Nghiên cứu độc tính và tác dụng chống viêm gan, xơ gan của quả dứa dại (pandanus odoratissimus l f) trên thực nghiệm TT

1 Phần A: GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Gan tạng lớn thể, đảm nhiệm nhiều chức quan trọng phức tạp, đóng vai trị quan trọng q trình khử độc chuyển hoá chất Các nguyên nhân gây bệnh lý gan vi khuẩn, virus, kí sinh trùng, rượu, thuốc hoá chất độc xâm nhập vào gan gây viêm gan cấp, viêm gan mạn, tiến triển tới xơ gan ung thư gan Trong điều trị bệnh viêm gan cấp mạn tính, ngồi biện pháp điều trị đặc hiệu, thuốc có tác dụng hỗ trợ điều trị chứng minh có vai trị quan trọng Cây Dứa dại mọc hoang nhiều nơi, dân gian thường dùng phận Dứa dại để điều trị số bệnh Quả Dứa dại dùng riêng kết hợp với số thảo dược khác để điều trị viêm gan, xơ gan Hiện thị trường Dứa dại bán dùng phổ biến, nước chưa có nghiên cứu đánh giá tác dụng độc tính Dứa dại trồng Việt Nam Chúng thực đề tài để chứng minh sở khoa học việc sử dụng Dứa dại điều trị bệnh gan theo kinh nghiệm dân gian, hướng tới khả sử dụng rộng rãi nguồn dược liệu dồi dào, sẵn có, rẻ tiền để điều trị viêm gan, xơ gan lâm sàng Mục tiêu nội dung luận án 2.1 Mục tiêu luận án: Nghiên cứu độc tính cấp độc tính bán trường diễn Dứa dại động vật thực nghiệm Nghiên cứu tác dụng chống tổn thương gan cấp, xơ gan số tác dụng liên quan Dứa dại thực nghiệm 2.2 Nội dung luận án: 2.2.1 Nghiên cứu độc tính - Xác định độc tính cấp Cao chiết tồn phần (CTP) phân đoạn chiết giàu hoạt chất (phân đoạn ethylacetat: PĐE) chiết xuất từ Dứa dại - Xác định độc tính bán trường diễn PĐE chiết xuất từ Dứa dại 2.2.2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm gan, xơ gan Dứa dại - Nghiên cứu tác dụng chống tổn thương gan cấp (tác dụng bảo vệ gan phục hồi tổn thương gan) CTP PĐE chiết xuất từ Dứa dại - Nghiên cứu tác dụng chống xơ gan CTP PĐE chiết xuất từ Dứa dại 2.2.3 Nghiên cứu số tác dụng dược lý liên quan đến tác dụng chống viêm gan, xơ gan CTP PĐE chiết xuất từ Dứa dại: Tác dụng lợi mật; tác dụng chống viêm cấp viêm mạn tính; tác dụng chống oxy hóa in vitro Những đóng góp luận án Luận án nghiên cứu độc tính tác dụng chống viêm gan, xơ gan Dứa dại trồng Việt Nam Kết nghiên cứu cho thấy CTP PĐE chiết xuất từ Dứa dại chưa thể độc tính cấp, phân đoạn PĐE chưa thể độc tính bán trường diễn động vật thực nghiệm CTP PĐE chiết xuất từ Dứa dại có tác dụng bảo vệ gan làm tăng phục hồi tổn thương gan cấp chuột nhắt trắng gây độc bằng paracetamol 400 mg/kg; có xu hướng làm hạn chế tổn thương xơ gan chuột nhắt trắng gây độc bằng CCl4 dài ngày Đồng thời CTP PĐE thể rõ tác dụng lợi mật, chống viêm cấp viêm mạn thực nghiệm, phân đoạn PĐE có tác dụng chống oxy hóa in vitro Kết nghiên cứu đóng góp luận án, lần cơng bố độc tính tác dụng chống viêm gan, xơ gan thực nghiệm Dứa dại trồng Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 4.1 Ý nghĩa khoa học: Các kết nghiên cứu luận án cung cấp bằng chứng khoa học chứng minh tính an toàn tác dụng chống viêm gan, xơ gan CTP PĐE chiết xuất từ Dứa dại, đồng thời tiền đề cho nghiên cứu để nghiên cứu phát triển thuốc sử dụng lâm sàng 4.2 Ý nghĩa thực tiễn: Làm sở khoa học để phát triển thuốc điều trị bệnh lý gan mật hiệu quả, an toàn từ nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có, rẻ tiền tự nhiên Cấu trúc luận án: Luận án gồm 143 trang, bao gồm phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan 35 trang; Đối tượng phương pháp nghiên cứu 15 trang; Kết nghiên cứu 46 trang với 42 bảng, 44 hình; Bàn luận 42 trang; Kết luận kiến nghị (3 trang) Luận án có 179 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt tiếng Anh Phần B: NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh lý viêm gan, xơ gan 1.1.1 Khái niệm: Từ “viêm gan” dùng để trường hợp bệnh lý gây nên tổn thương thối hóa, hoại tử tế bào gan tổn thương mô đệm gan phản ứng viêm gây nên