Cao toàn phần, các dịch chiết nước, alkaloid, flavonoid… hay các chất phân lập được từ Bán chi liên (Scutelaria barbata D. Don) được báo cáo có hoạt tính kháng ung thư trực tràng, u xơ tử cung, ung thư gan, tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn... Bài viết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của Bán chi liên (Scutelaria barbata D. Don).
Trang 1KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN
CỦA BÁN CHI LIÊN (Scutelaria barbata D Don)
Nguyễn Thị Linh Ngân*, Ngô Thanh Diệp*, Đỗ Thị Hồng Tươi*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Cao toàn phần, các dịch chiết nước, alkaloid, flavonoid… hay các chất phân lập được từ Bán chi
liên (Scutelaria barbata D Don) được báo cáo có hoạt tính kháng ung thư trực tràng, u xơ tử cung, ung thư gan, tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn
Mục tiêu: khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của Bán chi liên (Scutelaria barbata D Don)
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Mẫu thử là cao cồn 50%, cao flavonoid, apigenin, luteonin từ Bán
chi liên Đánh giá hoạt tính độc tế bào gan HepG2 bằng test MTT Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng phương pháp DPPH và định lượng MDA gan; độc tính cấp đường uống trên chuột đực và cái, theo dõi tỷ lệ chết trong 72 giờ Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan in vitro được khảo sát trên chuột nhắt gây viêm gan bằng CCl 4
vào ngày 15 sau khi cho chuột uống cao hoặc thuốc đối chiếu silymarin trong 14 ngày liên tiếp Ngày 16, xác định hoạt tính ALT, AST và hàm lượng MDA, GSH trong gan; quan sát đại thể và vi thể gan
Kết quả: Cao cồn 50%, cao flavonoid và luteonin không độc tế bào gan HepG2 trong khi apigenin ức chế sự
tăng trưởng tế bào Cao cồn 50%, cao flavonoid và luteonin có hoạt tính chống oxy hóa in vitro với IC 50 lần lượt là 110,78; 29,82; 58,03 μg/ml trong phương pháp DPPH và 25,61; 19,88; 10,16 μg/ml trong phương pháp MDA Liều tối đa của cao cồn 50% không gây chết chuột LD 0 là 16 g cao/kg; cao flavonoid không có độc tính cấp đường uống ở liều tối đa D max là 2,24 g/kg Các cao từ Bán chi liên giúp giảm tổn thương gan do CCl 4 qua sự giảm hoạt tính AST, ALT và lượng MDA; tăng lượng GSH, cải thiện mức độ viêm gan khi phân tích mô bệnh học Tác dụng của cao cồn tương tự silymarin trong khi cao flavonoid chống oxy hóa, bảo vệ gan tốt hơn
Kết luận: Cao cồn 50% và cao flavonoid từ Bán chi liên có tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan ở cấp độ in
vitro và in vivo Tác dụng này có thể do hoạt tính chống oxy hóa của luteolin trong dược liệu
Từ khóa: Bán chi liên, tế bào HepG2, độc tính cấp, chống oxy hóa, bảo vệ gan
ABSTRACT
STUDY ON ANTIOXIDANT AND HEPATOPROTECTIVE EFFECTS
OF SCUTELARIA BARBATA D DON
Nguyen Thi Linh Ngan, Ngo Thi Thanh Diep, Do Thi Hong Tuoi
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No 2 - 2016: 195 - 203
Introduction - Objectives: Alcoholic, flavonoids, alkaloids extracts and some substances isolated from
Scutelaria barbata D Don have been reported about their activity against colorectal cancer, liver cancer as well as antioxidant, anti-inflammatory and antibacterial effects The aim of this work was to study on antioxidant and hepatoprotective effects of S barbata D Don
Methods: 50% alcoholic and flavonoids extracts; apigenin, luteonin were assessed cytotoxicity in
HepG2 cells by MTT test, in vitro antioxidant activity by DPPH and MDA methods Oral acute toxicity in
*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Trang 2mice was studied on death rate within 72 hours after being dosed Hepatoprotective effects were evaluated against CCl 4 induced hepatitis Mice were pre-treated orally with extracts or silymarnin for 14 days followed by a single dose of CCl 4 on 15 th day On day 16, liver enzymes AST, ALT activities were estimated
in serum Glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) levels in liver homogenate were determined Liver histopathological changes were also studied
Results: 50% alcoholic and flavonoids extracts, luteonin had no cytotoxicity in HepG2 cells while apigenin
inhibited cells growth Two extracts and luteonin had in vitro antioxidant activity with respective IC 50 of 110.78; 29.82; 58.03 μg/ml in DPPH method; 25.61; 19.88; 10.16 μg/ml in MDA assay Minimum lethal dose of alcoholic extract was 16 g/kg while flavonoid one had no oral acute toxicity at D max of 2.24 g/kg Two these extracts attenuated liver damage due to CCl 4 administration as indicated by significant reduction in elevated levels of ALT, AST and MDA; increase in GSH content; improvement of hepatitis level in histopathological analysis These effects of alcoholic extract were similar to that of silymarin while flavonoid extract exhibited better hepatoprotection
Conclusion: Alcoholic and flavonoid extracts of S barbata D Don had antioxidant and
hepatoprotective effects in vitro as well as in vivo This effect may be due to antioxidant activity of luteonin present in the medicinal plant
Key words: Scutelaria barbata D Don, HepG2 cells, acute toxicity, antioxidant, hepatoprotective effect
ĐẶT VẤN ĐỀ
Gan là một cơ quan lớn, thực hiện nhiều
chức năng đặc biệt của cơ thể Do gan ở vị trí cửa
ngõ, dễ bị ảnh hưởng bởi các chất độc nên bệnh
gan đa dạng, phức tạp và ngày càng gia tăng gây
ảnh hưởng đến sức khỏe của con người Xu
hướng hiện nay là phát triển, sử dụng thuốc từ
dược liệu giúp bảo vệ gan, kiểm soát và điều trị
kịp thời nhờ ưu điểm có thể sử dụng lâu dài,
tính an toàn cao
Bán chi liên (Scutellaria barbata D.Don), họ
Lamiaceae được dùng trong y học cổ truyền
nhờ có vị hơi đắng, tính mát, tác dụng thanh
nhiệt giải độc, lợi tiểu, tiêu sưng, giảm đau(11)
Từ xưa, Bán chi liên được dùng chữa đinh
nhọt, viêm gan viêm vú, viêm mủ da, sâu
quảng, rắn độc cắn, bệnh phụ khoa(11) Bán chi
liên cũng có trong bài thuốc chữa ung thư
phổi, gan, trực tràng giai đoạn đầu Một số
nghiên cứu trên thế giới báo cáo cao toàn
phần, hoặc các dịch chiết khác nhau như nước,
alkaloid, flavonoid… hay các chất phân lập
được từ Bán chi liên như apigenin, scutellanin,
luteolin… có hoạt tính kháng ung thư trực
tràng, u xơ tử cung, ung thư gan, tác dụng
khuẩn (1,2,5,12) Hiện nay, ở Việt Nam có các nghiên cứu về thành phần hóa học, khả năng kháng lại NF-kB của Bán chi liên nhưng chưa
