococcus aureus (SA), Bacillus pumilus (BP), Bacillus subtilis (BS), Bacillus cereus (BC), Sarcina lutea (Sar) - Phân lập chủng trực khuẩn mủ xanh từ mẫu bệnh phẩm Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia thỏ đực khỏe mạnh, cân nặng 2.000 ± 100 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Phƣơng pháp nghiên cứu * Phương pháp đánh giá tác dụng háng huẩn in vitro: - Xác định vòng vô khuẩn chế phẩm phƣơng pháp khuếch tán thạch số chủng VK quốc tế + Tiến hành: khoanh giấy lọc vô trùng đƣợc tẩm lần với dung dịch mẫu thử, sấy nhiệt độ < 60oC đến khô hết dung môi Cấy vi sinh vật kiểm định vào môi trƣờng canh thang, nuôi cấy cho phát triển tủ ấm 37oC từ 18 - 24 đến nồng độ 107 tế bào/ml Môi trƣờng thạch thƣờng vô trùng (làm lạnh 45 - 500C) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 đƣợc cấy vi sinh vật kiểm định với tỷ lệ 2,5 ml/100 ml Lắc tròn để vi sinh vật phân tán môi trƣờng thạch thƣờng, đổ vào đĩa petri vơ trùng với thể tích 20 ml/đĩa, để thạch đông lại Khoanh giấy lọc tẩm chất thử đặt lên bề mặt môi trƣờng thạch thƣờng chứa vi sinh vật theo sơ đồ định sẵn Ủ đĩa petri có mẫu thử tủ ấm nhiệt độ 37oC 18 - 24 Đọc kết quả, đo đƣờng kính vòng vơ khuẩn thƣớc kẹp Panmer có độ xác 0,02 mm + Đánh giá kết quả: dựa vào đƣờng kính vòng vơ khuẩn đánh giá theo công thức sau: n D D= i 1 n n i SD = ( D D) i 1 i n 1 D : Đƣờng kính trung bình vòng vơ khuẩn, Di: Đƣờng kính vòng vơ khuẩn SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh, n: Số thí nghiệm làm song song - Xác định vòng vơ khuẩn chế phẩm phƣơng pháp khuếch tán thạch Pseudomonas aeruginosa phân lập Viện Bỏng Quốc gia * Tiến hành: tạo lỗ có đƣờng kính 10 mm bề mặt đĩa thạch Đổ dung dịch thử vào lấp đầy lỗ bề mặt môi trƣờng thạch thƣờng chứa Pseudomonas aeruginosa phân lập từ mẫu bệnh phẩm Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia theo sơ đồ định sẵn Ủ đĩa petri có mẫu thử tủ ấm nhiệt độ 37oC 24 Sau đó, lấy đĩa petri đọc kết Đo đƣờng kính vòng vơ khuẩn thƣớc chia độ tính mm - Xác định sơ phát triển Pseudomonas aeruginosa phân lập Viện Bỏng Quốc gia tiếp xúc với thuốc nồng độ khác Từ dung dịch MA 5%, tiến hành pha dung dịch MA có nồng độ giảm dần tƣơng ứng với nồng độ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 1/32 so với nồng độ MA 5% Hút xác ml dung dịch cho vào ống nghiệm chứa 100 µl hỗn dịch chứa 108 VK/ml Cấy hỗn dịch VK thuốc vào đĩa petri thạch thƣờng, để tủ ấm nhiệt độ 370C 24 Sau đó, lấy đĩa petri để theo dõi phát triển VK đĩa thạch tƣơng ứng với VK tiếp xúc với thuốc nồng độ khác * Phương pháp đánh giá tính ích ứng da thỏ thực nghiệm: - Thử nghiệm tiến hành thỏ Trên thỏ, bên vùng da lƣng cạo, đắp thuốc thử dạng dung dịch Bên phải đặt thuốc thử nghiệm, bên trái đặt dung dịch natri clorid 0,9% Nhúng lƣợng thuốc thử vào gạc tiệt trùng có diện tích 2,5 x 2,5 cm Áp gạc có thuốc thử vào vùng da định thử (đã cạo lông) Cố định miếng gạc để đảm bảo miếng gạc áp vào da thỏ Sau giờ, bóc gạc, rửa vùng da nƣớc cất Nhận định kết sau 4, 24, 48, 72 đắp thuốc Đánh giá phản ứng chỗ da đặt thuốc xem mức độ kích ứng gây ban đỏ phù theo thang điểm đƣợc quy định sẵn nhƣ sau: - Đánh giá phản ứng da trạng thái gây ban đỏ, có vẩy xƣớc (A) Khơng có ban đỏ: điểm; ban đỏ nhẹ: điểm; ban đỏ nhận thấy rõ: điểm; ban đỏ 19 