Cao toàn phần, các dịch chiết nước, alkaloid, flavonoid… hay các chất phân lập được từ Bán chi liên (Scutelaria barbata D. Don) được báo cáo có hoạt tính kháng ung thư trực tràng, u xơ tử cung, ung thư gan, tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn... Bài viết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của Bán chi liên (Scutelaria barbata D. Don).
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA, BẢO VỆ GAN CỦA BÁN CHI LIÊN (Scutelaria barbata D Don) Nguyễn Thị Linh Ngân*, Ngơ Thanh Diệp*, Đỗ Thị Hồng Tươi* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Cao toàn phần, dịch chiết nước, alkaloid, flavonoid… hay chất phân lập từ Bán chi liên (Scutelaria barbata D Don) báo cáo có hoạt tính kháng ung thư trực tràng, u xơ tử cung, ung thư gan, tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn Mục tiêu: khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan Bán chi liên (Scutelaria barbata D Don) Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Mẫu thử cao cồn 50%, cao flavonoid, apigenin, luteonin từ Bán chi liên Đánh giá hoạt tính độc tế bào gan HepG2 test MTT Khảo sát hoạt tính chống oxy hố in vitro phương pháp DPPH định lượng MDA gan; độc tính cấp đường uống chuột đực cái, theo dõi tỷ lệ chết 72 Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan in vitro khảo sát chuột nhắt gây viêm gan CCl4 vào ngày 15 sau cho chuột uống cao thuốc đối chiếu silymarin 14 ngày liên tiếp Ngày 16, xác định hoạt tính ALT, AST hàm lượng MDA, GSH gan; quan sát đại thể vi thể gan Kết quả: Cao cồn 50%, cao flavonoid luteonin không độc tế bào gan HepG2 apigenin ức chế tăng trưởng tế bào Cao cồn 50%, cao flavonoid luteonin có hoạt tính chống oxy hóa in vitro với IC50 110,78; 29,82; 58,03 μg/ml phương pháp DPPH 25,61; 19,88; 10,16 μg/ml phương pháp MDA Liều tối đa cao cồn 50% không gây chết chuột LD0 16 g cao/kg; cao flavonoid khơng có độc tính cấp đường uống liều tối đa Dmax 2,24 g/kg Các cao từ Bán chi liên giúp giảm tổn thương gan CCl4 qua giảm hoạt tính AST, ALT lượng MDA; tăng lượng GSH, cải thiện mức độ viêm gan phân tích mơ bệnh học Tác dụng cao cồn tương tự silymarin cao flavonoid chống oxy hóa, bảo vệ gan tốt Kết luận: Cao cồn 50% cao flavonoid từ Bán chi liên có tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan cấp độ in vitro in vivo Tác dụng hoạt tính chống oxy hóa luteolin dược liệu Từ khóa: Bán chi liên, tế bào HepG2, độc tính cấp, chống oxy hóa, bảo vệ gan ABSTRACT STUDY ON ANTIOXIDANT AND HEPATOPROTECTIVE EFFECTS OF SCUTELARIA BARBATA D DON Nguyen Thi Linh Ngan, Ngo Thi Thanh Diep, Do Thi Hong Tuoi * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 195 - 203 Introduction - Objectives: Alcoholic, flavonoids, alkaloids extracts and some substances isolated from Scutelaria barbata D Don have been reported about their activity against colorectal cancer, liver cancer as well as antioxidant, anti-inflammatory and antibacterial effects The aim of this work was to study on antioxidant and hepatoprotective effects of S barbata D Don Methods: 50% alcoholic and flavonoids extracts; apigenin, luteonin were assessed cytotoxicity in HepG2 cells by MTT test, in vitro antioxidant activity by DPPH and MDA methods Oral acute toxicity in *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Đỗ Thị Hồng Tươi ĐT: 0908683080 Chuyên Đề Dược Email: hongtuoid99@gmail.com 195 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 