có nghiên cứu hay chứng minh về tác dụng chống oxy hóa trên của cao toàn phần, cao flavonoid, một số chất phân lập từ dược liệu này như apigenin, luteolin(7) Từ những cơ sở trên, nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của
Bán chi liên (Scutelaria barbata D Don)”
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Cao dược liệu: cao cồn 50% toàn phần, cao
flavonoid, apigenin, luteonin từ Bán chi liên được kiểm nghiệm, cung cấp bởi BM Hóa phân tích-Kiểm nghiệm, Khoa Dược, ĐH Y Dược Tp HCM
Hóa chất: DPPH, quercetin, MDA chuẩn,
GSH chuẩn (Sigma-Aldrich, Mỹ), methanol, acid thiobarbituric (Merck, Đức), silymarin (Madaus, Đức), formalin (Trung Quốc) Các loại hóa chất
sử dụng đạt tiêu chuẩn độ tinh khiết phân tích
PA (Pure for analysis)
Động vật nghiên cứu: Chuột nhắt Swiss
albino, 6-7 tuần tuổi, trọng lượng trung bình
22-25 g, do Viện Vaccin và Sinh phẩm Y tế Nha
Trang 3Trang cung cấp Chuột đực và cái, khoẻ mạnh,
không có biểu hiện bất thường, nuôi ổn định
trong môi trường thí nghiệm 3 - 5 ngày Chuột
được nuôi trong lồng kích thước 25x35x15 cm (6
chuột/lồng) và cung cấp thức ăn, nước uống đầy
đủ trong thử nghiệm
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư gan
HepG2 (1)
Tế bào HepG2 (2,5 × 104/cm2) nuôi cấy trong
môi trường EMEM, bổ sung 10% huyết thanh
thai bò, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin,
100 μg/ml streptomycin trên đĩa 96 giếng, ủ
37°C, 5% CO2 Sau 18 giờ, xử lý tế bào với mẫu
thử ở các nồng độ khác nhau hoặc đối chứng
doxorubicin trong 24 giờ Ủ ở 37oC, 5% CO2, thực
hiện test MTT xác định tỷ lệ tế bào sống Dung
dịch mẹ pha trong dimethyl sulfoxid (DMSO)
Tiến hành song song với mẫu chứng DMSO có
nồng độ tương đương
Xác định tỷ lệ tế bào sống bằng test MTT:
[3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl
tetrazolium bromid)] (MTT) chuyển thành tinh
dehydrogenase (SDH) chỉ có trong ty thể tế bào
sống Formazan tan trong isopropanol tạo dung
dịch màu tím, đo OD ở 570 nm phản ánh số
lượng tế bào sống trong mẫu Tiến hành song
song với mẫu không xử lý và mẫu đối chứng
doxorubicin Lặp lại thí nghiệm 3 lần, 6 mẫu cho
1 điều kiện nuôi cấy (ứng với 1 nồng độ)
Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro
Phương pháp DPPH (9):
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do ổn định,
không tự kết hợp để tạo nhị phân tử Gốc tự do
có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi
Mẫu thử có hoạt tính chống oxy hóa làm giảm
màu của DPPH vì gốc tự do DPPH kết hợp với
một H của mẫu thử tạo thành DPPH dạng
nguyên tử Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu
thử tỷ lệ thuận với độ mất màu của DPPH xác
định bằng cách đo độ hấp thu OD ở bước sóng
517 nm Hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) được
tính theo công thức: HTCO (%) = [(ODchứng -
ODthử)/ ODchứng] × 100 Mẫu chứng (có DPPH, không có mẫu thử) và mẫu đối chiếu quercetin được tiến hành song song Xác định IC50 (nồng
độ có HTCO bằng 50%) của mẫu thử
Phương pháp định lượng MDA (9): Malonyl dialdehyd (MDA) sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid phản ứng với acid thiobarbituric tạo phức trimethin màu hồng có đỉnh hấp thu cực đại ở 532 nm, sử dụng quercitin làm chất đối chứng Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1 ml mẫu thử
