Nghiên cứu độc tính và tác dụng tăng cường chức năng sinh dục đực của viên nang trường xuân CB trên động vật thực nghiệm TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y VŨ NGỌC THẮNG NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG CHỨC NĂNG SINH DỤC ĐỰC CỦA VIÊN NANG TRƯỜNG XUÂN CB TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Dược lý- Độc chất Mã số: 9720118 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI-NĂM 2021 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Hoàng Ngân PGS TS Nguyễn Minh Phương Phản biện 1: TS Vũ Đình Hịa Phản biện 2: TS Trịnh Hoài Nam Phản biện 3: PGS TS Quản Hoàng Lâm Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường vào hồi: ngày tháng Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia năm Thư viện Học viện Quân y ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Suy giảm chức sinh dục, sinh sản nam giới bệnh lý có tỉ lệ mắc ngày tăng; ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe nam giới mà ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống tinh thần hạnh phúc gia đình họ Các thuốc điều trị nội khoa chủ yếu sử dụng liệu pháp hormon thay thế, có hiệu số trường hợp định có nguy xảy tai biến sử dụng dài ngày Viên nang Trường Xuân CB (TXCB) sản phẩm đề tài nghiên cứu khoa học cấp tỉnh, bào chế từ dược liệu theo thuốc y học cổ truyền với định hướng điều trị số vấn đề suy giảm chức sinh dục, sinh sản nam Để đưa vào sử dụng người, chế phẩm cần phải trải qua giai đoạn đánh giá tính an toàn tác dụng động vật thực nghiệm Mục tiêu luận án 2.1 Đánh giá độc tính cấp độc tính bán trường diễn viên nang Trường Xuân CB động vật thực nghiệm 2.2 Đánh giá tác dụng tăng cường chức sinh dục đực viên nang Trường Xuân CB động vật thực nghiệm Những đóng góp luận án Cơng bố nước áp dụng mơ hình gây ĐTĐ streptozotocin nghiên cứu tác dụng chức cương dương Lần nước áp dụng mơ hình gây suy giảm sinh sản fluconazol nghiên cứu thỏ Tinh dịch lấy âm đạo giả nhiều thời điểm nên đánh giá trước- sau trình nghiên cứu (trên chuột đánh giá thời điểm cuối thí nghiệm phải giết chuột) Ngồi ra, áp dụng kỹ thuật thụ tinh nhân tạo cho thỏ nên đánh giá tác động cuối biện pháp can thiệp đến khả sinh sản Lần đầu đưa liệu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn tác dụng sinh sản, sinh dục đực viên nang TXCB, chế phẩm nghiên cứu bào chế Bố cục luận án Luận án có 136 trang, đó: Đặt vấn đề: trang; Tổng quan: 32 trang; Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 14 trang; Kết nghiên cứu: 44 trang với 38 bảng 11 hình; Bàn luận: 41 trang; Kết luận: trang; Kiến nghị: trang Luận án có 189 tài liệu tham khảo (tiếng Việt tiếng Anh) Chương TỔNG QUAN 1.1 Rối loạn chức sinh sản, sinh dục nam Một số rối loạn chức sinh sản, sinh dục nam thường gặp là: Suy sinh dục nam giới; rối loạn cương dương vơ sinh nam Trong có vai trò quan trọng TES cân sinh tổng hợp TES 1.2 Các mơ hình dược lý nghiên cứu sinh sản, sinh dục nam - Mơ hình nghiên cứu chất có hoạt tính androgen, có mơ hình: Mơ hình cổ điển dựa đáp ứng mào gà trống thiến Hiện nay, mơ hình sử dụng nhiều dựa thay đổi trọng lượng mô- quan phụ thuộc androgen (tuyến tiền liệt, túi tinh, nâng hậu môn dương vật, tuyến Cowper, đầu dương vật) chuột cống đực - Mơ hình nghiên cứu chức cương dương: Để đánh giá khả cương dương động vật thực nghiệm, phương pháp đáng tin cậy thường sử dụng đo áp lực xoang hang (ICP) kích thích điện dây thần kinh hang Một số mơ hình sử dụng là: mơ hình tổn thương tuyến tiền liệt; mơ hình gây đái tháo đường; mơ hình tuổi tác; mơ hình hội chứng chuyển hóa… - Mơ hình nghiên cứu khả sinh sản: Mơ hình nhiều nhà nghiên cứu nước áp dụng gây suy giảm nghiên cứu chuột Ngồi ra, mơ hình có nhiều ưu điểm gây suy giảm sinh sản nghiên cứu thỏ Bởi lẽ thỏ lấy tinh dịch âm đạo giả, thuận lợi cho việc phân tích, đánh giá tinh trùng 1.3 Tổng quan viên nang Trường Xuân CB 1.3.2 Thành phần, công thức bào chế viên nang Trường Xuân CB Viên nang Trường Xuân CB (TXCB) nghiên cứu bào chế từ thuốc YHCT cách áp dụng kỹ thuật bào chế đại Chế phẩm sản phẩm đề tài nghiên cứu cấp tỉnh Cao Bằng nghiệm thu năm 2020 Công thức bào chế (cho viên nang) sau: Bảng 1.2 Thành phần, công thức bào chế TXCB T T Tên nguyên liệu Bột cao khô tỏa dương Bột cao khô hỗn hợp dược liệu: ba kích, dâm dương hoắc, câu kỷ tử, sâm cau, ngưu đại lực, thạch hộc tía Bột cao khô lộc nhung Tá dược (tinh bột ngô, natri starch Khối lượng (mg) 75 310 15 vừa đủ viên glycolat, magnesi stearat, aerosil) Chế phẩm sử dụng cho nghiên cứu sản phẩm đạt tiêu chuẩn sở, có quy trình sản xuất thẩm định đầy đủ Liều dùng dự kiến: 6- viên/ngày Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Viên nang TXCB Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất thuốc- Học viện Quân y sản xuất cung cấp, đạt tiêu chuẩn sở 2.2 Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng, chuột cống trắng thỏ đạt tiêu chuẩn thí nghiệm cung cấp Ban chăn nuôi động vật- Học viện Quân y 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Đánh giá độc tính viên nang TXCB 2.3.1.1 Độc tính cấp xác định liều LD50 Thực chuột nhắt trắng, theo hướng dẫn OECD 2.3.1.2 Độc tính bán trường diễn Tiến hành chuột cống trắng, theo hướng dẫn OECD với lô chứng lô uống TXCB liều 0,42 (trị 1) 1,26 g/kg/ngày (trị 2) Thời gian uống thuốc liên tục 90 ngày 2.3.2 Đánh giá tác dụng tăng cường chức sinh dục đực 2.3.2.1 Nghiên cứu hoạt tính androgen chuột cống đực non thiến Chuột cống đực thiến theo phương pháp Ottani cs, sau tiến hành theo hướng dẫn OECD với lô trị uống viên nang TXCB liều 0,42 0,84 g/kg/ngày chứng dương TES 2.3.2.2 Nghiên cứu tác dụng chức cương dương Chuột cống trắng đực gây ĐTĐ cách tiêm phúc mạc STZ liều 45 mg/kg, theo phương pháp mô tả Brian L Furman Sau đó, chuột ĐTĐ chia lơ: Lơ mơ hình: uống nước cất; lơ sildenafil: uống sildenafil liều mg/kg/ngày lô chế phẩm uống TXCB liều 0,84 g/kg/ngày; thời gian uống liên tục tuần Các số đánh giá gồm: Thể trạng chung; nồng độ glucose máu; nồng độ TES huyết thanh; ICP nền, ICPmax, AUC, MAP tỉ số ICPmax/MAP 2.3.2.3 Tác dụng mô hình thỏ gây SGSS fluconazol Thỏ đực trưởng thành sau làm quen với âm đạo giả chia ngẫu nhiên vào lô Lô chứng: uống Na CMC + nước cất; lơ mơ hình: uống FLZ 50 mg/kg 30 ngày + nước cất; lô trị 1: uống FLZ 50 mg/kg 30 ngày + uống TXCB 180 mg/kg 60 ngày; lô trị 2: uống FLZ 50 mg/kg 30 ngày + uống TXCB 360 mg/kg 60 ngày Các số đánh giá bao gồm: - Thời gian phản ứng; thông số số lượng chất lượng tinh trùng; nồng độ malondialdehyd (MDA) huyết tinh dịch; nồng độ TES huyết đánh giá thời điểm: ban đầu, sau 30 ngày sau 60 ngày - Khả thụ thai: tỉ lệ thụ thai số sinh thỏ cái; mơ học tinh hồn đánh giá kết thúc thí nghiệm 2.4 Xử lý số liệu Các số liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± SD Xử lý thống kê tính tốn phần mềm IBM SPSS Statistics 20.0 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p ≤ 0,05 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết đánh giá độc tính viên nang TXCB 3.1.1 Độc tính cấp liều LD50 Tại tất lơ khơng có chuột chết