Áp dụng hướng dẫn EP15 của CLSI để đánh giá độ chính xác và độ tập trung của một số xét nghiệm trên máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU5800.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN EP15 CỦA CLSI TRONG XÁC NHẬN PHƯƠNG PHÁP CHO MỘT SỐ CHỈ SỐ HOÁ SINH TRÊN MÁY AU5800 Trịnh Phương Dung*, Trần Thị Chi Mai*, Hoàng Trung Kiên**, Phạm Thu Hiền**, Lê Hồng Bích Nga* TĨM TẮT Mục tiêu: Áp dụng hướng dẫn EP15 CLSI để đánh giá độ xác độ tập trung số xét nghiệm máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU5800 Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng vật liệu nội kiểm hãng Randox vật liệu ngoại kiểm chương trình ngoại kiểm Hóa sinh Riquas Randox để tiến hành thực nghiệm đánh giá độ xác độ tập trung thơng số hóa sinh: cholesterol, triglycerid, urê, creatinin, CRP , Na+, K+, Cl- máy AU 5800 theo hướng dẫn EP15 CLSI Kết quả: Độ tập trung độ xác thông số mà nhà sản xuất công bố xác nhận điều kiện phòng xét nghiệm Kết luận: Hướng dẫn EP15 CLSI cách tiếp cận đơn giản khả thi, nên khuyến cáo cho phòng xét nghiệm xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm Từ khoá: Độ tập trung, độ xác, EP15, CLSI ABSTRACT CLSI EP15 GUIDELINE APPLICATION FOR VERIFYING PRECISION AND TRUENESS OF SOME BIOCHEMICAL INDICATORS ON BECKMAN COULTER AU5800 Trinh Phuong Dung, Tran Thi Chi Mai, Hoang Trung Kien, Pham Thu Hien, Le Hoang Bich Nga * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 22 - No 3- 2018: 211 - 216 Aims: Applying CLSI EP15 Guidelines to verify the precision and trueness of some biochemical indicators on the Beckman Coulter AU5800 chemistry analyzer Materials and Methods: The Randox quality control materials were used to verify the precision and the Riquas external quality control materials were used to verify the trueness of following biochemical indicators: cholesterol, triglycerid, urea, creatinin, CRP, Na+, K+, and Cl- on AU 5800 chemistry analyzer Results: The manufacturer claims on the precision and trueness of biochemical indicators on AU5800 chemistry analyzer were verified in our laboratory condition Conclusion: CLSI EP15 guideline is a simple and applicable approach and should be recommended for verification of performance for precision and trueness in laboratories Key words: Precision, Trueness, EP15, CLSI ĐẶT VẤN ĐỀ Xác nhận phương pháp phân tích (verification) khẳng định kiểm tra chứng khách quan chứng minh phương pháp xét nghiệm đáp ứng yêu cầu đặt Kết xác nhận phương pháp bao gồm đánh giá nhiều đặc tính kỹ thuật * Trường Đại học Y Hà Nội Tác giả liên lạc: CN Trịnh Thị Phương Dung phương pháp, đặc biệt độ xác, độ tập trung Xác nhận phương pháp phân tích phần khơng thể thiếu muốn có kết xét nghiệm đáng tin cậy(10) Việc xác nhận phương pháp phân tích cần tiến hành trước đưa thiết bị mới, kỹ thuật xét nghiệm vào sử dụng nhằm xác nhận tiêu chuẩn kỹ thuật mà nhà sản xuất công bố ** Bệnh viện Nhi trung ương ĐT: 0906290161 Email: phuongdungktyh@gmail.com 211 Nghiên