Viêm gan mạn tính bệnh gan có tổn thương hoại tử viêm, có khơng có kèm theo xơ hố, diễn thời gian tháng 1.1.2 Nguyên nhân 1.1.2.1 Nguyên nhân gây viêm gan: Có nhiều nguyên nhân gây viêm gan virus, rượu, nhiễm độc thuốc hóa chất… 1.1.2.2 Nguyên nhân gây xơ gan: Viêm gan virus viêm gan B,C D, rượu số nguyên nhân khác Trong viêm gan mạn tính virus rượu nguyên nhân gây xơ gan, hai nhóm nguyên nhân chiếm 90% trường hợp xơ gan 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh 1.1.3.1 Cơ chế bệnh sinh viêm gan - Cơ chế bệnh sinh viêm gan rượu: Phần lớn rượu chuyển hóa gan thành acetaldehyd, sau nhanh chóng enzym acetaldehyd dehydrogenase (ALDH2) chuyển thành acetat Khả chuyển hóa giai đoạn có giới hạn, lượng acetaldehyd sản sinh với mức q lớn khơng chuyển hóa hết gây giãn mạch gắn vào màng tế bào gây tổn thương tế bào thông qua chế gây độc, viêm miễn dịch - Cơ chế bệnh sinh viêm gan thuốc hóa chất: có chế tổn thương gan phản ứng đặc ứng tổn thương gan liều - Gốc tự có vai trị quan trọng chế bệnh sinh tổn thương gan 1.1.3.2 Cơ chế bệnh sinh xơ gan: Biến đổi chế gây xơ gan tình trạng hóa sợi tiến triển lan tỏa toàn gan tái tổ chức hệ thống vi tuần hồn gan Sự kích hoạt tế bào hình (HSC: hepatic stellate cell) làm tăng sinh sợi collagen tạo thành vách sợi Bên cạnh hoạt động tạo sợi, tế bào gan cịn sống sót tăng cường hoạt động tăng sinh tạo nốt tái tạo bao quanh mô sợi Kết gan trở thành mô sợi chứa nốt tế bào gan, hệ thống vi tuần hoàn cung cấp máu cho tế bào gan khả sản xuất protein tế bào gan bị tổn hại trầm trọng 1.1.4 Chẩn đoán viêm gan mạn tính, xơ gan: Dựa vào triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng 1.1.5 Điều trị viêm gan mạn tính, xơ gan: 1.1.5.1 Điều trị viêm gan mạn - Điều trị viêm gan rượu:ngừng rượu, chế độ dinh dưỡng hợp lý, liệu pháp corticoid, liệu pháp anticytokin, điều trị lọc máu, ghép gan - Điều trị viêm gan thuốc: ngừng thuốc nghi ngờ, điều trị triệu chứng hỗ trợ gan, điều trị đặc hiệu, ghép gan có định - Điều trị viêm gan virus: nghỉ ngơi, hạn chế hoạt động thể lực, kiêng bia rượu, sử dụng thuốc hỗ trợ tế bào gan, điều trị đặc hiệu theo phác đồ điều trị Bộ Y tế 1.1.5.2 Điều trị xơ gan: Chế độ ăn uống sinh hoạt hợp lý, điều trị nguyên nhân, điều trị biến chứng, điều trị dự phịng, ghép gan có định 1.2 Mơ hình nghiên cứu thuốc có tác dụng chống viêm gan cấp, xơ gan thực nghiệm 1.2.1 Mơ hình nghiên cứu thuốc có tác dụng chống viêm gan cấp 1.2.1.1 Đặc điểm chung 1.2.1.2 Mơ hình nghiên cứu sử dụng paracetamol gây độc gan cấp 1.2.1.3 Mơ hình nghiên cứu sử dụng CCl4 gây độc gan cấp 1.2.2 Mơ hình nghiên cứu thuốc có tác dụng chống xơ gan: Mơ hình sử dụng CCl4 dài ngày gây xơ gan động vật thực nghiệm 1.3 Một số thuốc thuốc y học cổ truyền nghiên cứu để điều trị viêm gan: Như kế sữa, cúc gai, nhân trần, ngũ vị tử, diệp hạ châu đắng, nghệ, chàm tía, tam thất, Sói Nhật 1.4 Tổng quan Dứa dại 1.4.1 Phân loại thực vật phân bố Dứa dại: Tên khoa học: Pandanus tectorius Parkincon ex Du Roi (Pandanus odoratissimus L.f.) Còn gọi dứa gai, dứa gỗ Thuộc họ Dứa dại Pandanaceae Chi Pandanus Parkins Việt Nam có 20 lồi số có khoảng lồi sử dụng làm thuốc hương liệu Dứa dại Pandanus odoratissimus L.f có tên gọi khác Dứa gai, Dứa gỗ loài đặc hữu Việt Nam phân bố tỉnh miền núi trung du phía Bắc, bãi ẩm có cát, bụi ven biển, rừng ngập mặn; phân bố đất liền vĩ độ thấp, dọc theo sông suối 1.4.2 Thành phần hóa học Dứa dại: Tác giả Nguyễn Mạnh Cường cộng (2015) công bố kết phân lập xác định cấu trúc hóa học bốn hợp chất phenolic gồm: vanillin (1) ba hợp chất dạng lignans (+)pinoresinol (2), (+)-syringaresinol (3), (+)-medioresinol (4) tách chiết từ Dứa dại Pandanus odoratissimus L.f thu hái Việt Nam 1.4.3 Công dụng Dứa dại: Việt Nam phận Dứa dại đọt non, rễ, lá, sử dụng rộng rãi điều trị 1.4.4 Một số thuốc có Dứa dại: dùng để chữa phù thũng, gãy xương, chữa