mice was studied on death rate within 72 hours after being dosed Hepatoprotective effects were evaluated against CCl4 induced hepatitis Mice were pre-treated orally with extracts or silymarnin for 14 days followed by a single dose of CCl4 on 15th day On day 16, liver enzymes AST, ALT activities were estimated in serum Glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) levels in liver homogenate were determined Liver histopathological changes were also studied Results: 50% alcoholic and flavonoids extracts, luteonin had no cytotoxicity in HepG2 cells while apigenin inhibited cells growth Two extracts and luteonin had in vitro antioxidant activity with respective IC50 of 110.78; 29.82; 58.03 μg/ml in DPPH method; 25.61; 19.88; 10.16 μg/ml in MDA assay Minimum lethal dose of alcoholic extract was 16 g/kg while flavonoid one had no oral acute toxicity at Dmax of 2.24 g/kg Two these extracts attenuated liver damage due to CCl4 administration as indicated by significant reduction in elevated levels of ALT, AST and MDA; increase in GSH content; improvement of hepatitis level in histopathological analysis These effects of alcoholic extract were similar to that of silymarin while flavonoid extract exhibited better hepatoprotection Conclusion: Alcoholic and flavonoid extracts of S barbata D Don had antioxidant and hepatoprotective effects in vitro as well as in vivo This effect may be due to antioxidant activity of luteonin present in the medicinal plant Key words: Scutelaria barbata D Don, HepG2 cells, acute toxicity, antioxidant, hepatoprotective effect khuẩn (1,2,5,12) Hiện nay, Việt Nam có ĐẶT VẤN ĐỀ nghiên cứu thành phần hóa học, khả Gan quan lớn, thực nhiều kháng lại NF-kB Bán chi liên chưa chức đặc biệt thể Do gan vị trí cửa có nghiên cứu hay chứng minh tác dụng ngõ, dễ bị ảnh hưởng chất độc nên bệnh chống oxy hóa cao tồn phần, cao gan đa dạng, phức tạp ngày gia tăng gây flavonoid, số chất phân lập từ dược liệu ảnh hưởng đến sức khỏe người Xu apigenin, luteolin(7) Từ sở hướng phát triển, sử dụng thuốc từ trên, nhóm nghiên cứu thực đề tài “Khảo dược liệu giúp bảo vệ gan, kiểm sốt điều trị sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan kịp thời nhờ ưu điểm sử dụng lâu dài, Bán chi liên (Scutelaria barbata D Don)” tính an tồn cao Bán chi liên (Scutellaria barbata D.Don), họ Lamiaceae dùng y học cổ truyền nhờ có vị đắng, tính mát, tác dụng nhiệt giải độc, lợi tiểu, tiêu sưng, giảm đau(11) Từ xưa, Bán chi liên dùng chữa đinh nhọt, viêm gan viêm vú, viêm mủ da, sâu quảng, rắn độc cắn, bệnh phụ khoa(11) Bán chi liên có thuốc chữa ung thư phổi, gan, trực tràng giai đoạn đầu Một số nghiên cứu giới báo cáo cao toàn phần, dịch chiết khác nước, alkaloid, flavonoid… hay chất phân lập từ Bán chi liên apigenin, scutellanin, luteolin… có hoạt tính kháng ung thư trực tràng, u xơ tử cung, ung thư gan, tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm, kháng 196 VẬTLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Cao dược liệu: cao cồn 50% toàn phần, cao flavonoid, apigenin, luteonin từ Bán chi liên kiểm nghiệm, cung cấp BM Hóa phân tích-Kiểm nghiệm, Khoa Dược, ĐH Y Dược Tp HCM Hóa chất: DPPH, quercetin, MDA chuẩn, GSH chuẩn (Sigma-Aldrich, Mỹ), methanol, acid thiobarbituric (Merck, Đức), silymarin (Madaus, Đức), formalin (Trung Quốc) Các loại hóa chất sử dụng đạt tiêu chuẩn độ tinh khiết phân tích PA (Pure for analysis) Động vật nghiên