cứu Y học điều kiện phòng xét nghiệm(7,6) Đây đòi hỏi bắt buộc cho hệ thống phòng xét nghiệm để cơng nhận ISO 15189(6) Tuy nhiên, xác nhận phương pháp phân tích việc làm phức tạp, tốn kém, đòi hỏi nhiều thời gian, nhân lực, vật lực Do vậy, cần phải giảm thiểu tối đa chi phí thời gian cho cơng tác xác nhận phương pháp phân tích nói riêng quản lý chất lượng xét nghiệm nói chung đảm bảo chất lượng xét nghiệm(13) Viện tiêu chuẩn lâm sàng xét nghiệm Hoa Kỳ (Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI) xây dựng hướng dẫn EP 15 xác nhận độ xác độ tập trung với quy trình kỹ thuật đơn giản nhằm tiết kiệm tối đa nguồn lực đảm bảo tính nghiêm ngặt, áp dụng phòng xét nghiệm khác trang thiết bị, kỹ thuật, nhân lực Máy hoá sinh tự động Beckman Coulter AU5800 thiết kế nhằm sử dụng phòng xét nghiệm hố sinh lâm sàng với số lượng mẫu lớn(1) Máy AU5800 thiết bị triển khai Bệnh viện Nhi Trung ương từ năm 2017 Để khẳng định kết xét nghiệm máy AU5800 xác, tin cậy công bố nhà sản xuất, cần phải xác nhận xem phương pháp phân tích hệ thống máy trước đưa vào sử dụng thường quy Đề tài thực với mục tiêu: Áp dụng hướng dẫn EP15 CLSI để đánh giá độ xác độ tập trung số xét nghiệm định lượng máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU5800 ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Chất liệu nghiên cứu Mẫu chứng đông khô thương mại (mức 1, mức 2) Randox, ITA Control Serum Level 1, CRP sử dụng để xác nhận độ tập trung Vật liệu ngoại kiểm Chương trình ngoại kiểm Hoá sinh Riquas Randox sử dụng 212 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 để xác nhận độ xác Thiết bị hóa chất sử dụng Máy AU5800 hóa chất hệ máy AU hãng Beckman Coulter Địa điểm thời gian Khoa Sinh hóa, Bệnh viện Nhi trung ương, năm 2017 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm phòng xét nghiệm Áp dụng theo hướng dẫn EP 15 CLSI để xác nhận độ tập trung độ xác cho thơng số sau máy 5800: Urê, Creatinin, Cholesterol, Triglycerid, CRP, Na+, K+, Cl- Đánh giá độ tập trung Phân tích mẫu chứng với hai mức nồng độ liên tiếp ngày Mỗi ngày chạy lặp lại lần liên tiếp (n= 15) Đánh giá độ xác Sử dụng mẫu ngoại kiểm Phân tích mức vật liệu tham chiếu liên tiếp ngày Mỗi ngày chạy lặp lại lần liên tiếp (n=10) Kết thu thập phân tích phần mềm Excel Phân tích kết thực nghiệm đánh giá độ tập trung Đánh giá độ tập trung (Precision) xét nghiệm thông qua SD, CV, phương sai thu từ kết thực nghiệm Độ tập trung đánh giá qua SD phòng xét nghiệm (within – laboratory SD) giá trị xác nhận (Verification value) Nếu SD phòng xét nghiệm thu thấp giá trị xác nhận tuyên bố nhà sản xuất xác nhận Phân tích kết thực nghiệm đánh giá độ xác Đánh giá độ xác (Trueness) xét nghiệm đánh giá cách phân tích vật liệu ngoại kiểm Kết thu dùng để tính tốn giá trị trung bình SD, áp dụng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 thuật toán thống kê để thiết lập khoảng tin cậy khoảng xác nhận Nghiên cứu Y học độ xác giá trị ấn định vật liệu tham chiếu nằm khoảng xác nhận