đái dắt, đái nước, nước tiểu đục, chữa sỏi thận, chữa kinh phong trẻ em Theo kinh nghiệm dân gian, Dứa dại có tác dụng tốt điều trị viêm gan, xơ gan Liều dùng khoảng 30 g phơi khô/ ngày 1.4.5 Nghiên cứu tác dụng sinh học: Các tác giả nước giới nghiên cứu chứng minh dứa dại có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ phục hồi tổn thương gan, chống tăng lipid máu, kháng khuẩn, an thần gây ngủ, hạ đường huyết Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu Thuốc nghiên cứu: Cao chiết toàn phần (CTP) phân đoạn chiết giàu hoạt chất (phân đoạn ethyl acetat: PĐE) chiết xuất từ Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f.) PGS.TS Nguyễn Duy Thuần - Viện Nghiên cứu Y - Dược cổ truyền Tuệ Tĩnh cung cấp CTP PĐE chiết theo quy trình chuẩn Viện Dược liệu Việt Nam 2.2 Thuốc, hóa chất, máy thiết bị phục vụ nghiên cứu: Đạt tiêu chuẩn thí nghiệm 2.3 Động vật thực nghiệm - Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 25,0  2,0 gam (để nghiên cứu tác dụng bảo vệ, phục hồi tổn thương gan chống xơ gan) 20,0  2,0 gam (để nghiên cứu độc tính cấp tác dụng lợi mật, chống viêm mạn) Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp - Chuột cống trắng giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 200 ± 20 gam (để nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp độc tính bán trường diễn) 5 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Nghiên cứu độc tính 2.4.1.1 Nghiên cứu độc tính cấp: Nghiên cứu độc tính cấp tiến hành theo hướng dẫn Tổ chức Y tế giới hướng dẫn Bộ Y tế Việt nam thử thuốc có nguồn gốc từ dược liệu Xác định LD50 mẫu thử chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon - Trước tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm Từng lô chuột nhắt trắng, lô 10 con, uống mẫu thuốc nghiên cứu theo liều tăng dần - Tìm liều cao khơng gây chết chuột (0%), liều thấp gây chết chuột hoàn toàn (100%) liều trung gian Theo dõi tình trạng chung chuột số lượng chuột chết lô 72 Từ xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 mẫu thử Sau tiếp tục theo dõi tình trạng chung chuột đến hết ngày thứ sau uống mẫu nghiên cứu 2.4.1.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn: Nghiên cứu độc tính bán trường diễn mẫu thử PĐE tiến hành chuột cống trắng theo đường uống theo hướng dẫn Tổ chức Y tế giới Chuột uống PĐE liều: tương đương 0,42 g dược liệu/kg/ngày (tương đương liều dự kiến dùng người) tương đương 12,6 g dược liệu/kg/ngày (gấp lần liều dự kiến dùng người) tuần liên tục Đánh giá tình trạng chung thay đổi cân nặng, chức phận tạo máu, chức gan, thận vào trước lúc uống mẫu thử, sau tuần, sau tuần uống mẫu thử sau tuần ngừng uống mẫu thử Đánh giá mô bệnh học gan, thận chuột sau tuần uống mẫu thử tuần ngừng uống mẫu thử 2.4.2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm gan, xơ gan Dứa dại 2.4.2.1 Nghiên cứu tác dụng chống viêm gan cấp * Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan: Chuột nhắt trắng trọng lượng 25,0  2,0 g chia ngẫu nhiên thành lô, lô 10 con: Lô (chứng trắng): Uống dầu olive 0,1 ml/10g Lơ ( mơ hình viêm gan): Uống dầu olive + uống PAR Lô (chứng dương): Uống silymarin (70 mg/kg/ngày) + uống PAR Lô (CTP liều 1): Uống CTP liều tương đương với 7,2 g dược liệu/kg + uống PAR Lô (CTP liều 2): Uống CTP liều tương đương với 14,4 g dược liệu/kg + uống PAR Lô (PĐE liều 1): Uống PĐE liều tương đương với 7,2 g dược liệu/kg + uống PAR Lô (PĐE liều 2): Uống PĐE liều tương đương với 14,4 g dược liệu/kg + uống PAR Chuột uống dầu olive, silymarin mẫu thử liên tục ngày Ngày thứ 8, sau uống thuốc (chuột nhịn đói 16 - 18 trước đó) gây tổn thương gan chuột lô từ lô đến lô bằng uống paracetamol (PAR) liều 400 mg/kg, với thể tích 0,2 ml/10 g 48 sau gây độc bằng PAR, lấy máu động mạch cảnh chuột để xác định hoạt độ enzym AST, ALT đồng thời lấy gan để quan sát mô bệnh học (đại thể, vi