Khi theo dõi đến 14 ngày, chuột lô khỏe mạnh, không xuất triệu chứng bất thường dấu hiệu ngộ độc 3.1.2 Độc tính bán trường diễn 3.1.2.1 Ảnh hưởng tới thể trạng chung, dấu hiệu ngộ độc Thể trạng chung chuột bình thường Khơng có khác biệt có ý nghĩa trọng lượng thể chuột lô thời điểm 3.1.2.2 Ảnh hưởng tới số huyết học Khơng có khác biệt có ý nghĩa số lượng hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu số lượng tiểu cầu máu so sánh lô thời điểm so sánh thời điểm lô 3.1.2.3 Ảnh hưởng TXCB tới số số sinh hóa máu Khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê số số sinh hóa máu (AST, ALT, creatinin, albumin, cholesterol) so sánh lô thời điểm so sánh thời điểm lô 3.1.2.4 Ảnh hưởng TXCB lên hình ảnh số quan Hình ảnh đại thể vi thể gan, lách, thận lơ bình thường Khơng có khác biệt hình ảnh đại thể vi thể 10 lô uống TXCB so với lô chứng Như vậy, TXCB với liều 0,42 1,26 g/kg/ngày liên tục 90 ngày không gây tổn thương gan, thận, lách chuột 3.2 Đánh giá tác dụng viên nang TXCB sinh dục đực 3.2.1 Hoạt tính androgen chuột cống đực non thiến 3.2.1.2 Tác dụng TXCB lên trọng lượng quan sinh dục phụ * Trọng lượng tương đối túi tinh: Bảng 3.10 Trọng lượng tương đối túi tinh (n = 10) Lô Lô chứng sinh lý Lô chứng dương Lô trị (TXCB 0,42 g/kg) Lô trị (TXCB 0,84 g/kg) p lô Trọng lượng 0,273b ± 0,047 0,403a ± 0,104 0,354ab ± 0,089 0,368a ± 0,082 0,010 So với lô chứng + 47,60% + 29,55% + 34,81% Ghi chú: a, b: khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Ở lô chứng dương lơ trị có trọng lượng tương đối túi tinh cao đáng kể (p < 0,05) so với lô chứng sinh lý * Trọng lượng tương đối tuyến tiền liệt: Bảng 3.11 Trọng lượng tương đối tuyến tiền liệt (n = 10) Lô Lô chứng sinh lý Lô chứng dương Lô trị (TXCB 0,42 g/kg) Lô trị (TXCB 0,84 g/kg) p lô Trọng lượng 0,098 ± 0,022 0,123a ± 0,023 0,116 ± 0,021 0,114 ± 0,017 0,076 So với lô chứng + 25,25% + 18,07% + 16,02% Ghi chú: a: khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Ở lô chứng dương, trọng lượng tương đối tuyến tiền liệt cao có ý nghĩa so với lô chứng sinh lý (p < 0,05) * Trọng lượng tương đối tuyến Cowper: Bảng 3.12 Trọng lượng tương đối tuyến Cowper (n = 10) 15 3.2.3 Tác dụng mơ hình thỏ gây SGSS FLZ 3.2.3.2 Thời gian tiếp cận Bảng 3.24 Thời gian tiếp cận (giây) thỏ (n = 8) Lô Chứng Ban đầu (1) 11,63 ± 5,71 Mơ hình 11,13 ± 5,14 Trị Trị p lô 13,50 ± 6,41 13,38 ± 6,55 0,806 Sau 30 ngày (2) Sau 60 ngày (3) p thời điểm 13,25 ± 6,50 13,75 ± 5,60 > 0,05 p1-2,3 < 0,05 a a 35,38 ± 14,62 36,13 ± 15,15 p2-3 = 0,784 14,38 ± 8,18 15,88 ± 6,42 > 0,05 14,00 ± 3,96 8,75 ± 5,04 > 0,05 < 0,001 < 0,001 Ghi chú: a: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Ở lơ mơ hình có tăng đáng kể thời gian phản ứng thỏ đực sau 30 ngày sau 60 ngày so sánh với lô chứng lô trị 3.2.3.3 Các số số lượng chất lượng tinh dịch * Thể tích tinh dịch: Bảng 3.25 Thể tích tinh dịch thỏ (mL) thời điểm (n = 8) Lô Chứng Ban đầu (1) Sau 30 ngày (2) Sau 60 ngày (3) p thời điểm 0,69 ± 0,20 0,71 ± 0,18 0,70b ± 0,17 > 0,05 p1-2,3 < 0,05 b c Mơ hình 0,72 ± 0,20 0,46 ± 0,14 0,50 ± 0,13 p2-3 = 0,549 Trị 0,71 ± 0,19 0,64 ± 0,13 0,68b ± 0,17 > 0,05 p1-2,3 > 0,05 a Trị 0,71 ± 0,19 0,68 ± 0,15 0,88 ± 0,20 p2-3 = 0,030 p lô 0,995 0,012 0,001 Ghi chú: a, b, c: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Thời điểm 30 ngày 60 ngày, thể tích tinh dịch lơ mơ hình thấp đáng kể so với lơ chứng, lô trị lô trị 2; lô trị thời điểm 60 ngày cao có ý nghĩa so với lô chứng lô trị * Mật độ tinh trùng (TT x 106/mL): Bảng 