ở các nồng độ khác nhau, 0,5 ml dịch đồng thể gan 10% (kl/tt), đệm phosphat 50 mM vừa đủ 2
ml Ủ hỗn hợp 15 phút ở 37˚C và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10% Ly tâm, lấy 1 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở 100˚C trong 15 phút Làm lạnh, đo OD ở 532 nm Thực hiện 3 lần, lấy giá trị trung bình Tính hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) theo công thức: HTCO% = [(ODchứng -
ODthử)/ODchứng] x 100, trong đó ODchứng và ODthử
lần lượt là độ hấp thu của mẫu chứng (không có mẫu thử) và mẫu thử Xác định IC50 (nồng độ có HTCO = 50%) của mẫu thử
Khảo sát độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng (3)
Cao cồn pha trong nước cất, cao flavonoid pha trong hỗn hợp gồm tween 80 5% (tt/tt) và nước cất
Cho chuột nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi cho uống 0,2 ml/10g cao Bán chi liên liều duy nhất hỗn dịch có nồng độ tối đa có thể qua kim Tiến hành song song với chuột chứng uống nước cất hoặc tween 5% (tt/tt) Theo dõi
và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu và
số lượng chuột chết trong 72 giờ Nếu chuột không có dấu hiệu bất thường hoặc chết, tiếp tục theo dõi trong 14 ngày Nếu có chuột chết, giảm liều, tìm liều tối thiểu gây chết 100% chuột (LD100), liều tối đa không gây chết chuột (LD0) và liều gây chết 50% chuột (LD50)
Trang 4Khảo sát tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan
trên chuột nhắt trắng (4,6)
Chia chuột ngẫu nhiên thành 9 lô (8 hoặc 10
chuột/lô): lô sinh lý và lô chứng bệnh: uống nước
cất; lô tween 5% và lô chứng bệnh + tween 5%: uống
tween 80 pha trong nước cất ở nồng độ 5% (tt/tt);
lô đối chiếu: uống silymarin 100 mg/kg; 2 lô cao
cồn: uống cao cồn liều 800 mg/kg và 1600 mg/kg;
2 lô cao flavonoid: uống cao flavonoid liều 80
mg/kg và 160 mg/kg
Thời gian cho uống hằng ngày trong
khoảng 8 - 10 giờ sáng, thể tích uống 0,1 ml/10
g, liên tục trong 14 ngày Vào ngày thứ 15,
chuột được tiêm phúc mô dầu oliu (lô sinh lý,
lô tween 5%) hoặc dung dịch CCl4 0,2% pha
trong dầu oliu (tt/tt) cho các lô còn lại, thể tích
tiêm 0,1 ml/10 g chuột Chuột được cho nhịn
đói qua đêm Vào ngày thứ 16 (24 giờ sau khi
tiêm phúc mô), mổ lấy máu tim xác định hoạt
tính ALT, AST bằng phương pháp đo động
học enzym tại Trung tâm xét nghiệm Medlatex
và tách gan để quan sát mô bệnh học (đại thể,
vi thể) cũng như định lượng MDA, GSH
Định lượng malonyl dialdehyd (MDA) và
glutathion (GSH) trong gan
Sau khi quan sát đại thể, một phần gan được
cố định trong formol 10% để nhuộm
hematoxylin-eosin (HE), phân tích vi thể; phần
gan còn lại được nghiền đồng thể trong dung
dịch KCl 1,15% theo tỉ lệ 1g:10 ml ở 0-4°C Lấy 2
ml dịch đồng thể, thêm 1 ml đệm Tris-HCl ủ
37°C trong 60 phút Thêm 1 ml acid tricloacetic
10%, ly tâm 15 phút 10000 vòng/phút ở 4°C Lấy
2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid
thiobarbituric 0,8% ở 100°C trong 15 phút, đo
OD ở 532 nm để định lượng MDA; hoặc lấy 1 ml
dịch trong cho phản ứng với 1,8 ml đệm
phosphat-EDTA và 0,2 ml thuốc thử, ủ ở nhiệt
độ phòng 3 phút, đo OD ở 412 nm để định lượng GSH Hàm lượng MDA và GSH (nmol/ml dịch đồng thể) được tính theo phương trình hồi quy của MDA hoặc GSH chuẩn
Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê
Kết quả được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel, trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM), đánh giá ý nghĩa thống kê bằng phép kiểm Kruskal-Wallis và Mann-Whitney trên phần mềm SPSS 20.0 Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khả năng độc tế bào
Kết quả khảo sát hoạt tính độc tế bào gan HepG2 của các cao Bán chi liên, luteonin, apigenin so với chất đối chiếu doxorubicin 10
μg/ml được trình bày trong Bảng 1 Cao
flavonoid nồng độ 65 và 125 μg/ml không làm thay đổi tỷ lệ tế bào sống Cao flavonoid ở nồng
độ 250, 500, 1000 μg/ml, apigenin 25, 40, 100 μM
và doxorubicin 10 μg/ml ức chế sự tăng trưởng
tế bào (p < 0,01); nồng độ càng cao sự ức chế càng mạnh Cao cồn ở nồng độ 65, 125, 250, 500,
1000 μg/ml, luteonin nồng độ 25, 100, 200, 400
μM và apigenin 400 μM kích thích sự tăng trưởng của tế bào HepG2 so với mẫu chứng tương ứng (p < 0,01) Như vậy, cao cồn ở nồng
độ 65 - 1000 μg/ml, cao flavonoid 65, 125 μg/ml
và luteonin ở nồng độ 25- 400 μM không thể hiện hoạt tính độc tế bào Do đó, chọn 3 mẫu thử này để khảo sát khả năng chống oxy hóa và bảo
vệ gan trong các thử nghiệm sau
Bảng 1: Hoạt tính độc tế bào gan HepG2 của các cao Bán chi liên, luteonin và apigenin sau 24 giờ
DMSO
mẫu chứng
Trang 5Lô Nồng độ OD trung bình ± SEM
Cao cồn toàn phần
Cao flavonoid
Luteolin
Apigenin
* p < 0,05 và ** p < 0,05 so với mẫu chứng tương ứng
Hoạt tính chống oxy hoá in vitro
Phương pháp DPPH: Thuốc thử DPPH là gốc
tự do có màu tím nhờ vào điện tử N không ghép
đôi, khi gặp chất chống oxy hoá có khả năng
nhường điện tử cho N thì màu tím mất đi Kết
quả cho thấy khi tác dụng với mẫu cao hoặc hoạt
chất nồng độ càng lớn, màu tím của DPPH càng
giảm Điều đó chứng tỏ các cao cồn, cao
flavonoid, luteolin từ Bán chi liên có hoạt tính
chống oxy hoá in vitro theo cơ chế bắt gốc tự do,
phản ứng với DPPH làm giảm màu của gốc tự
do này
Phương pháp định lượng MDA: Các gốc tự
do gây peroxy hóa lipid tạo sản phẩm MDA phản ứng với acid thiobarbituric cho phức trimethin màu hồng Mẫu thử có hoạt tính chống oxy hoá làm giảm lượng MDA sinh ra Kết quả cho thấy cao cồn, cao flavonoid, luteolin từ Bán chi liên có nồng độ càng lớn, độ hấp thu của dung dịch sản phẩm càng giảm Như vậy, các mẫu thử từ Bán chi liên có hoạt tính chống oxy
hoá in vitro, ức chế quá trình peroxy hóa lipid tế
bào Phương trình tuyến tính về hoạt tính chống oxy hoá theo nồng độ mẫu thử và IC50 được trình
bày trong Bảng 2
Bảng 2: Phương trình tuyến tính và giá trị IC 50 của mẫu thử và chất đối chứng quercetin
Phương pháp DPPH
Phương pháp định lượng MDA
Trang 6Kết quả thử nghiệm DPPH và MDA cho
thấy cao cồn, cao flavonoid, luteolin từ Bán chi
liên có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế bắt
gốc tự do, hạn chế quá trình peroxyd hóa lipid
Tác dụng này phù hợp với nghiên cứu trước đây
báo cáo dịch chiết cồn Bán chi liên có hoạt tính
chống oxy hóa với IC50 là 78,8 μg/ml(7) Báo cáo
cũng cho thấy chất barbatin B và scutebarbatin A
trong Bán chi liên thể hiện hoạt tính chống oxy
hóa cao với giá trị IC50 lần lượt là 10,42 và 2,8
μg/ml Trong đề tài này, cao cồn có hoạt tính
chống oxy hóa thấp hơn cao flavonoid và
luteonin
Độc tính cấp đường uống của cao cồn và
cao flavonoid từ Bán chi liên