thể) * Nghiên cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan Dứa dại: Chuột nhắt trắng 25,0  2,0g, chia thành lô, lô 10 Gây tổn thương gan chuột bằng uống PAR liều 400mg/kg, với thể tích 0,2ml/10g Sau uống PAR giờ, cho chuột uống dầu olive thuốc thử tương ứng với lô: Lô (chứng trắng): Uống dầu olive 0,1 ml/10g Lô Lơ ( mơ hình viêm gan): Uống PAR + uống dầu olive Lô Lô (chứng dương): Uống PAR + uống silymarin 70 mg/kg/ngày Lô Lô (CTP): Uống PAR + CTP liều tương đương với 7,2 g dược liệu/kg Lô Lô (PĐE): Uống PAR + PĐE liều tương đương với 7,2 g dược liệu/kg Chuột lô (5 con), 2,3,4 uống dầu olive thuốc thử ngày Chuột lô (5 con), 6,7,8 uống dầu olive thuốc thử ngày Sau ngày uống thuốc thử, giết chuột, lấy máu động mạch cảnh để xác định hoạt độ enzym AST, ALT; lấy gan để quan sát mô bệnh học (đại thể, vi thể) 2.4.2.2 Nghiên cứu tác dụng chống xơ gan Dứa dại: - Chuột nhắt trắng chủng Swiss trọng lượng 25 ± g gây mơ hình viêm gan mạn dẫn tới xơ gan bằng tiêm màng bụng carbon tetraclorid (CCl 4) pha dầu olive liều 1,0 ml/kg, lần/tuần 18 tuần Thuốc thử thuốc chứng uống hàng ngày 18 tuần (cùng thời gian tiêm CCl4) - Chuột nhắt trắng chia thành lô, lô 10 Lô (chứng trắng): Uống dầu olive thể tích 0,1 mL/10 g Lơ (mơ hình): Tiêm màng bụng CCl4 1,0 mL/kg, lần/tuần Uống dầu olive 0,1 ml/10g/ngày Lô (chứng dương): Tiêm màng bụng CCl4 1,0 mL/kg, lần/tuần Uống silymarin liều 70 mg/kg /ngày Lô (CTP): Tiêm màng bụng CCl4 1,0 mL/kg, lần/tuần Uống CTP liều tương đương 7,2 g dược liệu/kg/ngày Lô (PĐE): Tiêm màng bụng CCl4 1,0 mL/kg, lần/tuần Uống PĐE liều tương đương 7,2 g dược liệu/kg/ngày - Chuột tiêm CCl4 uống thuốc thử 18 tuần, tuần thứ 19 tiến hành đánh giá trọng lượng tương đối chuột, mổ chuột, lấy máu, lấy gan làm xét nghiệm đánh giá chức gan, số huyết học, định lượng collagen typ IV định lượng hàm lượng hydroxyprolin gan chuột quan sát mô bệnh học (đại thể, vi thể) gan chuột 2.4.3 Nghiên cứu số tác dụng dược lý liên quan đến tác dụng chống viêm gan, xơ gan 2.4.3.1 Nghiên cứu tác dụng lợi mật - Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành 13 lô, lơ 20 con, lơ cịn lại lơ 10 Tiến hành gây độc cho chuột lô từ đến 13 bằng cách cho uống PAR liều 400 mg/kg với thể tích 0,2 ml/10g Sau uống PAR giờ, cho chuột uống dầu olive mẫu thử tương ứng với lô sau: Lô (chứng trắng): Uống dầu olive 0,1 ml/10g Lô Lơ ( mơ hình): Uống PAR liều 400 mg/kg + uống dầu olive Lô Lô (chứng dương): Uống actiso ống/kg/ngày (1 ống 5ml chứa 9,3 mg cao mềm actiso) Lô Lô 10 (CTP liều 1): Uống CTP liều tương đương với 7,2 g dược liệu khô/kg Lô Lô 11 (CTP liều 2): Uống CTP liều tương đương với 14,4 g dược liệu khô/kg Lô Lô 12 (PĐE liều 1): Uống PĐE liều tương đương với 7,2 g dược liệu khô/kg Lô Lô 13 (PĐE liều 2): Uống PĐE liều tương đương với 14,4 g dược liệu khô/kg - Actiso mẫu thử pha dầu olive, cho chuột uống với lượng 0,1 ml/10 g thể trọng chuột Chuột lô (10 con), 2, 3, 4, 5, uống dầu olive mẫu thử ngày Chuột lô (10 con), 8, 9, 10, 11, 12 13 uống dầu olive mẫu thử ngày - Ngày thứ ngày thứ 4, sau uống thuốc 30 phút, gây mê chuột bằng ether Mổ bụng chuột, thắt ống mật chủ, sau khâu tạm thành bụng lại Sau 30 phút, mở lại ổ bụng chuột, bóc tách túi mật, thấm bằng giấy lọc, cân xác định trọng lượng túi mật (m1) Rạch túi mật, thấm hết dịch mật, cân riêng vỏ túi mật (m2) Tính trọng lượng dịch mật (m) độ lợi mật (L%) 2.4.3.2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp * Đánh giá tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù chân chuột carrageenin - Chuột cống trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lơ 10 Lơ (mơ hình): Uống dầu olive 1,0 ml/100g Lô (chứng dương): Uống aspirin liều 200 mg/kg Lô (CTP liều 1):Uống CTP liều tương đương với 4,2 g dược liệu khơ/kg (Liều có tác dụng tương đương người, tính theo hệ số 7) Lơ (CTP liều 2): Uống CTP liều tương đương