3.27 Mật độ tinh trùng thời điểm (n = 8) Lô Ban đầu (1) Sau 30 ngày (2) Sau 60 ngày (3) p thời điểm 16 Chứng Mơ hình 220,75 ± 14,65 Trị 225,36 ± 9,10 Trị 217,56 ± 15,74 p lô 228,98 ± 11,39 0,329 205,23a ± 21,49 205,44 ± 36,83 > 0,05 p < 0,05 1-2,3 157,99bc ± 17,14 174,45b ± 27,60 p2-3 = 0,249 p1-2 = 0,002 166,19ab ± 31,62 206,63 ± 24,68 p1,2-3 > 0,05 p1-3 = 0,100 ab 185,13 ± 22,37 229,76 ± 9,00 p2-1,3 < 0,05 0,002 0,003 Ghi chú: a, b, c: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Mật độ tinh trùng lơ mơ hình 30 ngày 60 ngày thấp có ý nghĩa so với lơ chứng đồng thời giảm so với thời điểm ban đầu Tại 60 ngày, mật độ tinh trùng lô trị trị cao đáng kể so với lô mơ hình * Tổng số tinh trùng lần xuất tinh (TT x 106): Bảng 3.28 Tổng số tinh trùng lần xuất tinh (n = 8) Lô Chứng Mơ hình Ban đầu (1) 151,80 ± 38,76 Sau 30 ngày (2) 146,25a ± 42,32 Sau 60 ngày (3) 144,38ab ± 47,59 165,82 ± 52,02 74,33c ± 28,66 85,09d ± 18,09 Trị 159,95 ± 44,96 104,92bc ± 26,88 137,61bc ± 27,62 Trị 154,23 ± 39,08 123,39ab ± 22,80 201,36a ± 48,18 0,921 0,001 < 0,001 p lô p thời điểm > 0,05 p1-2,3 < 0,05 p2-3 = 0,408 p1-3 = 0,151 p2-1,3 < 0,05 p1-2,3 > 0,05 p2-3 = 0,001 Ghi chú: a, b, c, d: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Thời điểm 30 ngày: tổng số tinh trùng lơ mơ hình, lơ trị thấp đáng kể so với lô chứng; lô trị cao đáng kể so với lơ mơ hình Tại 60 ngày: lơ mơ hình thấp đáng kể so với lơ chứng, trị trị 2; ngồi lơ trị cao có ý nghĩa so với lô trị 17 * Tỉ lệ tinh trùng di động (%): Bảng 3.29 Tỉ lệ tinh trùng di động lô (n = 8) Lô Ban đầu (1) Sau 30 ngày (2) Sau 60 ngày (3) p thời điểm Chứng 30,00 ± 11,03 32,75bc ± 5,95 33,75 ± 9,05 > 0,05 Mơ hình 33,13 ± 12,19 28,38c ± 10,39 22,25b ± 9,54 > 0,05 Trị 29,13 ± 7,43 38,25ab ± 8,10 34,75 ± 6,11 > 0,05 p1-2 = 0,003 a Trị 29,50 ± 7,21 42,13 ± 6,69 39,13 ± 7,24 p1,2-3 > 0,05 p lô 0,837 0,010 0,002 Ghi chú: a, b, c: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Thời điểm 30 ngày, tỉ lệ tinh trùng di động lô trị cao đáng kể so với lơ mơ hình; lơ trị cao đáng kể so với lô chứng lơ mơ hình Tại 60 ngày: tỉ lệ tinh trùng di động lơ mơ hình thấp đáng kể so với lô chứng, trị trị * Tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới (%): Bảng 3.30 Tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới lô (n = 8) Lô Ban đầu (1) Sau 30 ngày (2) Sau 60 ngày (3) p thời điểm Chứng 27,13 ± 10,55 29,75bc ± 5,34 30,63 ± 8,63 > 0,05 Mơ hình 29,75 ± 12,29 25,50c ± 10,16 19,63b ± 8,72 > 0,05 Trị 26,25 ± 6,94 34,75ab ± 7,50 31,50 ± 5,83 > 0,05 p1-2 = 0,003 a Trị 26,75 ± 7,21 38,50 ± 6,21 35,88 ± 6,38 p1,2-3 > 0,05 p lô 0,885 0,010 0,001 Ghi chú: a, b, c: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Tại 30 ngày: Ở lô trị trị 2, tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới cao đáng kể so với lơ mơ hình; ngồi lơ trị cịn cao đáng kể so với lô chứng Tại 60 ngày, tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới lơ mơ hình thấp đáng kể so với lô chứng, trị trị * Tỉ lệ tinh trùng chết (%): 18 Bảng 3.33 Tỉ lệ tinh trùng chết (n = 8) Lô Chứng Ban đầu (1) Sau 30 ngày (2) Sau 60 ngày (3) p thời điểm 27,63 ± 6,91 26,94 ± 5,80 27,50b ± 9,26 > 0,05 p 1-2,3 < 0,05 Mô hình 26,09 ± 6,44 36,50a ± 8,53 39,84a ± 9,47 p2-3 = 0,479 Trị 26,28 ± 7,84 23,88 ± 6,63 23,50bc ± 6,92 > 0,05 p < 0,05 1-2,3 Trị 27,84 ± 7,60 20,66 ± 6,32 18,56c ± 3,54 p2-3 = 0,489 p lô 0,945 0,001 0,05 p1-2,3 < 0,05 a a 26,44 ± 5,28 25,59 ± 7,47 p2-3 = 0,749 20,06 ± 6,37 17,66 ± 4,53 > 0,05 18,53 ± 4,27 14,13 ± 4,19 > 0,05 0,003 0,003 Ghi chú: a: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Thời điểm 30 ngày: lơ mơ hình, tỉ lệ tinh trùng bất thường cao đáng kể so với lô chứng; lô trị trị thấp đáng kể so với lơ mơ hình Thời điểm 60 ngày, lơ mơ hình cao đáng kể so với lơ chứng, ngồi cịn cao lơ trị trị 3.2.3.4 Nồng độ testosteron huyết 19 Bảng 3.35 Nồng độ testosteron huyết (ng/mL, n = 8) Lô Chứng Ban đầu (1) Sau 30 ngày (2) Sau 60 ngày (3) p thời điểm 2,528 ± 0,651 2,794a ± 0,693 2,618b ± 0,585 > 0,05 p 1-2,3 < 0,05 Mơ hình 2,516 ± 0,433 1,349c ± 0,326 1,749c ± 0,407 p2-3 = 0,002 p1-2,3 < 0,05 Trị 2,562 ± 0,635 2,080b ± 0,462 4,427ab ± 1,541 p2-3 = 0,003 p1-2 = 0,938 Trị 2,354 ± 0,870 2,386ab ± 0,681 5,520a ± 1,762 p1,2-3 < 0,05 p lô 0,926 < 0,001 < 0,001 Ghi chú: a, b, c: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Tại thời điểm 30 60 ngày: lơ mơ hình có nồng độ TES huyết thấp có ý nghĩa so với lô chứng, trị trị Ở lô trị lô trị cao đáng kể so với lơ mơ hình 3.2.3.5 Nồng độ MDA huyết Bảng 3.36 Nồng độ MDA huyết (nmol/L, n = 8) Lô Chứng Ban đầu (1) 12,87 ± 1,11 Mơ hình 12,67 ± 1,10 Trị 12,71 ± 1,08 Trị 12,80 ± 1,04 p lô 0,981 Sau 30 ngày (2) Sau 60 ngày (3) p thời điểm 11,70b ± 0,78 12,02a ± 0,75 > 0,05 p 1-3 = 0,969 14,25a ± 1,35 12,70a ± 0,92 p2-1,3 < 0,05 p1-2,3 < 0,05 10,31c ± 1,14 8,49b ± 0,66 p2-3 = 0,003 p1-2,3 < 0,05 10,15c ± 1,11 6,42c ± 1,30 p2-3 = 0,001 < 0,001 < 0,001 Ghi chú: a, b, c: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Thời điểm 30 ngày: lơ mơ hình, nồng độ MDA huyết cao đáng kể so với lô chứng, trị trị Ở lô trị trị thấp đáng kể so với lơ mơ hình lô chứng Thời điểm 60 ngày: lô mô hình cao đáng kể so với lơ trị trị 2; lơ trị thấp có 20 ý nghĩa so với lô chứng lô mô hình; lơ trị thấp có ý nghĩa so với lơ chứng, lơ mơ hình lơ trị 3.2.3.6 Nồng độ MDA tinh dịch Bảng 3.37 Nồng độ MDA tinh dịch (nmol/L, n = 8) Lơ Chứng Ban đầu (1) 9,98 ± 1,78 Mơ hình 10,03 ± 2,25 Trị 10,57 ± 1,28 Trị 11,13 ± 1,91 p lô 0,568 Sau 30 ngày (2) Sau 60 ngày (3) p thời điểm 10,23b ± 2,46 9,88b ± 2,01 > 0,05 p = 0,006 1-3 14,46a ± 3,92 13,69a ± 1,28 p2-1,3 > 0,05 p1-2,3 < 0,05 7,11c ± 1,53 5,96c ± 2,21 p2-3 = 0,218 p1-2,3 < 0,05 c c 5,32 ± 1,70 5,39 ± 1,05 p2-3 = 0,910 < 0,001 < 0,001 Ghi chú: a, b, c: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Tại thời điểm 30 60 ngày: lơ mơ hình, nồng độ MDA tinh dịch cao đáng kể so với lô chứng, trị trị 2; lô trị trị nồng độ MDA tinh dịch thấp đáng kể so với lô chứng 3.2.3.7 Kết đánh giá khả thụ thai Bảng 3.38 Tỉ lệ thụ thai số sinh Số thỏ Số thỏ thụ tinh có thai Chứng (n = 8) 16 Mơ hình (n = 8) 16 Trị (n = 8) 16 10 Trị (n = 8) 16 13 Lô p lô Tỉ lệ thụ thai (%) 56,25 31,25 62,50 81,25 χ2 = 8,392; df = 3; p = 0,039 Số sinh 6,33b ± 1,00 4,80c ± 1,30 6,90ab ± 1,00 7,69a ± 1,55 0,001 Ghi chú: a, b, c: Sự khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cột Có khác biệt có ý nghĩa tỉ lệ thụ thai lô (χ2 = 8,392; df = 3; p = 0,039) Số lượng sinh lơ mơ hình thấp có ý nghĩa so với lô chứng, lô trị lô trị 3.2.3.8 Mơ bệnh học tinh hồn A B C D 21 Hình 3.21 Hình ảnh mơ bệnh học tinh hồn thỏ Ghi chú: nhuộm HE, 400X; A: lơ chứng; B: lơ mơ hình; C: lơ trị 1; D: lơ trị Ở lơ chứng lơ trị có hình ảnh mơ học tinh hồn bình thường; lơ mơ hình có hình ảnh suy giảm sinh tinh (Jonhson score 8); lơ trị 2, có hình ảnh tăng sinh sản tinh trùng Chương BÀN LUẬN 4.1 Về đánh giá độc tính viên nang TXCB 4.1.1 Độc tính cấp Chưa tìm thấy LD50 viên nang TXCB theo đường uống chuột nhắt trắng Với mức liều cao cho