Chuột chứng uống nước cất hoặc tween 80
nồng độ 5% (tt/tt) đều sống khỏe mạnh, ăn cám
viên, uống nước, tiêu tiểu, cử động bình thường
trong 72 giờ và trong 14 ngày
Ở liều tối đa có thể cho uống 20 g cao
cồn/kg, có 2/6 chuột chết và 4/6 chuột sống sau
72 giờ Ở liều 10 g cao/kg, không có chuột chết
Tiến hành với 4 liều 12, 14, 16 và 18 g/kg (6
chuột/liều) cho thấy ở các liều 12, 14 và 16 g/kg
không chuột nào chết Ở liều 18 g/kg, có 1/6
chuột chết và 5/6 chuột sống sau 72 giờ Kết
quả ở liều 17 g/kg tương tự liều 18 g/kg Với
cao flavonoid, khi cho uống 0,2 ml/10 g hỗn dịch nồng độ tối đa qua kim 122 mg cao/ml (tương đương liều 2,24 g/kg), tất cả 12 chuột đều sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bất thường trong 72 giờ cũng như trong 14 ngày Chuột chết trong thử nghiệm và sống sau 14 ngày được gây mê bằng đá CO2, mổ, quan sát cho thấy không có sự thay đổi về đại thể của các
cơ quan phổi, tim, gan, thận, hệ tiêu hóa
Như vậy, cao cồn có LD0 là 16 g cao/kg và cao flavonoid không có độc tính cấp đường uống
ở liều Dmax là 2,24 g cao/kg Từ đó, chọn khảo sát tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan trên chuột nhắt với liều của cao cồn là 800 mg/kg và 1600 mg/kg (1/20 và 1/10 LD0); cao flavonoid là 80 mg/kg và 160 mg/kg (nhỏ hơn 1/5 Dmax) do cao flavonoid có hiệu xuất chiết từ cao cồn là 10%
Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan in vivo
Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của cao Bán chi liên trên chuột nhắt gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid 0,2% (tt/tt) pha trong dầu
ô liu
Tác động trên hoạt tính men gan ALT, AST
Kết quả khảo sát hoạt tính men gan ALT,
AST được trình bày trong Bảng 3
Bảng 3: Chỉ số ALT và AST của các lô chuột thử nghiệm
## p < 0,01; ### p < 0,001 so với lô sinh lý/tween 5%; ***p < 0,001 so với lô chứng bệnh/chứng bệnh + tween 5%
@ p < 0,05; @@ p < 0,01 so lô cao cồn với lô đối chiếu silymarin
Hoạt tính ALT, AST khác biệt không có ý
nghĩa thống kê giữa lô sinh lý với lô tween 5%
hay giữa lô chứng bệnh với lô CCl4+ tween 5%;
chứng tỏ tween 5% không gây tổn thương gan
Ở lô chứng bệnh, ALT tăng gấp 7,5 lần và AST tăng gấp 3,1 lần so với lô sinh lý (p < 0,001) Chứng tỏ CCl4 0,2% (tt/tt) trong dầu ô liu đã gây tổn thương tế bào gan thành công làm phóng
Trang 7thích ALT, AST ra dịch ngoại bào, làm tăng nồng
độ trong máu
Hoạt tính ALT, AST ở chuột uống cao thử và
silymarin giảm có ý nghĩa thống kê so với lô
chứng bệnh hoặc lô chứng bệnh uống tween 5%
(p < 0,001) Cụ thể: ALT của lô silymarin liều 100
mg/kg làm giảm 6,6 lần, lô cao cồn liều 1600
mg/kg giảm 4,8 lần, liều 800 mg/kg giảm 4,4 lần
so với lô chứng bệnh; cao flavonoid liều 160
mg/kg giảm 6,5 lần, liều 80 mg/kg giảm 6,0 lần so
với lô CCl4 + tween 5% Tương tự, với AST,
silymarin 100 mg/kg làm giảm 4,0 lần, cao cồn
liều 1600 mg/kg và 800 mg/kg đều làm giảm 2,9
lần; cao flavonoid liều 160 mg/kg giảm 2,0 lần,
liều 80 mg/kg giảm 2,4 lần Như vây, cao cồn Bán chi liên giảm hoạt tính ALT kém hơn còn cao flavonoid làm giảm hoạt tính ALT tương đương silymarin giúp các chỉ số này trở về gần mức của chuột sinh lý
Tác động trên hàm lượng MDA, GSH trong gan