cứu: Chuột nhắt Swiss albino, 6-7 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 2225 g, Viện Vaccin Sinh phẩm Y tế Nha Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Trang cung cấp Chuột đực cái, khoẻ mạnh, khơng có biểu bất thường, ni ổn định mơi trường thí nghiệm - ngày Chuột ni lồng kích thước 25x35x15 cm (6 chuột/lồng) cung cấp thức ăn, nước uống đầy đủ thử nghiệm Phương pháp nghiên cứu Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư gan HepG2 (1) Tế bào HepG2 (2,5 × 104/cm2) ni cấy mơi trường EMEM, bổ sung 10% huyết thai bò, mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 μg/ml streptomycin đĩa 96 giếng, ủ 37°C, 5% CO2 Sau 18 giờ, xử lý tế bào với mẫu thử nồng độ khác đối chứng doxorubicin 24 Ủ 37oC, 5% CO2, thực test MTT xác định tỷ lệ tế bào sống Dung dịch mẹ pha dimethyl sulfoxid (DMSO) Tiến hành song song với mẫu chứng DMSO có nồng độ tương đương Xác định tỷ lệ tế bào sống test MTT: [3(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)] (MTT) chuyển thành tinh thể formazan nhờ enzym succinat dehydrogenase (SDH) có ty thể tế bào sống Formazan tan isopropanol tạo dung dịch màu tím, đo OD 570 nm phản ánh số lượng tế bào sống mẫu Tiến hành song song với mẫu không xử lý mẫu đối chứng doxorubicin Lặp lại thí nghiệm lần, mẫu cho điều kiện nuôi cấy (ứng với nồng độ) Khảo sát hoạt tính chống oxy hố in vitro Phương pháp DPPH(9): 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) gốc tự ổn định, không tự kết hợp để tạo nhị phân tử Gốc tự có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đơi Mẫu thử có hoạt tính chống oxy hóa làm giảm màu DPPH gốc tự DPPH kết hợp với H mẫu thử tạo thành DPPH dạng nguyên tử Hoạt tính chống oxy hóa mẫu thử tỷ lệ thuận với độ màu DPPH xác định cách đo độ hấp thu OD bước sóng 517 nm Hoạt tính chống oxy hố (HTCO) Chun Đề Dược Nghiên cứu Y học tính theo cơng thức: HTCO (%) = [(ODchứng ODthử)/ ODchứng] × 100 Mẫu chứng (có DPPH, khơng có mẫu thử) mẫu đối chiếu quercetin tiến hành song song Xác định IC50 (nồng độ có HTCO 50%) mẫu thử Phương pháp định lượng MDA(9): Malonyl dialdehyd (MDA) sinh q trình peroxy hóa lipid phản ứng với acid thiobarbituric tạo phức trimethin màu hồng có đỉnh hấp thu cực đại 532 nm, sử dụng quercitin làm chất đối chứng Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1 ml mẫu thử nồng độ khác nhau, 0,5 ml dịch đồng thể gan 10% (kl/tt), đệm phosphat 50 mM vừa đủ ml Ủ hỗn hợp 15 phút 37˚C dừng phản ứng ml acid tricloacetic 10% Ly tâm, lấy ml dịch cho phản ứng với ml acid thiobarbituric 0,8% 100˚C 15 phút Làm lạnh, đo OD 532 nm Thực lần, lấy giá trị trung bình Tính hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) theo cơng thức: HTCO% = [(ODchứng ODthử)/ODchứng] x 100, ODchứng ODthử độ hấp thu mẫu chứng (khơng có mẫu thử) mẫu thử Xác định IC50 (nồng độ có HTCO = 50%) mẫu thử Khảo sát độc tính cấp đường uống chuột nhắt trắng (3) Cao cồn pha nước cất, cao flavonoid pha hỗn hợp gồm tween 80 5% (tt/tt) nước cất Cho chuột nhịn đói 12 trước cho uống 0,2 ml/10g cao Bán chi liên liều hỗn dịch có nồng độ tối đa qua kim Tiến hành song song với chuột chứng uống nước cất tween 5% (tt/tt) Theo dõi ghi nhận cử động tổng quát, biểu hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu số lượng chuột chết 72 Nếu chuột khơng có dấu hiệu bất thường chết, tiếp tục theo dõi 14 ngày Nếu có chuột chết, giảm liều, tìm liều tối thiểu gây chết 100% chuột (LD100), liều tối đa