chuột uống 24 15,0 g/kg thể trọng khơng xuất độc tính cấp Chưa có cơng bố độc tính cấp TXCB nhiên kết độc tính cấp TXCB phù hợp với nghiên cứu độc tính cấp dược liệu có cơng thức bào chế 4.1.2 Độc tính bán trường diễn Các nghiên cứu độc tính bán trường diễn đánh giá tác dụng khơng mong muốn việc tiếp xúc liên tục lặp lại chất thử nghiệm phần tuổi thọ trung bình động vật thí nghiệm Cụ thể, cung cấp thơng tin quan đích bị ngộ độc; giúp xác định chế độ liều thích hợp cho nghiên cứu dài hạn Kết cho thấy khơng có chuột chết có biểu triệu chứng ngộ độc Khơng có thay đổi số số huyết học, sinh hóa máu; hình ảnh đại thể vi thể gan, lách, thận chuột lô uống TXCB Chứng tỏ TXCB liều 0,42 1,26 g/kg 22 liên tục 90 ngày an toàn nghiên cứu chuột cống trắng Đây nghiên cứu công bố độc tính bán trường diễn TXCB Đối chiếu với kết nghiên cứu công bố trước độc tính dược liệu đơn lẻ, loại trừ khả tương tác dược liệu kết độc tính nghiên cứu phù hợp 4.2 Tác dụng viên nang TXCB sinh dục đực 4.2.1 Hoạt tính androgen Phương pháp đánh giá hoạt tính androgen dựa thay đổi trọng lượng mô- quan phụ thuộc androgen chuột cống đực non thiến phương pháp hay sử dụng, có độ nhạy cao, đáng tin cậy mơ hình tốt để sàng lọc thuốc có hoạt tính androgen Ở chuột cống đực non thiến, mô- quan đáp ứng với androgen với gia tăng trọng lượng tương đối Các chất có hoạt tính androgen làm kích thích, tăng trọng lượng mô- quan Các lô sử dụng chế phẩm nghiên cứu, hai mức liều 0,42 0,84 g/kg/ngày làm tăng đáng kể khối lượng tương đối túi tinh, tuyến Cowper nâng hậu môn- hành hang so với lô chứng Như vậy, chế phẩm mức liều thử nghiệm hoạt tính androgen Tuy nhiên khơng làm tăng trọng lượng tương đối tuyến tiền liệt, lợi ích TXCB sử dụng trị liệu 4.2.2 Tác dụng khả cương dương 4.2.2.1 Về lựa chọn mơ hình gây ĐTĐ ĐTĐ coi yếu tố nguy hàng đầu ED Giảm tổng hợp NO hoạt tính sinh học NO mạch máu đặc trưng rối loạn chức nội mô 23 ĐTĐ Hơn nữa, bệnh nhân ED ĐTĐ nhạy cảm với thuốc ức chế PDE5 đường uống bệnh nhân không mắc ĐTĐ bệnh lý thần kinh tổn thương nội mô Do đó, nghiên cứu phương pháp trị liệu để điều trị ED ĐTĐ cần thiết Do luận án lựa chọn mơ hình ĐTĐ gây ED để nghiên cứu tác dụng TXCB 4.2.2.2 Về kết tác dụng TXCB lên chức cương dương ĐTĐ làm giảm chức cương dương chuột cống trắng, cụ thể làm giảm đáng kể ICP nền, ICPmax, AUC tỉ số ICPmax/MAP, kết phù hợp với nhiều nghiên cứu trước phù hợp với chế bệnh sinh ED ĐTĐ TXCB làm tăng rõ rệt ICPmax, AUC tỉ số ICP/MAP chuột ĐTĐ, điều cho thấy TXCB cải thiện ED chuột ĐTĐ Sự cải thiện số cương dương số chế sau: - TXCB cải thiện số cương dương làm giảm nồng độ glucose máu Có chứng giảm nồng độ glucose máu bệnh nhân ĐTĐ có lợi cho chức cương dương TXCB sau tuần làm giảm rõ rệt nồng độ glucose máu chuột ĐTĐ Tác dụng làm giảm nồng độ glucose máu TXCB phù hợp với nghiên cứu công bố tác dụng dược liệu có TXCB như: thạch hộc tía, sâm cau, câu kỷ tử - Qua chế làm giảm stress oxi hóa: stress oxy hóa làm giảm hoạt tính sinh học NO- yếu tố cần thiết cho cương dương Các nghiên cứu tất dược liệu có cơng thức bào chế TXCB có hoạt tính chống oxi hóa mức độ khác Một số nghiên cứu cịn tác dụng chống oxi hóa dược liệu có lợi cho việc cải thiện chức cương dương - Thông qua đường NO/GMPv 24 - Thông qua việc làm tăng nồng độ TES huyết 4.2.3 Nghiên cứu khả sinh sản 4.2.3.1 Về mơ hình gây suy giảm sinh sản FLZ * Lý lựa chọn thỏ đối tượng nghiên cứu: Có nhiều lợi khiến thỏ trở thành mơ hình động vật phù hợp cho nghiên cứu sinh sản Những lợi cho phép đánh giá theo