với 8,4 g dược liệu khô/kg Lô (PĐE liều 1): Uống PĐE liều tương đương với 4,2 g dược liệu khô/kg Lô (PĐE liều 2): Uống PĐE liều tương đương với 8,4 g dược liệu khô/kg - Chuột uống dầu olive thuốc ngày liền trước gây viêm Ngày thứ 4, sau uống thuốc 30 phút, gây viêm bằng cách tiêm carrageenin 1% (pha nước muối sinh lý) 0,05 ml/chuột vào gan bàn chân sau, bên phải chuột Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng dụng cụ chuyên biệt (Plethysmometer) vào thời điểm: trước gây viêm, sau gây viêm giờ, giờ, 24 Tính độ tăng thể tích chân chuột (V%) Tính khả ức chế phản ứng phù (I%) * Đánh giá tác dụng chống viêm cấp theo phương pháp gây tràn dịch màng bụng chuột cống trắng: - Chuột cống trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô 10 Các lô chuột uống dầu olive, aspirin liều mẫu thử CTP, PĐE tương tự thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù chân chuột bằng carrageenin - Chuột uống dầu olive thuốc ngày liền trước gây viêm Ngày thứ sau uống thuốc dầu olive 30 phút, tiến hành gây viêm màng bụng bằng dung dịch carrageenin 0,05 g + formaldehyd 1,4 ml pha 100 ml nước muối sinh lý vừa đủ, với thể tích ml vào khoang màng bụng cho chuột - Sau 24 gây viêm, mổ ổ bụng chuột hút dịch rỉ viêm Đo thể tích đếm số lượng bạch cầu/ml dịch rỉ viêm, định lượng protein dịch rỉ viêm 2.4.3.3 Tác dụng chống viêm mạn mơ hình gây u hạt thực nghiệm amiant Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lơ 10 Lơ ( mơ hình): Uống dầu olive 0,1ml/10g Lô (chứng dương): Uống methylprednisolon liều 15 mg/kg Lô (CTP liều 1): Uống CTP liều tương đương với 7,2 g dược liệu Lô (CTP liều 2): Uống CTP liều tương đương với 14,4 g dược liệu /kg Lô (PĐE liều 1): Uống PĐE liều tương đương với 7,2 g dược liệu /kg Lô (PĐE liều 2): Uống PĐE liều tương đương với 14,4 g dược liệu /kg - Gây viêm mạn bằng cách cấy sợi amiant trọng lượng mg tiệt trùng (sấy 120oC giờ) tẩm carrageenin 1%, da gáy chuột - Sau cấy u hạt, chuột uống dầu olive thuốc thử liên tục ngày Ngày thứ tiến hành giết chuột bằng clorofoc, bóc tách khối u hạt cân tươi, sau khối u sấy khơ nhiệt độ 56oC 18 Cân trọng lượng u hạt sau sấy khô So sánh trọng lượng trung bình khối u hạt (đã trừ trọng lượng amiant) lơ Tác dụng chống viêm tính theo tỉ lệ % giảm trọng lượng khối u so với lơ mơ hình 2.4.3.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro * Phương pháp đánh giá khả dọn gốc tự DPPH: - Đánh giá khả dọn gốc tự DPPH mẫu nghiên cứu tiến hành bằng phương pháp đo quang DPPH (1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl) chất tạo gốc tự dùng để thực phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể qua việc giảm màu DPPH, xác định bằng cách đo quang bước sóng λ = 517 nm - Tính khả dọn gốc tự DPPH mẫu thử (cho chất đối chiếu dương) I (%) Khả dọn gốc tự DPPH biểu diễn bằng giá trị IC50 hiểu nồng độ mẫu thử ức chế 50 % lượng gốc tự * Phương pháp đánh giá khả dọn gốc tự superoxid anion (O2 -•): - Anion superoxid (O2 -•) tạo từ phản ứng chuyển xanthin thành acid uric xúc tác xanthin oxidase Anion superoxid phản ứng với nitro blue tetrazolium (NBT) tạo dung dịch có màu xanh tím - Đánh giá khả dọn gốc tự O2-• mẫu nghiên cứu tiến hành bằng phương pháp đo quang Tính khả dọn gốc tự O2-• mẫu thử (cho chất đối chứng dương) I (%) Khả dọn gốc tự O2-• biểu diễn bằng giá trị IC50 hiểu nồng độ mẫu thử ức chế 50 % lượng gốc tự 2.5 Xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu xử lý thống kê theo phương pháp t - test Student test “trước - sau” (Avant - Après) Số liệu biểu diễn dạng : X ± SD Sự khác biệt có ý nghĩa p < 0,05 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu độc tính cấp độc tính bán trường diễn 3.1.1 Độc tính cấp - Chuột nhắt trắng uống mẫu CTP với liều tăng dần từ 207 gam dược liệu/kg/24 đến 1035 gam dược liệu/kg/24 uống mẫu PĐE với liều tăng dần từ 1350 gam dược liệu/kg/24 