không gây chết chuột (LD0) liều gây chết 50% chuột (LD50) 197 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Khảo sát tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan chuột nhắt trắng (4,6) Chia chuột ngẫu nhiên thành lô (8 10 chuột/lô): lô sinh lý lô chứng bệnh: uống nước cất; lô tween 5% lô chứng bệnh + tween 5%: uống tween 80 pha nước cất nồng độ 5% (tt/tt); lô đối chiếu: uống silymarin 100 mg/kg; lô cao cồn: uống cao cồn liều 800 mg/kg 1600 mg/kg; lô cao flavonoid: uống cao flavonoid liều 80 mg/kg 160 mg/kg Thời gian cho uống ngày khoảng - 10 sáng, thể tích uống 0,1 ml/10 g, liên tục 14 ngày Vào ngày thứ 15, chuột tiêm phúc mô dầu oliu (lô sinh lý, lô tween 5%) dung dịch CCl4 0,2% pha dầu oliu (tt/tt) cho lơ lại, thể tích tiêm 0,1 ml/10 g chuột Chuột cho nhịn đói qua đêm Vào ngày thứ 16 (24 sau tiêm phúc mô), mổ lấy máu tim xác định hoạt tính ALT, AST phương pháp đo động học enzym Trung tâm xét nghiệm Medlatex tách gan để quan sát mô bệnh học (đại thể, vi thể) định lượng MDA, GSH phosphat-EDTA 0,2 ml thuốc thử, ủ nhiệt độ phòng phút, đo OD 412 nm để định lượng GSH Hàm lượng MDA GSH (nmol/ml dịch đồng thể) tính theo phương trình hồi quy MDA GSH chuẩn Phân tích kết xử lý số liệu thống kê Kết xử lý phần mềm Microsoft Excel, trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn giá trị trung bình (Mean ± SEM), đánh giá ý nghĩa thống kê phép kiểm Kruskal-Wallis MannWhitney phần mềm SPSS 20.0 Sự khác biệt có ý nghĩa p < 0,05 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khả độc tế bào Kết khảo sát hoạt tính độc tế bào gan HepG2 cao Bán chi liên, luteonin, apigenin so với chất đối chiếu doxorubicin 10 μg/ml trình bày Bảng Cao flavonoid nồng độ 65 125 μg/ml không làm thay đổi tỷ lệ tế bào sống Cao flavonoid nồng độ 250, 500, 1000 μg/ml, apigenin 25, 40, 100 μM doxorubicin 10 μg/ml ức chế tăng trưởng tế bào (p < 0,01); nồng độ cao ức chế mạnh Cao cồn nồng độ 65, 125, 250, 500, 1000 μg/ml, luteonin nồng độ 25, 100, 200, 400 μM apigenin 400 μM kích thích tăng trưởng tế bào HepG2 so với mẫu chứng tương ứng (p < 0,01) Như vậy, cao cồn nồng độ 65 - 1000 μg/ml, cao flavonoid 65, 125 μg/ml luteonin nồng độ 25- 400 μM khơng thể hoạt tính độc tế bào Do đó, chọn mẫu thử để khảo sát khả chống oxy hóa bảo vệ gan thử nghiệm sau Định lượng malonyl dialdehyd (MDA) glutathion (GSH) gan Sau quan sát đại thể, phần gan cố định formol 10% để nhuộm hematoxylin-eosin (HE), phân tích vi thể; phần gan lại nghiền đồng thể dung dịch KCl 1,15% theo tỉ lệ 1g:10 ml 0-4°C Lấy ml dịch đồng thể, thêm ml đệm Tris-HCl ủ 37°C 60 phút Thêm ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 15 phút 10000 vòng/phút 4°C Lấy ml dịch cho phản ứng với ml acid thiobarbituric 0,8% 100°C 15 phút, đo OD 532 nm để định lượng MDA; lấy ml dịch cho phản ứng với 1,8 ml đệm Bảng 1: Hoạt tính độc tế bào gan HepG2 cao Bán chi liên, luteonin apigenin sau 24 Lô DMSO 198 Nồng độ 0,25% 0,5% 1% OD trung bình ± SEM 0,212 ± 0,005 Mẫu chứng 0,197 ± 0,005 0,181 ± 0,001 % tăng số lượng tế bào sống so với mẫu chứng Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Lơ Cao cồn tồn phần Cao flavonoid Luteolin Apigenin Doxorubicin Nồng độ 65 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml 1000 µg/ml 65 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml 1000 µg/ml 25 µM 50 µM 100 µM 200 µM 400 µM 25 µM 50 µM 100 µM 200 µM 400 µM 10 µg/ml Nghiên cứu Y học OD trung bình ± SEM 0,243 ± 0,007** 0,212 0,252 ± 0,015* 0,212 0,236 ± 0,011 0,212 0,233 ± 0,004** 0,197 0,208 ± 0,009** 0,181 0,216 ± 0,005 0,212 0,226 ± 0,005 0,212 0,181 ± 0,001** 0,212 0,155 ± 0,005** 0,197 0,127 ± 0,002** 0,181 0,236 ± 0,003** 0,212 0,235 ± 0,009 0,212 0,230 ± 0,003* 0,212 0,224 ± 0,004** 0,197 0,206 ± 0,004** 0,181 0,175 ± 0,003** 0,212 0,167 ± 0,005** 0,212 0,191 ± 0,007* 0,212 0,182 ± 0,011 0,197 0,199 ± 0,020 0,181 0,151 ± 0,002** 0,212 * p < 0,05 ** p < 0,05 so với mẫu chứng tương ứng Hoạt tính chống oxy hoá in vitro Phương pháp DPPH: Thuốc thử DPPH gốc tự có màu tím nhờ vào điện tử N khơng ghép đơi, gặp chất chống oxy hố có khả nhường điện tử cho N màu tím Kết cho thấy tác dụng với mẫu cao hoạt chất nồng độ lớn, màu tím DPPH giảm Điều chứng tỏ cao cồn, cao flavonoid, luteolin từ Bán chi liên có hoạt tính chống oxy hố in vitro theo chế bắt gốc tự do, phản ứng với DPPH làm giảm màu gốc tự 14,60 18,84 11,30 18,37 15,13 1,57 6,28 -14,85 -21,37 -29,50 11,30 10,83 8,16 13,63 13,84 -17,74 -21,27 -10,05 -7,37 10,15 -28,73 Phương pháp định lượng MDA: Các gốc tự gây peroxy hóa lipid tạo sản phẩm MDA phản ứng với acid thiobarbituric cho phức trimethin màu hồng Mẫu thử có hoạt tính chống oxy hoá làm giảm lượng MDA sinh Kết cho thấy cao cồn, cao flavonoid, luteolin từ Bán chi liên có nồng độ lớn, độ hấp thu dung dịch sản phẩm giảm Như vậy, mẫu thử từ Bán chi liên có hoạt tính chống oxy hố in vitro, ức chế q trình peroxy hóa lipid tế bào Phương trình tuyến tính hoạt tính chống oxy hoá theo nồng độ mẫu thử IC50 trình bày Bảng Bảng 2: Phương trình tuyến tính giá trị IC50 mẫu thử chất đối chứng quercetin Mẫu thử Cao cồn toàn phần Cao flavonoid Luteolin Quercetin Cao cồn toàn phần Cao flavonoid Luteolin Quercetin Chun Đề Dược Phương trình tuyến tính Giá trị R Phương pháp DPPH y = 0,344x + 11,89 0,991 y = 1,469x + 6,19 0,975 y = 1,699x + 16,22 0,979 y = 8,544x – 4,66 0,978 Phương pháp định lượng MDA y = 0,297x + 17,23 0,986 y = 1,699x + 16,22 0,979 y = 1,699x + 16,22 0,979 y = 2,920x - 20,32 0,958 Giá trị IC50 (μg/ml) 110,78 29,82 58,03 6,38 25,61 19,88 10,16 25,61 199 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Kết thử nghiệm DPPH MDA cho thấy cao cồn, cao flavonoid, luteolin từ Bán chi liên có tác dụng chống oxy hóa theo chế bắt gốc tự do, hạn chế q trình peroxyd hóa lipid Tác dụng phù hợp với nghiên cứu trước báo cáo dịch chiết cồn Bán chi liên có hoạt tính chống oxy hóa với IC50 78,8 μg/ml(7) Báo cáo cho thấy chất barbatin B scutebarbatin A Bán chi liên thể hoạt tính chống oxy hóa cao với giá trị IC50 10,42 2,8 μg/ml Trong đề tài này, cao cồn có hoạt tính chống oxy hóa thấp cao flavonoid luteonin Độc tính cấp đường uống cao cồn cao flavonoid từ Bán chi liên Chuột chứng uống nước cất tween 80 nồng độ 5% (tt/tt) sống khỏe mạnh, ăn cám viên, uống nước, tiêu tiểu, cử động bình thường 72 14 ngày Ở liều tối đa cho uống 20 g cao cồn/kg, có 2/6 chuột chết 4/6 chuột sống sau 72 Ở liều 10 g cao/kg, khơng có chuột chết Tiến hành với liều 12, 14, 16 18 g/kg (6 chuột/liều) cho thấy liều 12, 14 16 g/kg không chuột chết Ở liều 18 g/kg, có 1/6 chuột chết 5/6 chuột sống sau 72 Kết liều 17 g/kg tương tự liều 18 g/kg Với cao flavonoid, cho uống 0,2 ml/10 g hỗn dịch nồng độ tối đa qua kim 122 mg cao/ml (tương đương liều 2,24 g/kg), tất 12 chuột sống khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu bất thường 72 14 ngày Chuột chết thử nghiệm sống sau 14 ngày