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 vừa phải đến nghiêm trọng: điểm; ban đỏ có vẩy xƣớc nhẹ: điểm điểm; phù nề nghiêm trọng (viền phồng ≥ mm): điểm - Đánh giá phản ứng da trạng thái phù nề (B) - Đánh giá kết quả: lấy trung bình điểm A B điểm kích ứng da chế phẩm Chế phẩm đạt yêu cầu độ kích ứng da có điểm kích ứng da Không phù nề: điểm; phù nề nhẹ: điểm; phù nề nhẹ có viền phồng: điểm; phù nề vừa phải có viền phồng: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro * Kết xác định vòng vơ khuẩn chủng VK qu c tế: Tiến hành đo vòng vơ khuẩn cho thuốc tiếp xúc với chủng VK quốc tế Bảng 1: Kết đo vòng vơ khuẩn dung dịch MA chủng VK VI SINH VẬT MẪU D ˉ(mm) s VI SINH VẬT MẪU D ˉ(mm) s Pseu 11,02 0,03 SA 10,37 0,65 9,29 0,21 10,91 0,28 3,02 0,12 10,00 0,41 0,00 0,00 0,00 0,00 Chuẩn 10,29 0,24 Chuẩn 15,51 0,37 11,53 0,38 17,04 0,54 KK 18,72 0,72 KK 21,27 0,52 KK 18,83 0,31 Chuẩn KK Chuẩn 23,70 0,42 14,07 0,21 13,03 0,05 11,19 0,80 13,87 0,33 10,63 0,26 3,15 0,26 8,03 0,05 11,27 0,19 Chuẩn 10,43 0,49 Chuẩn 17,00 0,14 8,97 0,53 14,39 0,29 8,80 0,51 16,43 0,42 8,54 0,04 14,20 0,86 8,13 0,10 9,33 0,24 Chuẩn 12,53 0,23 Chuẩn 25,57 0,45 Pro Shi Sal 20 BS BP Sar TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 EC KK BC 10,57 0,46 KK 8,30 0,20 KK 11,13 0,09 KK 0,00 0,00 Chuẩn 17,00 Chuẩn 21,83 0,85 0,82 (Ghi chú: KK: kìm khuẩn) Dung dịch bào chế có tác dụng nhiều chủng VK nhƣ: Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus Sarcina lutea Trong đó, đáng ý thuốc có tác dụng kháng VK Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Đây chủng VK hay gặp vết bỏng Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu MA [4, 6] Ngồi ra, thuốc có tác dụng kìm khuẩn VK Escherichia coli, Proteus mirabilis Hình 1a: Vòng vơ khuẩn Pseudomonas aeruginos Hình 1b: Vòng vơ khuẩn Staphylococcus aureus Hình 1: Hình ảnh vòng vơ khuẩn dung dịch MA số chủng VK (Ghi chú: Mẫu chuẩn: Ở vị trí điểm Mẫu 2, 3, (từ trái qua phải tính từ mẫu chuẩn): mẫu thử dung dịch MA) * Kết đánh giá tác dụng kháng khuẩn chủng VK phân lập bệnh viện: Kết xác định vòng vơ khuẩn chủng VK phân lập Viện Bỏng Quốc gia: Lấy mẫu bệnh phẩm từ Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia phân lập Pseudomonas aeruginosa Đây chủng VK bệnh viện, có khả đề kháng cao với thuốc kháng khuẩn * Giá trị vòng vơ khuẩn dung dịch MA Pseudomonas aeruginosa phân lập Viện Bỏng Qu c gia: Mẫu 1: 5,0 mm; mẫu 2: 7,0 mm; mẫu 3: 7,0 mm Nhƣ vậy, dung dịch MA có tác dụng kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập Viện Bỏng Quốc gia Đáng ý, chủng VK gặp khoa Hồi sức Cấp cứu, sử dụng chế phẩm điều trị BN bỏng nặng với mục đích dự phòng nhiễm trực khuẩn mủ xanh 21 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ 8-2015 Hình 2: Hình ảnh vòng vơ khuẩn dung dịch MA Pseudomonas aeruginosa phân lập Viện Bỏng Quốc gia - Xác định sơ phát triển Pseudomonas aeruginosa phân lập Viện Bỏng Quốc gia tiếp xúc với thuốc nồng độ khác Trên giới, dung dịch MA 2,5% đƣợc số tác giả sử dụng với mục đích đảm bảo hiệu điều trị, góp phần làm giảm chi phí cho ngƣời bệnh [5] Để đánh giá hiệu kháng khuẩn dung dịch MA có nồng độ < 5%, tiến hành xác định sơ phát triển chủng trực khuẩn mủ xanh phân lập Viện Bỏng Quốc gia tiếp xúc với dung dịch thuốc có nồng độ giảm dần pha chế từ dung dịch MA 5% ban