Dựa vào phương trình tuyến tính của MDA chuẩn y = 0,09x + 0,092 (R2: 0,983); GSH chuẩn
y = 0,003x + 0,049 (R2: 0,990), hàm lượng MDA, GSH của chuột được xác định và trình bày ở
Bảng 4
Bảng 4: Hàm lượng MDA, GSH trong gan chuột của các lô thử nghiệm
## p < 0,01; ### p < 0,001 so với lô sinh lý/tween 5% ***p < 0,001 so với lô chứng bệnh/chứng bệnh + tween 5%
@ p < 0,05; @@ p < 0,01 so lô cao cồn với lô đối chiếu silymarin
Kết quả cho thấy lượng MDA, GSH khác biệt
không có ý nghĩa thống kê giữa lô sinh lý với lô
tween 5% cũng như giữa lô chứng bệnh với lô
chứng bệnh + tween 5% Điều đó chứng tỏ uống
tween 5% không ảnh hưởng đến hàm lượng
MDA, GSH trong gan Khi tiêm CCl4 0,2%, ở lô
chứng bệnh lượng MDA tăng gấp 1,5 lần; GSH
giảm gấp 1,5 lần so với lô sinh lý (p < 0,001) Như
vậy, CCl4 đã gây tổn thương tế bào gan làm tăng
sinh các gốc oxy tự do
Ở các lô cao thử và silymarin, hàm lượng
MDA thấp hơn và lượng GSH trong gan cao hơn
có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh hoặc lô
chứng bệnh uống tween 5% (p < 0,001) Cao cồn
và cao flavonoid đều làm giảm hàm lượng MDA
khoảng 1,6 lần so với lô chứng bệnh hoặc lô
chứng bệnh uống tween 5% trong khi lô
silymarin làm giảm khoảng 1,4 lần Đối với hàm
lượng GSH, cao flavonoid làm tăng 1,6 lần, cao cồn làm tăng 1,2-1,3 trong khi silymarin làm tăng 1,1 lần Điều này bước đầu cho thấy cao flavonoid có khả năng chống oxy hóa, bảo vệ gan tốt hơn silymarin
Về đại thể, tất cả gan chuột sinh lý hoặc chuột uống tween 5% có màu đỏ, mặt nhẵn, mật
độ mềm, không phù nề, không sung huyết Chuột ở lô chứng bệnh và lô chứng bệnh uống tween 5%, gan nhạt màu, phù nề, sung huyết, bề mặt có chỗ bạc màu hoặc không trơn láng, có chấm xuất huyết hoặc chấm trắng nhô lên Chuột uống cao toàn phần và cao flavonoid Bán chi liên, silymarin, có gan màu đỏ, bề mặt nhẵn, không phù nề, không sung huyết
Cao cồn 50% và cao flavonoid Bán chi liên làm giảm tổn thương gan trên vi thể ở chuột gây viêm gan bằng CCl4 (Hình 1) Kết quả vi thể
Trang 8ngẫu nhiên 6 mẫu gan mỗi lô được trình bày trong Bảng 5
Nhu mô gan bình thường Tĩnh mạch trung tâm bình thường Khoảng cửa bình thường
Hoại tử trong tiểu thùy Hoại tử quanh khoảng cửa Viêm quanh khoảng cửa
Hình 1: Hình ảnh vi thể tế bào gan chuột (nhuộm HE)
Bảng 5: Kết quả phân tích vi thể tế bào gan của các lô chuột thử nghiệm
2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy) Tween 5%
3/6 mẫu bình thường 2/6 viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy)
1/6 rải rác có vài ổ bị vôi hóa, hoại tử trong tiểu thùy Chứng bệnh
2/6 mẫu bình thường 4/6 mẫu viêm gan (hoạt tử và thoái hóa tĩnh mạch trung tâm, viêm gan cấp tính áp xe hóa trên nền
viêm gan tối thiểu)
Silymarin
100 mg/kg
4/6 mẫu bình thường 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy) Cao cồn
1600 mg/kg
3/6 mẫu bình thường 3/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy) Cao cồn
800 mg/kg
2/6 mẫu bình thường 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu 2/6 viêm gan (hoại tử và thoái hóa ở quanh tĩnh mạch trung tâm) Cao flavonoid
160 mg/kg
4/6 mẫu bình thường 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy) Cao flavonoid
80 mg/kg
4/6 mẫu bình thường 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy) Như vậy, cao cồn, cao flavonoid của Bán chi