Phương pháp xét nghiệm xác nhận KẾT QUẢ Kết đánh giá độ tập trung xét nghiệm Bảng Kết đánh giá độ tập trung số xét nghiệm máy AU5800 Xét nghiệm Chất chứng QC1 Cholesterol (mmol/L) QC2 QC1 Triglycerid (U/L) QC2 QC1 Creatinin (µmol/L) QC2 QC1 Ure (mmol/L) QC2 QC1 + Na (mmol/L) QC2 QC1 + K (mmol/L) QC2 QC1 Cl (mmol/L) QC2 QC1 CRP (mg/L) QC2 QC3 n 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 X 4,07 6,54 1,10 3,06 121,52 341,67 7,23 18,88 141,73 160,80 4,05 6,13 97,27 113,53 14,39 29,43 77,04 SD PXN 0,05 0,10 0,02 0,06 3,90 13,14 0,26 0,73 1,64 2,24 0,07 0,09 1,40 1,72 0,53 1,91 3,40 CV% PXN 1,25 1,57 2,05 2,08 3,21 3,84 3,55 3,86 1,15 1,39 1,72 1,45 1,44 1,51 3,70 6,49 4,41 Thông số T tính tốn dựa số liệu thực nghiệm đánh giá độ tập trung Kết bậc tự T dùng để tra cứu giá trị C C tra cứu dựa giá trị T theo bảng điểm tỷ lệ chọn phân bố Chi-bình phương số mức nồng độ chọn để cung cấp T 13,85 11,74 7,86 8,35 13,39 6,01 7,86 8,35 12,90 13,32 4,45 13,91 11,36 13,99 4,58 4,31 4,81 C 24,74 21,92 16,01 17,53 24,74 14,45 16,01 17,53 23,34 24,74 11,14 24,74 21,92 24,74 12,09 12,09 12,09 Sclaim 0,20 0,20 0,20 0,20 13,00 13,00 0,80 0,80 1,5 1,5 0,2 0,2 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 Giá trị xác nhận 0,27 0,27 0,29 0,29 17,67 20,15 1,14 1,16 2,02 2,04 0,32 0,27 4,17 3,99 4,88 5,02 4,77 5% tỷ lệ sai số loại bỏ (Bảng từ EP15-A2(e)) Sclaim giá trị nhà sản xuất công bố Nhận xét: SD phòng xét nghiệm xét nghiệm thu nhỏ giá trị xác nhận, trừ giá trị SD Na+ở mức nồng độ QC2 2,24 mmol/L lớn giá trị xác nhận Kết đánh giá độ xác xét nghiệm Bảng Kết đánh giá độ xác số xét nghiệm máy AU5800 XN TC (mmol/L) TG (U/L) Cre (µmol/L) Ure (mmol/L) + Na (mmol/L) + K (mmol/L) - Cl (mmol/L) Vật liệu X Giá trị ấn Giới hạn Giới hạn Độ không Giới hạn xác Giới hạn xác n SD ngoại kiểm định khoảng tin cậy khoảng tin cậy đảm bảo đo nhận nhận Mức 10 4,16 0,05 4,16 4,21 4,11 0,14 4,62 3,70 Mức 10 7,18 0,07 7,12 7,25 712 0,26 8,03 6,34 Mức 10 1,08 0,01 1,09 1,09 1,07 0,05 1,24 0,92 Mức 10 2,85 0,04 2,87 2,89 2,81 0,10 3,17 2,53 Mức 10121,233,00 128,0 5,32 124,31 118,15 138,54 103,92 Mức 10351,483,61 354,3 355,19 347,77 12,09 390,79 312,17 Mức 10 7,29 0,35 7,05 7,65 6,93 0,26 8,12 6,46 Mức 10 19,53 0,78 18,89 20,34 18,72 0,72 21,88 17,18 Mức 10 145,1 0,99 142,95 1,89 146,12 144,08 151,23 138,97 Mức 10 163,2 0,79 160,9 2,26 164,01 162,39 170,56 155,84 Mức 10 4,04 0,05 4,02 4,09 3,99 0,07 4,27 3,81 Mức 10 6,11 0,03 6,10 6,14 6,08 0,10 6,43 5,79 Mức 10 97,20 1,23 96,16 98,46 95,94 1,68 102,65 91,75 Mức 10 115,8 0,79 115,20 116,61 114,99 1,69 121,29 110,31 213 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Vật liệu X Giá trị ấn Giới hạn Giới hạn Độ không Giới hạn xác Giới hạn xác n SD ngoại kiểm định khoảng tin cậy khoảng tin cậy đảm bảo đo nhận nhận Mức 10 24,09 0,51 22,86 0,89 24,61 23,56 26,96 21,21 CRP Mức 10 34,39 0,55 34,28 34,95 33,82 1,45 39,10 29,67 (mg/ L) Mức 10 66,93 1,02 70,36 3,60 67,97 65,88 78,64 55,21 XN TC: Cholesterol