gây mê đá CO2, mổ, quan sát cho thấy khơng có thay đổi đại thể quan phổi, tim, gan, thận, hệ tiêu hóa Như vậy, cao cồn có LD0 16 g cao/kg cao flavonoid khơng có độc tính cấp đường uống liều Dmax 2,24 g cao/kg Từ đó, chọn khảo sát tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan chuột nhắt với liều cao cồn 800 mg/kg 1600 mg/kg (1/20 1/10 LD0); cao flavonoid 80 mg/kg 160 mg/kg (nhỏ 1/5 Dmax) cao flavonoid có hiệu xuất chiết từ cao cồn 10% Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan in vivo Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan cao Bán chi liên chuột nhắt gây tổn thương gan carbon tetraclorid 0,2% (tt/tt) pha dầu liu Tác động hoạt tính men gan ALT, AST Kết khảo sát hoạt tính men gan ALT, AST trình bày Bảng Bảng 3: Chỉ số ALT AST lô chuột thử nghiệm Lô Sinh lý Tween 5% Chứng bệnh Chứng bệnh + tween 5% Đối chiếu silymarin 100 mg/kg Cao cồn 1600 mg/kg Cao cồn 800 mg/kg Cao flavonoid 160 mg/kg Cao flavonoid 80 mg/kg ## Số chuột 10 10 10 10 10 10 10 p < 0,01; ###p < 0,001 so với lô sinh lý/tween 5%; @ p < 0,05; @@ ALT (U/L) 52 ± 5,0 62,4 ± 3,8 ### 392,2 ± 41,5 ### 426,5 ± 43,6 59,8 ± 5,0*** ##@ 81,3 ± 5,7*** ##@@ 90,1 ± 8,7*** 65,6 ± 5,3*** 71,5 ± 5,9*** ***p < 0,001 so với lô chứng bệnh/chứng bệnh + tween 5% p < 0,01 so lô cao cồn với lô đối chiếu silymarin Hoạt tính ALT, AST khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê lô sinh lý với lô tween 5% hay lô chứng bệnh với lô CCl4+ tween 5%; chứng tỏ tween 5% không gây tổn thương gan 200 AST (U/L) 196,8 ± 19,9 200,5 ± 24,5 ### 610,1 ± 96,7 ### 503,7 ± 34,4 152,9 ± 11,8*** @ 211,6 ± 20,7*** 216,0 ± 21,7*** 243,7 ± 22,9*** 207,3 ± 25,6*** Ở lô chứng bệnh, ALT tăng gấp 7,5 lần AST tăng gấp 3,1 lần so với lô sinh lý (p < 0,001) Chứng tỏ CCl4 0,2% (tt/tt) dầu ô liu gây tổn thương tế bào gan thành cơng làm phóng Chun Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 thích ALT, AST dịch ngoại bào, làm tăng nồng độ máu Nghiên cứu Y học liều 80 mg/kg giảm 2,4 lần Như vây, cao cồn Bán chi liên giảm hoạt tính ALT cao flavonoid làm giảm hoạt tính ALT tương đương silymarin giúp số trở gần mức chuột sinh lý Hoạt tính ALT, AST chuột uống cao thử silymarin giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lô chứng bệnh uống tween 5% (p < 0,001) Cụ thể: ALT lô silymarin liều 100 mg/kg làm giảm 6,6 lần, lô cao cồn liều 1600 mg/kg giảm 4,8 lần, liều 800 mg/kg giảm 4,4 lần so với lô chứng bệnh; cao flavonoid liều 160 mg/kg giảm 6,5 lần, liều 80 mg/kg giảm 6,0 lần so với lô CCl4 + tween 5% Tương tự, với AST, silymarin 100 mg/kg làm giảm 4,0 lần, cao cồn liều 1600 mg/kg 800 mg/kg làm giảm 2,9 lần; cao flavonoid liều 160 mg/kg giảm 2,0 lần, Tác động hàm lượng MDA, GSH gan Dựa vào phương trình tuyến tính MDA chuẩn y = 0,09x + 0,092 (R2: 0,983); GSH chuẩn y = 0,003x + 0,049 (R2: 0,990), hàm lượng MDA, GSH chuột xác định trình bày Bảng Bảng 4: Hàm lượng MDA, GSH gan chuột lô thử nghiệm Lô Sinh lý Tween 5% Chứng bệnh Chứng bệnh + tween 5% Đối chiếu silymarin 100 mg/kg Cao cồn 1600 mg/kg Cao cồn 800 mg/kg Cao flavonoid 160 mg/kg Cao flavonoid 80 mg/kg ## Số chuột 10 10 10 10 10 10 10 p < 0,01; ###p < 0,001 so với lô sinh lý/tween 5% @ p < 0,05; @@ MDA (nmol/g protein) 182,9 ± 8,1 163,3 ± 9,6 ### 271,6 ± 16,4 ### 257,6 ± 6,7 192,2 ± 8,1*** 171,9 ± 8,3*** 183,6 ± 9,5*** 157,1 ± 7,0*** 152,5 ± 6,5*** GSH (nmol/g protein) 732,5 ± 27,3 664,3 ± 23,7 ### 488,7 ± 35,2 ### 409,5 ± 11,0 ***### 