liên trong đề tài này đã cho tác động chống oxy
hóa, bảo vệ gan hiệu quả Kết quả làm giảm tình
trạng tăng hoạt tính ALT, AST huyết tương và
lượng MDA sinh ra trong gan, làm tăng lượng
GSH gan trở phù hợp với những quan sát đại thể
và phân tích vi thể cấu trúc tế bào gan của chuột
ở các lô thử nghiệm Điều này hoàn toàn phù hợp với báo cáo trước đây về tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của Bán chi liên(5) Về cơ chế, tác động này của các cao Bán chi liên có thể giải thích do trong thành phần hoạt chất có hàm lượng lớn các flavonoid, nhóm chất có khả năng chống oxy hóa mạnh, theo nhiều cơ chế khác
Trang 9nhau như đánh bắt gốc tự do trực tiếp, thông
qua oxid nitric sau đó đánh bắt oxid nitric, ức
chế hoạt động của xanthin oxidase, giảm bạch
cầu bám dính, ảnh hưởng đến những enzym
khác… (8,10)
KẾT LUẬN
Cao Bán chi liên không có độc tính cấp
đường uống ở liều tối đa Dmax là 25,68 g cao/kg
tương đương 51,37 g nấm khô/kg Uống cao với
liều 5 g/kg trong 7 ngày cho tác động chống oxy
hóa, bảo vệ gan hiệu quả giúp phòng ngừa
những tổn thương do CCl4 0,2% (v/v) gây ra trên
chuột nhắt trắng tương đương đối chứng
silymarin
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Dai ZJ, Gao J (2011) In Vitro and In Vivo Antitumor Activity
of Scutellaria barbata Extract on Murine Liver Cancer,
Molecules, 16: 4389-4400
2 Dai ZJ, Lu WF (2013) Protective Effects of Scutellaria barbata
Against Rat Liver Tumorigenesis, Asian Pacific J Cancer Prev,
14(1): 261-265
3 Đỗ Trung Đàm (2014) Phương pháp xác định độc tính cấp
của thuốc, NXB Y học - Hà Nội
4 Đoàn Thị Nhu, Đỗ Trung Đàm, Phạm Duy Mai, Nguyễn
Thượng Dong, Nguyễn Thị Thu Hương Phương pháp
nghiên cứu tác động dược lý của thuốc từ dược thảo, NXB
Khoa Học và Kỹ Thuật, 2006, tr.279-294
5 Lin CC, Shieh DE (1997) Hepatoprotective effect of the fractions of Ban-zhi-lian on experimental liver injuries in
rats, Journal of Ethnopharmacology, 56, 193 - 200
6 Nguyễn Bảo Trân, Trần Quang Vinh, Nguyễn Ngọc Khôi (2011) Tác dụng chống oxy hoá và bảo vệ gan của lá cây
chùm ngây (Moringa oleifera Lam Moringaceae), Tạp chí
Dược học, 421: 25-29
7 Nguyễn Văn Hùng, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai Hương, Trịnh Thị Thanh Vân, Nguyễn Thị Thu Hà, Đỗ Thị Thảo, Trần Văn Hiệu (2009) Nghiên cứu thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học cây Bán chi liên Scutellaria barbata D.Don Tạp chí Hóa học, 47(6): 192-198
8 Pietta PG (2000) Flavonoids as antioxidants J Nat Prod.,
63(7): 1035-42
9 Prio RL, Wu X, Schaich K (2005) Standardized methods for the determination of antioxydant capacity and phenolics in
food and dietary supplement, J Agric Food Chem., 55: 2698A
- J
10 Robert JN, Elsvan N (2001) Flavonoids: a review of probable
mechanisms of action and potential applications Am J Clin
Nutr, 74: 418-25
11 Viện dược liệu (2004) Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tập I, tr 172-173
12 Yoichi S, Shiho S (2000) Phytochemical flavones isolated
from Scutellaria barbata and antibacterial activity against
methicillin resistant Staphylococcus Journal of Ethnopharmacology, 72: 483-488
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/11/2015