toàn phần; TG: Triglycerid; Nhận xét: Giá trị ấn định xét nghiệm Cholesterol, Triglycerid, Ure, K+, Cl- nằm khoảng tin cậy khoảng xác nhận mức nồng độ, tương đương với việc độ xác phương pháp xác nhận Trong giá trị ấn định Creatinin, Na+, CRP có hai mức nồng độ nằm khoảng tin cậy, lại nằm khoảng xác nhận BÀN LUẬN Theo hướng dẫn EP15 CLSI, hai mức huyết kiểm tra Randox cho thông số ba mức huyết kiểm tra ITA CRP, phân tích lặp lại lần ngày Tính giá trị trung bình, SD, phương sai ngắn hạn dài hạn kết thu với hai mức QC từ tính tốn SD phòng xét nghiệm giá trị xác nhận để đánh giá độ tập trung Tiêu chuẩn chấp nhận độ tập trung SD phòng xét nghiệm nhỏ giá trị xác nhận(4) Kết bảng 3.2 cho thấy hầu hết xét nghiệm có SD phòng xét nghiệm thấp giá trị xác nhận Điều chứng tỏ độ tập trung tất xét nghiệm đánh giá đạt tiêu chuẩn cho phép, trừ xét nghiệm Na+ mức QC1 Sở dĩ xét nghiệm có SD phòng xét nghiệm lớn giá trị xác nhận xét nghiệm định lượng điện giải phương pháp điện cực chọn lọc ion gián tiếp đòi hỏi yêu cầu cao kỹ thuật xét nghiệm Tuy nhiên, PXN cần lưu tâm vấn đề cần thực nhiều biện pháp kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt để cải thiện độ tập trung cho xét nghiệm Kết nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu Glibert B cộng năm 2016 tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu phương pháp máy phân tích hóa sinh tự động Beckman Coulter AU5800(5) Theo nghiên cứu này, hầu hết xét nghiệm tiến hành thực nghiệm đảm bảo độ tập trung, xét 214 Cre: Creatinin nghiệm Na có độ không tập trung cao xác nhận nhà sản xuất(5) Trên nghiên cứu khác Trần MT cộng năm 2016 tiến hành nghiên cứu đánh giá độ lệch độ không tập trung (imprecision) sử dụng thang sigma trên dòng máy phân tích hóa sinh tự động BeckmanCoulter AU680, kết cho thấy xét nghiệm Na+ có độ khơng tâp trung vượt giới hạn cho phép(11) CLSI đưa hai hướng dẫn xác nhận độ tập trung EP05 EP15 Hướng dẫn EP05 xây dựng quy trình thực nghiệm 20 ngày liên tiếp phân tích lặp lại mẫu chứng để đánh giá độ tập trung ngắn hạn độ tập trung dài hạn(3) Trong hướng dẫn EP15 xây dựng quy trình thực nghiệm ngày liên tiếp phân tích lặp lại mẫu chứng để đánh giá độ tập trung(4,13) Do áp dụng hướng dẫn EP15 CLSI để đánh giá độ tập trung phòng xét nghiệm giúp tiết kiệm thời gian, kinh phí, nhân lực, vật lực, áp dụng thường quy phòng xét nghiệm với quy mô nguồn lực khác Tuy nhiên so với cách đánh giá độ tập trung theo hướng dẫn EP05, áp dụng hướng dẫn EP15 khăn việc tính tốn thống kê với cơng thức phức tạp, thực nhiều bước tính tốn Theo nghiên cứu Vũ Thị Thùy Trang năm 2014 Thẩm định phương pháp xét nghiệm hóa sinh máy hóa sinh tự động Beckman coulter AU2700(12) nghiên cứu Tô Thi Vân năm 2015 Thẩm định phương pháp xét nghiệm hóa sinh máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680 phương pháp sử dụng Sigma(9), việc đánh giá độ tập trung thông qua độ tập trung ngắn hạn dài hạn đòi hỏi thời gian thử nghiệm dài hơn, đảm bảo độ tin cậy cao kết quả, tính