chiều dọc việc sản xuất tinh trùng (thuốc có ảnh hưởng đến sản xuất tinh trùng hay khơng?), hình thái tinh trùng, số sinh hóa khả thụ thai Tuy nhiên Việt Nam việc sử dụng thỏ nghiên cứu dược lý nói chung nghiên cứu sinh sản nói riêng cịn hạn chế Chưa có báo cáo ghi nhận sử dụng thỏ đối tượng nghiên cứu sinh sản, sử dụng âm đạo giả để thu tinh dịch thỏ thụ tinh nhân tạo cho thỏ để đánh giá khả thụ thai 4.2.3.2 Tác dụng TXCB mơ hình gây SGSS FLZ * Tác dụng lên nồng độ TES huyết thanh: FLZ làm giảm nồng độ TES huyết nghiên cứu thỏ Kết phù hợp với nghiên cứu trước TXCB làm tăng nồng độ TES huyết phụ thuộc liều thỏ gây suy giảm FLZ, có chế chính: (1) làm tăng q trình tổng hợp TES tinh hồn (2) thân chế phẩm nghiên cứu đóng vai trò TES ngoại sinh * Tác dụng thông số số lượng chất lượng tinh trùng: Quá trình sinh tinh chuỗi kiện phức tạp, có trật tự nhậy cảm với thay đổi vật lý, hóa học, sinh học bên bên thể Sự sinh tinh kiểm soát hệ 25 thống hormon trục đồi- tuyến yên- tuyến sinh dục, TES FSH điều hòa sinh tinh trùng gián tiếp thông qua tế bào Sertoli TXCB làm tăng thể tích tinh dịch, tăng mật độ tinh trùng, tăng tổng số tinh trùng lần xuất tinh gây suy giảm FLZ tác dụng có xu hướng phụ thuộc liều, điều chứng minh hình ảnh vi thể tinh hồn Có thể TXCB làm tăng sản xuất tinh trùng theo hai chế sau: (1): Can thiệp vào chức ngoại tiết tinh hoàn cách thay đổi tế bào mầm và/hoặc tế bào Sertoli (2): Can thiệp vào chức nội tiết tinh hoàn cách thay đổi tế bào Leydig phá vỡ hệ thống điều hòa hormon, làm thay đổi nồng độ TES TXCB liều 180 360 mg/kg làm tăng tỉ lệ tinh trùng di động, tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới, giảm tỉ lệ tinh trùng chết tinh trùng có hình thái bất thường thỏ bị suy giảm FLZ Tác dụng giải thích thơng qua chế chống oxi hóa TXCB ROS thường tạo trình phosphoryl oxy hóa ty thể, nồng độ cao hợp chất làm giảm hoạt động ty thể làm giảm khả vận động tinh trùng Sự gia tăng gốc tự tế bào gây peroxyd hóa lipid cách phân hủy oxy hóa acid béo khơng bão hịa màng tế bào Peroxyd hóa lipid tinh trùng làm phá hủy cấu trúc lipid màng tinh trùng, có liên quan đến việc ATP nội bào nhanh chóng dẫn đến tổn thương axonem, giảm khả sống tinh trùng tăng khiếm khuyết hình thái 26 Malondialdehyd (MDA) sản phẩm cuối q trình peroxyd hóa lipid, sản phẩm gốc oxy tự Việc đánh giá nồng độ MDA cho phép gián tiếp đánh giá có mặt hay hoạt động ROS Khi nồng độ MDA cao có mặt hay hoạt tính ROS lớn ngược lại Trong nghiên cứu này, nồng độ MDA tinh dịch huyết lô dùng TXCB thấp đáng kể so với lơ chứng lơ mơ hình Kết khẳng định hoạt tính chống oxi hóa TXCB lý cho việc tăng khả di động, giảm tỉ lệ tinh trùng chết tinh trùng có hình thái bất thường TXCB * Về thụ tinh nhân tạo cho thỏ cái: Việc đánh giá khả thụ thai thụ tinh cho đánh giá kết hay hiệu cuối tác động lên q trình sinh sản Bởi việc thụ thai ngồi phụ thuộc vào số lượng chất lượng tinh trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác Kết lơ mơ hình, tỉ lệ thỏ thụ thai số sinh thấp so với lô chứng, kết phù hợp với việc FLZ làm giảm số lượng tinh trùng, giảm khả di động tăng tỉ lệ tinh trùng chết, tăng tỉ lệ tinh trùng có hình thái bất thường Với lô dùng TXCB, tỉ lệ thỏ thụ thai số sinh cao đáng kể so với lơ mơ kết việc cải thiện số lượng chất lượng tinh trùng TXCB thể thông qua khả thụ thai KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu độc tính tác dụng chức sinh dục đực viên nang TXCB, rút số kết luận sau: Độc tính cấp độc tính bán trường diễn viên nang TXCB 27 