555,1 ± 29,3 **@ 650,3 ± 34,9 **## 590,6 ± 31,8 *** 674,2 ± 26,6 ** 655,2 ± 32,5 ***p < 0,001 so với lô chứng bệnh/chứng bệnh + tween 5% p < 0,01 so lô cao cồn với lô đối chiếu silymarin Kết cho thấy lượng MDA, GSH khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê lơ sinh lý với lô tween 5% lô chứng bệnh với lơ chứng bệnh + tween 5% Điều chứng tỏ uống tween 5% không ảnh hưởng đến hàm lượng MDA, GSH gan Khi tiêm CCl4 0,2%, lô chứng bệnh lượng MDA tăng gấp 1,5 lần; GSH giảm gấp 1,5 lần so với lô sinh lý (p < 0,001) Như vậy, CCl4 gây tổn thương tế bào gan làm tăng sinh gốc oxy tự Ở lô cao thử silymarin, hàm lượng MDA thấp lượng GSH gan cao có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lô chứng bệnh uống tween 5% (p < 0,001) Cao cồn cao flavonoid làm giảm hàm lượng MDA khoảng 1,6 lần so với lô chứng bệnh lô chứng bệnh uống tween 5% lô silymarin làm giảm khoảng 1,4 lần Đối với hàm Chuyên Đề Dược lượng GSH, cao flavonoid làm tăng 1,6 lần, cao cồn làm tăng 1,2-1,3 silymarin làm tăng 1,1 lần Điều bước đầu cho thấy cao flavonoid có khả chống oxy hóa, bảo vệ gan tốt silymarin Về đại thể, tất gan chuột sinh lý chuột uống tween 5% có màu đỏ, mặt nhẵn, mật độ mềm, không phù nề, không sung huyết Chuột lô chứng bệnh lô chứng bệnh uống tween 5%, gan nhạt màu, phù nề, sung huyết, bề mặt có chỗ bạc màu khơng trơn láng, có chấm xuất huyết chấm trắng nhơ lên Chuột uống cao tồn phần cao flavonoid Bán chi liên, silymarin, có gan màu đỏ, bề mặt nhẵn, không phù nề, không sung huyết Cao cồn 50% cao flavonoid Bán chi liên làm giảm tổn thương gan vi thể chuột gây viêm gan CCl4 (Hình 1) Kết vi thể 201 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 ngẫu nhiên mẫu gan lơ trình bày Bảng Nhu mơ gan bình thường Tĩnh mạch trung tâm bình thường Khoảng cửa bình thường Hoại tử tiểu thùy Hoại tử quanh khoảng cửa Viêm quanh khoảng cửa Hình 1: Hình ảnh vi thể tế bào gan chuột (nhuộm HE) Bảng 5: Kết phân tích vi thể tế bào gan lơ chuột thử nghiệm Lô Sinh lý Tween 5% Chứng bệnh CCl4 + tween 5% Silymarin 100 mg/kg Cao cồn 1600 mg/kg Cao cồn 800 mg/kg Cao flavonoid 160 mg/kg Cao flavonoid 80 mg/kg Kết phân tích vi thể 4/6 mẫu nhu mơ gan bình thường 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử tiểu thùy) 3/6 mẫu bình thường 2/6 viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử tiểu thùy) 1/6 rải rác có vài ổ bị vơi hóa, hoại tử tiểu thùy 2/6 mẫu bình thường 4/6 mẫu viêm gan (hoạt tử thối hóa tĩnh mạch trung tâm, viêm gan cấp tính áp xe hóa viêm gan tối thiểu) 6/6 mẫu viêm gan (hoại tử thối hóa quanh tĩnh mạch trung tâm) 4/6 mẫu bình thường 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử tiểu thùy) 3/6 mẫu bình thường 3/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử tiểu thùy) 2/6 mẫu bình thường 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu 2/6 viêm gan (hoại tử thối hóa quanh tĩnh mạch trung tâm) 4/6 mẫu bình thường 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử tiểu thùy) 4/6 mẫu bình thường 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử tiểu thùy) Như vậy, cao cồn, cao flavonoid Bán chi liên đề tài cho tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan hiệu Kết làm giảm tình trạng tăng hoạt tính ALT, AST huyết tương lượng MDA sinh gan, làm tăng lượng GSH gan trở phù hợp với quan sát đại thể phân tích vi thể cấu trúc tế bào gan chuột 202 lô thử nghiệm Điều hoàn toàn phù hợp với báo cáo trước tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan Bán chi liên(5) Về chế, tác động cao Bán chi liên giải thích thành phần hoạt chất có hàm lượng lớn flavonoid, nhóm chất có khả chống oxy hóa mạnh, theo nhiều chế khác Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 đánh bắt gốc tự trực tiếp, thơng qua oxid nitric sau đánh bắt oxid nitric, ức chế hoạt động xanthin oxidase, giảm bạch cầu bám dính, ảnh hưởng đến enzym khác… (8,10) KẾT LUẬN Cao Bán chi liên độc tính cấp đường uống liều tối đa Dmax 25,68 g cao/kg tương đương 51,37 g nấm khô/kg Uống cao với liều g/kg ngày cho tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan hiệu giúp phòng ngừa tổn thương CCl4 0,2% (v/v) gây chuột nhắt trắng tương đương đối chứng silymarin TÀI LIỆU THAM KHẢO Dai ZJ, Gao J (2011) In Vitro and In Vivo Antitumor Activity of Scutellaria barbata Extract on Murine Liver Cancer, Molecules, 16: 4389-4400 Dai ZJ, Lu WF (2013) Protective Effects of Scutellaria barbata Against Rat Liver Tumorigenesis, Asian Pacific J Cancer Prev, 14(1): 261-265 Đỗ Trung Đàm (2014) Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc, NXB Y học - Hà Nội Đoàn Thị Nhu, Đỗ Trung Đàm, Phạm Duy Mai, Nguyễn Thượng Dong, Nguyễn Thị Thu Hương Phương pháp nghiên cứu tác động dược lý thuốc từ dược thảo, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, 2006, tr.279-294 Chuyên Đề Dược 10 11 12 Nghiên cứu Y học Lin CC, Shieh DE (1997) Hepatoprotective effect of the fractions of Ban-zhi-lian on experimental liver injuries in rats, Journal of Ethnopharmacology, 56, 193 - 200 Nguyễn Bảo Trân, Trần Quang Vinh, Nguyễn Ngọc Khôi (2011) Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ gan chùm ngây (Moringa oleifera Lam Moringaceae), Tạp chí Dược học, 421: 25-29 Nguyễn Văn Hùng, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai Hương, Trịnh Thị Thanh Vân, Nguyễn Thị Thu Hà, Đỗ Thị Thảo, Trần Văn Hiệu (2009) Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Bán chi liên Scutellaria barbata D.Don Tạp chí Hóa học, 47(6): 192-198 Pietta PG (2000) Flavonoids as antioxidants J Nat Prod., 63(7): 1035-42 Prio RL, Wu X, Schaich K (2005) Standardized methods for the determination of antioxydant capacity and phenolics in food and dietary supplement, J Agric Food Chem., 55: 2698A - J Robert JN, Elsvan N (2001) Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications Am J Clin Nutr, 74: 418-25 Viện dược liệu (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập I, tr 172-173 Yoichi S, Shiho S (2000) Phytochemical flavones isolated from Scutellaria barbata and antibacterial activity against methicillin resistant Staphylococcus Journal of Ethnopharmacology, 72: 483-488 Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 30/10/2015 20/11/2015 20/02/2016 203 ... Khảo dược liệu giúp bảo vệ gan, kiểm sốt điều trị sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan kịp thời nhờ ưu điểm sử dụng lâu dài, Bán chi liên (Scutelaria barbata D Don) tính an tồn cao Bán chi. .. động chống oxy hóa, bảo vệ gan in vivo Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan cao Bán chi liên chuột nhắt gây tổn thương gan carbon tetraclorid 0,2% (tt/tt) pha dầu liu Tác động hoạt tính men gan. .. cáo trước tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan Bán chi liên( 5) Về chế, tác động cao Bán chi liên giải thích thành phần hoạt chất có hàm lượng lớn flavonoid, nhóm chất có khả chống oxy hóa mạnh, theo