tốn đơn giản cần kinh phí, nhân lực vật lực nhiều so với việc áp dụng hướng dẫn EP15(9,12) + Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Độ xác phương pháp đánh giá sử dụng vật liệu tham chiếu Trong thực nghiệm này, sử dụng vật liệu ngoại kiểm Chương trình ngoại kiểm hố sinh Riquas (Randox) Theo hướng dẫn EP15 CLSI, tiến hành thực nghiệm đánh giá độ xác ngày, hai mức vật liệu tham chiếu cho tất thông số nghiên cứu trừ CRP mức; mức phân tích lặp lại lần ngày (n=10) Tính giá trị trung bình, SD, SE trung bình, giới hạn tin cậy Sử dụng giá trị SD ấn định kết hợp với SE trung bình tính độ khơng đảm bảo đo từ tính giới hạn xác nhận Tiêu chuẩn chấp nhận độ xác giá trị ấn định mẫu vật liệu tham chiếu nằm giới hạn tin cậy giới hạn xác nhận(13) Kết bảng cho thấy giá trị ấn định xét nghiệm Cholesterol, Triglycerid, Ure, K+, Cl- nằm hai khoảng giới hạn tin cậy giới hạn xác nhận hai mức nồng độ Tuy nhiên xét nghiệm định lượng Creatinin giá trị ấn định mức 128 µmol/L nằm ngồi giới hạn tin cậy (118,15 – 124,31µmol/L), xét nghiệm Na+ hai mức nồng độ 142,95 160,90 mmol/L nằm giới hạn tin cậy hai mức nồng độ (mức 1:144,08 – 146,12 mức 2: 162,39 – 164,01 mmol/L), xét nghiệm CRP mức nồng độ 22,86 mg/L mức 70,36 mg/L nằm giới hạn tin cậy (mức 1:23,56 – 24,61 mức 3: 65,88 – 67,97 mg/L) Nhưng tính tốn giới hạn xác nhận, xét nghiệm nằm giới hạn xác nhận Sở dĩ khoảng giới hạn xác nhận rộng giới hạn tin cậy giới hạn xác nhận bao hàm độ không đảm bảo phép đo Hướng dẫn EP15 CLSI đưa khuyến cáo cần kết hợp độ không đảm bảo đo phương pháp với giá trị ấn định việc phối hợp phương sai với độ không đảm bảo đo từ thực nghiệm, giới hạn xác nhận thu rộng giới hạn tin cậy Quy trình đo lường bao gồm nhiều bước, nhiều giai đoạn Nếu hệ thống đo lường đủ nhạy, phép đo lặp lại mẫu cho giá trị khác Nghiên cứu Y học điều kiện thực giống nhau(8) Như vậy, việc đo lặp lại không cho giá trị nhất, tồn độ khơng đảm bảo giá trị thực mẫu đo Việc kết hợp độ không đảm bảo đo đưa khoảng giới hạn chấp nhận rộng Như tất phương pháp định lượng máy AU5800 xác nhận độ xác Hướng dẫn EP15 cung cấp quy trình đánh giá độ xác sử dụng mẫu bệnh phẩm cho việc xác nhận phương pháp hay phương pháp nâng cấp(13) Bên cạnh EP15, CLSI đưa hướng dẫn EP09 xác nhận độ xác phương pháp xét nghiệm EP09 phát triển quy trình thực nghiệm phân tích tối thiểu 40 mẫu bệnh phẩm lặp lại hai lần hai phương pháp (phương pháp xác nhận phương pháp tham chiếu) ngày(2) So với EP09 xác nhận độ xác, EP15 thuận lợi chi phí, thời gian, nhân lực lẫn việc tính toán, xử lý kết đơn giản, nhanh chóng mà đảm bảo tính tin cậy Do việc áp dụng hướng dẫn EP15 CLSI so với hướng dẫn khác EP05 EP09 xác nhận độ xác, độ tập trung nên thực phổ biến phòng xét nghiệm KẾT LUẬN Áp dụng hướng dẫn EP15 CLSI, xét nghiệm cholesterol, triglycerid, urê, creatinin, CRP, Na+, K+, Cl- máy AU5800 có độ tập trung độ xác công bố nhà sản xuất Hướng dẫn EP15 CLSI cách tiếp cận đơn giản khả thi, nên khuyến cáo cho phòng xét nghiệm xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Catalogue Beckman Coulter AU5800 Clinical Chemistry System (2015) Beckman Coulter Inc Clinical Laboratory Standard Institute (2013) Measurement procedure comparison and bias estimation using patient samples; approved guideline, 3rd edition CLSI EP09- A3, 33(11) Clinical Laboratory Standard Institute (2014) Evaluation of Precision of Quantitative Measurement Procedures; approved guideline, 3rd Edition CLSI document EP05-A3, 34(13) 215 Nghiên cứu Y học 216 Clinical Laboratory Standard Institute (2014) User verification of Precision and Estimation of Bias; approved guidline, 3rd edition CLSI document EP15-A3, 34(12) Glibert B, Bourleaux V, Peeters R, et al (2016) Analytical Performance Verification of the Beckman Coulter AU5800 Clinical Chemistry Analyser Against Recognized Quality Specifications Reveals Relevance of Method Harmonization Clin Lab, 62(1-2): 57-72 International Organization for Standardization (2012) Medical laboratories: Particular requirements for quality and competence ISO 15189 International Organization for Standardization (ISO), Geneva Linnet K, Boyd JC (2006) Selection and analytical evaluation of methods – with statistical techniques In: Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, ediyors Tietz textbook of clinical chemistry 4thed Philadelphia: Sauders Technical Guide (2013): A Guide on Measurement Uncertainty in Medical Testing The Singapore Accreditation Council Tô Thi Vân (2015) Thẩm định phương pháp xét nghiệm hóa sinh máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680 phương Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 10 11 12 13 pháp sử dụng Sigma, Khóa luận tốt nghiệp Trường Đại học Y Hà Nội Trần Cao Sơn cs (2010) Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật Hà Nội Tran MT, Hoang K, Greaves RF (2016) Practical application of biological variation and Sigma metrics quality models to evaluate 20 chemistry analytes on the Beckman Coulter AU680 Clin Biochemistry, 49(16-17): 1259 – 1266 Vũ Thị Thùy Trang (2014) Thẩm định phương pháp xét nghiệm hóa sinh máy hóa sinh tự động Beckman Couter AU2700, Khóa luận tốt nghiệp Trường Đại học Y Hà Nội Westgard JO (2008) Basic Method Validation, 3rd Edition Westgard QC, 19: 221 – 240 Ngày nhận báo: 17/12/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 09/02/2018 Ngày đăng: 10/05/2018 ... chấp nhận rộng Như tất phương pháp định lượng máy AU5800 xác nhận độ xác Hướng dẫn EP15 cung cấp quy trình đánh giá độ xác sử dụng mẫu bệnh phẩm cho việc xác nhận phương pháp hay phương pháp nâng... Do việc áp dụng hướng dẫn EP15 CLSI so với hướng dẫn khác EP05 EP09 xác nhận độ xác, độ tập trung nên thực phổ biến phòng xét nghiệm KẾT LUẬN Áp dụng hướng dẫn EP15 CLSI, xét nghiệm cholesterol,... cạnh EP15, CLSI đưa hướng dẫn EP09 xác nhận độ xác phương pháp xét nghiệm EP09 phát triển quy trình thực nghiệm phân tích tối thiểu 40 mẫu bệnh phẩm lặp lại hai lần hai phương pháp (phương pháp xác