đến 6750 gam dược liệu/kg/24 - Sau uống mẫu thử, chuột ăn uống, hoạt động tiết bình thường Khơng thấy có biểu ngộ độc chuột khơng có chuột chết 72 sau uống mẫu thử Tiếp tục theo dõi ngày sau uống mẫu thử thấy chuột hồn tồn bình thường, khơng có biểu đặc biệt Vì chưa xác định LD50 CTP PĐE chuột nhắt trắng theo đường uống 3.1.2 Độc tính bán trường diễn PĐE chiết xuất từ Dứa dại: PĐE mức liều: tương đương 0,42 g dược liệu/kg/ngày (tương đương liều dự kiến dùng người) tương đương 12,6 g dược liệu/kg/ngày (gấp lần liều dự kiến dùng người) uống liên tục tuần theo dõi tuần sau ngừng uống chưa thấy biến đổi số huyết học, sinh hóa máu mô bệnh học gan thận chuột 3.2 Đánh giá tác dụng chống viêm gan, xơ gan CTP PĐE 3.2.1 Tác dụng chống viêm gan cấp 3.2.1.1 Tác dụng bảo vệ gan Bảng 3.1: Ảnh hưởng CTP PĐE lên hoạt độ AST, ALT huyết chuột bị gây độc PAR AST (UI/L) ALT (UI/L) Lơ thí nghiệm n ( X  SD) ( X  SD) Lô (chứng) 10 206,0  14,2 58,4  8,0 Lơ ( mơ hình) 10 328,4  31,8*** 240,5  68,0*** Lô (silymarin) 10 225,1  27,3∆∆∆ 116,9  30,3***, ∆∆∆ Lô (CTP liều 1) 10 235,1  22,9**, ∆∆∆ 95,9  24,2***, ∆∆∆ , ∆∆∆ Lô (CTP liều 2) 10 232,8  36,7* 106,6  21,6***, ∆∆∆ Lô (PĐE liều 1) 10 208,4  33,4 ∆∆∆ 93,1  20,9***, ∆∆∆ ∆∆∆ Lô (PĐE liều 2) 10 216,6  33,1 100,8  29,4***, ∆∆∆ , , Chú thích: * ** ***: p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001, p so với lô (chứng) ∆∆∆ : p < 0,001, p so với lơ (mơ hình) - Nhận xét: kết bảng 3.1 cho thấy hoạt độ AST ALT lơ mơ hình (gây độc bằng PAR liều cao) tăng cao rõ rệt so với lô chứng sinh học (p < 0,001) Uống CTP, PĐE silymarin ngày trước gây độc bằng PAR làm giảm rõ rệt hoạt độ AST ALT so với lô (lô gây độc không dùng thuốc) (p 0,05) 12 * Ảnh hưởng CTP PĐE đến chức gan chuột: Bảng 3.5: Ảnh hưởng CTP PĐE đến nồng độ albumin, nồng độ cholesterol toàn phần nồng độ bilirubin toàn phần máu chuột Albumin Cholesterol Bilirubin toàn (g/dl) (mmol/l) phần(mmol/l) Lơ thí nghiệm n ( X SD) ( X SD) ( X SD) Lô (chứng) 10 3,09  0,31 2,96  0,47 1,33  0,33 Lơ (Mơ hình) 10 2,51  0,26*** 2,09  0,39*** 1,74  0,41* Lô (Silymarin) 10 2,78  0,42 3,15  1,01 ∆∆ 1,29  0,54 ∆ Lô (CTP) 2,65  0,26** 2,37  0,26** 0,95  0,25*, ∆∆∆ Lô ( PĐE) 2,55  0,28** 2,56  0,32 ∆∆ 0,80  0,21**, ∆∆∆ , Chú thích: * **,***: p < 0,05, p< 0,01, p< 0,001, p so với lô (chứng) ∆, ∆∆, ∆∆∆ : p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001, p so với lô (mơ hình) Nhận xét: - Nồng độ bilirubin tồn phần albumin máu chuột lơ mơ hình tăng rõ rệt so với lô chứng (lô 1) Nồng độ cholesterol máu chuột lơ mơ hình giảm rõ rệt so với lô chứng (p < 0,001) - Nồng độ albumin máu chuột lô uống thuốc thử thuốc chuẩn cao so với lô mơ hình khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) - Nồng độ cholesterol máu chuột lô (uống silymarin) lô (uống PĐE) tăng rõ rệt so với lơ mơ hình (p < 0,01) khơng có khác biệt so với lô chứng (p>0,05) - Tất lô uống CTP (lô 4), PĐE (lô 5) lô uống silymarin (lô 3) làm giảm rõ rệt nồng độ bilirubin tồn phần máu chuột so với lơ mơ hình (p 0,05) * Ảnh hưởng CTP PĐE đến số đánh giá mức độ xơ gan gan chuột: Bảng 3.7 Ảnh hưởng CTP PĐE đến hàm lượng hydroxyprolin lượng collagen type IV gan chuột Lơ thí nghiệm Lơ (Chứng) Lơ (Mơ hình) Lơ (Silymarin) Lơ (CTP) Lơ (PĐE) n Hàm lượng hydroxyprolin (µg Hyp/1g mô tươi) ( X SD) Lượng collagen type IV % ( X SD) 10 10 10 9 336,0  62,0 553,4  100,7*** 505,3  123,2*** 495,7  95,8*** 576,3  148,3*** 0,1205 ± 0,0175 6,3441 ± 0,9972*** 6,3536 ± 3,1695*** 5,5142  2,4812*** 5,3286  2.3270*** Chú thích: ***: p < 0,001, p so với lơ (chứng) Nhận xét: Các lô dùng thuốc thử thuốc chuẩn có xu hướng giảm nồng độ hydroxyprolin giảm lượng collagen type IV so với lơ mơ hình khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) * Ảnh hưởng CTP PĐE lên hình ảnh mơ bệnh học gan chuột: Tất mẫu bệnh phẩm gan lơ chứng có cấu trúc bình thường