1.1 Độc tính cấp Chưa tìm thấy LD50 viên nang TXCB theo đường uống chuột nhắt trắng Với mức liều cao cho chuột uống 24 15,0 g/kg thể trọng khơng xuất độc tính cấp 1.2 Độc tính bán trường diễn Khi cho chuột cống trắng uống viên nang TXCB với mức liều 0,42 1,26 g/kg trọng lượng thể liên tục 90 ngày không ảnh hưởng tới phát triển bình thường chuột, khơng ảnh hưởng tới tăng trọng lượng bình thường chuột Ngồi không ảnh hưởng tới số số huyết học (số lượng hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu); số số sinh hóa (AST, ALT, creatinin, albumin, cholesterol) hình ảnh đại thể vi thể gan, lách, thận Tác dụng TXCB lên số chức sinh dục đực 2.1 Hoạt tính androgen viên nang TXCB Viên nang TXCB thể hoạt tính androgen mức liều 0,42 g/kg 0,84 g/kg đánh giá mô hình chuột cống đực non thiến Cụ thể, viên nang TXCB làm tăng trọng lượng tương đối 3/5 quan sinh dục phụ túi tinh, tuyến Cowper nâng hậu môn- hành hang; nhiên không làm tăng trọng lượng tương đối tuyến tiền liệt đầu dương vật 2.2 Tác dụng lên chức cương dương chuột gây ĐTĐ Viên nang TXCB liều 0,84 g/kg trọng lượng thể liên tục tuần làm giảm nồng độ glucose máu nghiên cứu chuột cống gây ĐTĐ STZ Ngoài làm phục hồi số số đánh 28 giá chức cương dương như: ICPmax, AUC tỉ số ICPmax/MAP; đồng thời làm tăng nồng độ TES huyết 2.3 Tác dụng TXCB lên khả sinh sản Trên mơ hình thỏ đực gây suy giảm sinh sản FLZ, viên nang TXCB liều 180 mg/kg 360 mg/kg làm giảm thời gian phản ứng (một dấu hiệu thể tăng ham muốn tình dục), làm tăng số lượng chất lượng tinh trùng (tăng thể tích tinh dịch, tăng số lượng tinh trùng, tăng tổng số tinh trùng lần xuất tinh, tăng tỉ lệ tinh trùng di động tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới, giảm tỉ lệ tinh trùng chết giảm tỉ lệ tinh trùng có hình thái bất thường) Đồng thời, thụ tinh nhân tạo cho thỏ cái, viên nang TXCB làm tăng tỉ lệ thụ thai số sinh lứa đẻ KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thu tính an tồn tác dụng sinh dục, sinh sản nam viên nang TXCB; đưa số kiến nghị sau: Cần đánh giá sâu tính an tồn viên nang TXCB độc tính di truyền độc tính trình sinh sản phát triển Thực thử nghiệm lâm sàng để đánh giá tác dụng viên nang TXCB người DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Vu Ngoc Thang, Nguyen Hoang Ngan, Nguyen Minh Phuong (2020), Evaluation of acute toxicity, androgenic activity and effect on exercise performance of Truong Xuan CB capsules in experimental animals Journal of Military pharmaco-medicine, 6, 91-96 Vu Ngoc Thang, Nguyen Thanh Ha Tuan, Pham Quoc Binh, Nguyen Minh Phuong, Thai Danh Tuyen, Doan Minh Thuy, Manh Hung Tran, and Nguyen Hoang Ngan (2020), In Vivo Efficacy of TXCB, a Vietnamese Herbal Medicine Prescription, on Seminal Quality, Serum Testosterone, and Malondialdehyde Concentration in Rabbits Natural Product Communications, volume 15(12): 1- DOI: 10.1177/1934578X20983144 ... tính cấp độc tính bán trường diễn viên nang Trường Xuân CB động vật thực nghiệm 2.2 Đánh giá tác dụng tăng cường chức sinh dục đực viên nang Trường Xuân CB động vật thực nghiệm Những đóng góp... TXCB thể thông qua khả thụ thai KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu độc tính tác dụng chức sinh dục đực viên nang TXCB, rút số kết luận sau: Độc tính cấp độc tính bán trường diễn viên nang TXCB 27 1.1 Độc. .. trùng 1.3 Tổng quan viên nang Trường Xuân CB 1.3.2 Thành phần, công thức bào chế viên nang Trường Xuân CB Viên nang Trường Xuân CB (TXCB) nghiên cứu bào chế từ thuốc YHCT cách áp dụng kỹ thuật bào