đầu Hình 3b1: Dung dịch MA nồng độ 1/4 Hình 3b2: Dung dịch MA nồng độ 1/8 Hình 3c1: Dung dịch MA nồng độ 1/16 Hình 3a1: Dung dịch MA nồng độ 1/1 Hình 3c2: Dung dịch MA nồng độ 1/32 Hình 3a2: Dung dịch MA nồng độ 1/2 22 Hình 3: Hình ảnh phát triển Pseudomonas aeruginosa phân lập Viện Bỏng Quốc gia tiếp xúc với thuốc có nồng độ khác TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 Khi nồng độ dung dịch MA 5% giảm, hiệu kháng khuẩn giảm, chí hầu nhƣ khơng khả kháng khuẩn (VK phát triển xâm kín bề mặt thạch) Điều đƣợc lý giải sức đề kháng chủng VK bệnh viện cao nhạy cảm với dung dịch MA 5% đƣợc điều chế Kết đánh giá tính ích ứng da thỏ thực nghiệm Kết da da lƣng bình thƣờng thỏ thực nghiệm Hình 4a2: Thời điểm 72 thuốc chứng Bảng 2: Điểm đánh giá tiêu kích ứng da dung dịch MA thỏ thực nghiệm Sè thø tù ®iĨm ban đỏ điểm phù nề điểm trung bình Th 0 Thỏ 0 Thỏ 0 Thỏ 0 Thỏ 0 Thỏ 0 Hình 4b1: Thời điểm thuốc thử Dung dịch MA 5% khơng gây kích ứng da thỏ khỏe mạnh Tuy nhiên, sử dụng da bị tổn thƣơng, cần phải theo dõi tác dụng kích ứng chế phẩm này, giá trị pH trung tính (khoảng 6,8) Một số hình ảnh thí nghiệm thử kích ứng da lƣng thỏ thực nghiệm đƣợc mơ tả hình Hình 4b2: Thời điểm 72 thuốc thử Hình 4: Hình ảnh thử tác dụng kích ứng dung dịch MA da lƣng thỏ thực nghiệm KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, chúng tơi rút số kết luận: Hình 4a1: Thời điểm thuốc chứng - Dung dịch MA 5% có tác dụng kìm khuẩn Escherichia coli, Proteus 23 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 mirabilis Có tác dụng kháng khuẩn Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus Sarcina lutea in vitro - Dung dịch MA 5% có tác dụng kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập Viện Bỏng Quốc gia in vitro VK phát triển mạnh tiếp xúc với dung dịch MA có nồng độ < 5% - Dung dịch MA 5% không gây kích ứng da lƣng bình thƣờng thỏ thực nghiệm Viện Bỏng Quốc gia Tạp chí Y học thảm họa Bỏng 2009, 4, tr.56-62 Lê Đức Mẫn Nghiên cứu số yếu tố nguy biện pháp điều trị dự phòng nhiễm khuẩn huyết bỏng Viện Bỏng Quốc gia Luận án Tiến sỹ Y học Học viện Quân y Hà Nội 2007 Lê Năm CS Sơ cứu, cấp cứu điều trị bỏng NXB Y học 2006 Hashemi B et al Comparison between topical honey and mafenide acetate in treatment of auricular burn Am J Otolaryngology 2011, 32, pp.28-31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ibrahim A et al A simple cost-saving measure: 2.5% mafenide acetate solution J Burn Care Res, online 2013 Nguy n Như Lâm, Lê Đức Mẫn Nghiên cứu nguyên nhiễm khuẩn mức độ kháng kháng sinh Khoa Hồi sức Cấp cứu, Japoni A et al Pseudomonas aeruginosa: Burn infection, treatment and antibacterial resistance IRC Med J 2009, 11 (3), pp.244-253 24 ... chế Kết đánh giá tính ích ứng da thỏ thực nghiệm Kết da da lƣng bình thƣờng thỏ thực nghiệm Hình 4a2: Thời điểm 72 thuốc chứng Bảng 2: Điểm đánh giá tiêu kích ứng da dung dịch MA thỏ thực nghiệm. .. mm): điểm - Đánh giá phản ứng da trạng thái phù nề (B) - Đánh giá kết quả: lấy trung bình điểm A B điểm kích ứng da chế phẩm Chế phẩm đạt yêu cầu độ kích ứng da có điểm kích ứng da Không phù... số hình ảnh thí nghiệm thử kích ứng da lƣng thỏ thực nghiệm đƣợc mơ tả hình Hình 4b2: Thời điểm 72 thuốc thử Hình 4: Hình ảnh thử tác dụng kích ứng dung dịch MA da lƣng thỏ thực nghiệm KẾT LUẬN