Lơ (mơ hình): 4/5 mẫu bệnh phẩm có tổn thương xơ gan Lơ (silymarin) có 4/5 mẫu bệnh phẩm khơng có xơ gan Lơ (CTP) có 4/5 mẫu bệnh có xơ hóa nhẹ xâm nhập viêm khoảng cửa (khơng có hình ảnh xơ gan đầy đủ) Lô (PĐE) 5/5 mẫu bệnh phẩm khơng có xơ gan 3.3 Kết số tác dụng dược lý liên quan đến tác dụng chống viêm gan, xơ gan Dứa dại 3.3.1 Kết nghiên cứu tác dụng lợi mật Dứa dại Bảng 3.8 Ảnh hưởng CTP PĐE đến trọng lượng dịch mật túi mật chuột sau gây độc ngày Trọng lượng dịch % tăng so với n Độ lợi Lơ thí nghiệm lơ mơ hình mật (%) mật ( X SD) Lơ (Chứng) 10 8,54  1,79 Lơ (Mơ hình) 10 -18,3% 6,98  1,49* ∆∆∆ Lô (Actiso) 10 39,4 13,9% 9,73  1,61 , ∆∆∆ Lô 10 (CTP liều 1) 10 63,0 33,3% 11,38  2,55* Lô 11 (CTP liều 2) 10 11,74  2,79**, ∆∆∆ 68,2 37,5% , ∆∆∆ Lô 12 (PĐE liều 1) 10 50,3 22,8% 10,49  1,94* Lô 13 (PĐE liều 2) 10 15,5  2,87***, ∆∆∆ 122,1 91,5% , , Chú thích: * ** ***: p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001, p so với lô (chứng) 14 ∆∆∆ : p < 0,001, p so với lơ (mơ hình) Nhận xét: kết bảng 3.8 cho thấy: - Tất lô uống CTP, PĐE actiso trọng lượng dịch mật tăng rõ rệt so với lơ mơ hình (p < 0,001) - Cả lô uống liều mẫu thử CTP PĐE có trọng lượng dịch mật tăng rõ rệt so với lô chứng (p 0,05) - Kết nghiên cứu cho thấy CTP liều cao (liều 2) liều PĐE có tác dụng chống viêm cấp rõ rệt mơ hình gây phù chân chuột bằng carrageenin Riêng lô uống CTP liều chưa thể tác dụng chống viêm cấp mơ hình 3.3.2.2 Tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây tràn dịch màng bụng carrageenin Bảng 3.10 Ảnh hưởng CTP PĐE lên thể tích dịch rỉ viêm, số lượng bạch cầu hàm lượng protein dịch rỉ viêm 15 Lô nghiên cứu Lô (Mơ hình) Lơ (Aspirin) Lơ (CTP liều 1) Lô (CTP liều 2) Lô (PĐE liều 1) Lơ (PĐE liều 2) n Thể tích dịch rỉ viêm (ml) Số lượng bạch cầu (G/l) Hàm lượng protein (mg/dl) 10 3,45  0,98 16,06  5,79 4,25  0,30 10 2,05  0,68*** 10,01  3,11** 3,09  0,40*** 10 2,80  1,17 14,48  1,56∆∆ 3,98  0,29∆∆∆ 10 2,51  0,28* 8,58  2,72*** 3,65  0,46***, ∆ 10 2,29 0,61**, ∆∆ 10,80  1,79* 3,83  0,47*, ∆∆ 10 2,23  0,73** 10,52  3,73* 3,88  0,34*, ∆∆∆ Chú thích: *, **, ***: p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001, p so với lơ (mơ hình) ∆, ∆∆, ∆∆∆ : p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001, p so với lô (aspirin) Nhận xét: Kết bảng 3.10 cho thấy: CTP liều PĐE liều uống ngày liên tục làm giảm rõ rệt thể tích dịch rỉ viêm, số lượng bạch cầu hàm lượng protein so với lô chứng (p < 0,05 p < 0,001) CTP liều thấp (liều 1) chưa thể tác dụng chống viêm cấp mơ hình 3.3.3 Tác dụng chống viêm mạn CTP PĐE mơ hình gây u hạt thực nghiệm amiant Bảng 3.11.Trọng lượng trung bình u hạt thực nghiệm Trọng lượng Tỉ lệ giảm trọng Lô nghiên cứu n lượng u hạt (%) u hạt (mg) ( X ± SD) Lơ (mơ hình) 10 20,0 ± 6,5 Lô (Methylprednisolon) 10 13,3 ± 4,3* 33,5 Lô (CTP liều 1) 10 16,3 ± 5,1 18,5 Lô (CTP liều 2) 10 15,0 ± 2,7* 24,5 Lô (PĐE liều 1) 10 15,7 ± 4,3 21,5 Lô (PĐE liều 2) 10 15,2 ± 2,6* 24,0 Chú thích: *: p < 0,05, p so với lơ (mơ hình) Nhận xét: kết bảng 3.11 cho thấy: - Trọng lượng u hạt lô uống methylprednisolon lô uống mẫu thử CTP liều cao PĐE liều cao giảm rõ rệt so với lô mơ hình (p < 0,05) Hai lơ uống CTP PĐE liều thấp có giảm trọng lượng u hạt so với lơ mơ hình, khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê - Khơng có khác biệt rõ rệt trọng lượng u hạt lô uống mẫu thử với methylprednisolon 16 3.3.4 Tác dụng chống oxy hóa in vitro CTP PĐE chiết xuất từ Dứa dại 3.3.4.1 Kết dọn gốc tự DPPH Bảng 3.12 Khả dọn gốc tự DPPH CTP PĐE Khả dọn gốc tự DPPH (%) Nồng độ (µg/ml) IC50 400 200 100 50 25 12,5 Mẫu thử (µg/ml) CTP 55,5 33,8 18,1 10,7 8,0 >200 PĐE 98,8 92,6 69,0 41,2 25,5 29,1 Khả dọn gốc tự DPPH quercetin Nồng độ (µg/ml) 20 10 2.5 1.25 IC50 (µg/ml) Khả dọn gốc 95,0 90,0 88,4 60,3 21,2 1,88 tự (%) 3.4.4.2 Kết dọn gốc superoxid Bảng 3.13 Kết dọn gốc tự superoxid của CTP PĐE Khả dọn gốc tự superoxid (%) IC50 Nờng độ (µg/ml) 400 200 100 50 25 12,5 (µg/ml) Mẫu thử CTP >400 PĐE 98,6 86,7 71,8 53,5 30,1 23,8 Khả dọn gốc tự anion superoxid quercetin Nồng độ (µg/ml) 20 10 2.5 1.25 IC50 (µg/ml) Khả dọn 94, 87,7 70,1 40,8 28,3 2,6 gốc tự (%) Nhận xét: kết bảng 3.12 3.13 cho thấy: Cao phân đoạn ethyl acetat Dứa dại có tác dụng chống oxy hóa in vitro hai mơ hình dọn gốc tự DPPH dọn gốc tự O2-• với giá trị IC50 29,1 23,8 µg/ml Cao tồn phần khơng có tác dụng, có tác dụng yếu mơ hình CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Độc tính CTP PĐE chiết xuất từ Dứa dại 4.1.1 Độc tính cấp CTP PĐE Xác định độc tính cấp liều chết 50% để đánh giá mức độ độc mẫu thử có sở chọn liều thử tác dụng cho bước nghiên cứu * Độc tính cấp CTP: Cho chuột nhắt trắng uống mẫu thử CTP theo liều tăng dần từ 207 g dược liệu/kg/24 (gấp 28,75 lần liều có tác dụng tương đương người) đến liều cao (nồng độ thể tích tối đa cho phép) 1035 g dược liệu/kg/24 (gấp 143,75 lần liều có tác dụng tương đương người) không thấy dấu hiệu bất thường chuột khơng có chuột chết 17 * Độc tính cấp PĐE: Cho chuột nhắt trắng uống mẫu PĐE theo liều tăng dần từ 1350 g dược liệu/kg/24 (gấp 187,5 lần liều có tác dụng tương đương người) đến liều cao (nồng độ thể tích tối đa cho phép) 6750 g dược liệu/kg/24 (gấp 937,5 lần liều có tác dụng tương đương người) không thấy dấu hiệu bất thường chuột khơng có chuột chết Mặc dù chuột nhắt trắng uống CTP PĐE đến liều cao (1035 g 6750 g dược liệu/kg/24 giờ), với mức liều khơng có chuột chết khơng quan sát thấy biểu ngộ độc chuột Vì vậy, chưa xác định độc tính cấp chưa tính LD50 mẫu CTP PĐE chuột nhắt trắng theo đường uống Mẫu CTP cho chuột uống đến liều 1035 g dược liệu/kg/24 (gấp 143,75 lần liều có tác dụng tương đương người) mẫu PĐE cho chuột uống đến liều 6750 g dược liệu/kg/24 (gấp 937,5 lần liều có tác dụng tương đương người) không thấy dấu hiệu bất thường chuột khơng có chuột chết Kết nghiên cứu cho thấy mẫu thử này, đặc biệt mẫu PĐE có độ an tồn cao 4.1.2 Độc tính bán trường diễn PĐE - Trong q trình chiết xuất dịch chiết từ Dứa dại, mẫu PĐE thu tinh khiết mẫu CTP Qua nghiên cứu tác dụng chống viêm gan, xơ gan số tác dụng dược lý liên quan, kết cho thấy mẫu PĐE có xu hướng thể tác dụng tốt CTP Nếu mẫu PĐE nghiên cứu phát triển thành thuốc sử dụng lâm sàng có nhiều ưu điểm so với mẫu CTP Vì lý đó, chúng tơi định hướng lựa chọn phân đoạn hoạt chất PĐE để tiến hành nghiên cứu lâm sàng, độc tính bán trường diễn mẫu PĐE đánh giá chuột cống trắng theo đường uống - Trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn, mẫu thử PĐE cho chuột cống trắng uống với mức liều: liều tương đương 4,2 g dược liệu/kg/ngày (là liều có tác dụng tương đương liều dùng người) liều gấp lần (12,6 g dược liệu/kg/ngày), uống liên tục tuần Các số đánh giá thực theo hướng dẫn Tổ chức Y tế giới Bộ Y tế Việt Nam, bao gồm theo dõi tình trạng chung, thể trọng chuột, đánh giá chức phận tạo máu, cấu trúc chức gan, mức độ tổn thương tế bào gan, cấu trúc chức thận - Kết nghiên cứu cho thấy tất số theo dõi lơ uống PĐE khơng có khác biệt so với lô chứng, chứng tỏ PĐE không gây độc tính bán trường diễn chuột cống trắng uống liều tuần Với kết nghiên cứu độc tính bán trường diễn phân đoạn PĐE chiết xuất từ Dứa dại, phân loại PĐE vào nhóm thuốc khơng có độc tính sử dụng liều lặp lại dài ngày (8 tuần) 18 4.2 Tác dụng chống viêm gan cấp CTP PĐE chiết xuất từ Dứa dại 4.2.1 Tác dụng bảo vệ gan - Ở lơ mơ hình (gây độc bằng PAR không dùng mẫu thử), PAR với liều 400mg/kg dùng đường uống chuột nhắt trắng, sau ngày dùng thuốc làm tăng hoạt độ ALT 311,8% AST 59,4% so với nhóm chứng (bảng 3.1) Điều chứng tỏ PAR gây tổn thương tế bào gan cấp, làm giải phóng enzym vào máu - Dùng CTP PĐE ngày trước gây độc có tác dụng làm giảm rõ rệt hoạt độ ALT AST so với lơ mơ hình (p