Xác nhận hiệu năng kỹ thuật của phương pháp là một yêu cầu cốt lõi để đảm bảo cung cấp kết quả xét nghiệm tin cậy trước khi áp dụng xét nghiệm cho người bệnh. Đề tài được tiến hành với mục tiêu xác nhận quy trình định lượng TSH trong mẫu máu thấm khô để sàng lọc sơ sinh bệnh suy giáp bẩm sinh trên hệ thống máy Perkin Elmer.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN EP15A3 CỦA CLSI XÁC NHẬN PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TSH TRONG SÀNG LỌC SƠ SINH Nguyễn Thị Phương Cúc1, Vũ Thị Tú Uyên2, Nguyễn Kiều Hoài Linh2, Trần Thị Chi Mai2,3 Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương, Bệnh viện Nhi Trung ương, Trường Đại học Y Hà Nội Xác nhận hiệu kỹ thuật phương pháp yêu cầu cốt lõi để đảm bảo cung cấp kết xét nghiệm tin cậy trước áp dụng xét nghiệm cho người bệnh Đề tài tiến hành với mục tiêu xác nhận quy trình định lượng TSH mẫu máu thấm khơ để sàng lọc sơ sinh bệnh suy giáp bẩm sinh hệ thống máy Perkin Elmer Nghiên cứu sử dụng vật liệu nội kiểm kit Neonatal hTSH để tiến hành thực nghiệm đánh giá độ chụm độ xét nghiệm TSH máy phân tích Perkin Elmer theo hướng dẫn EP15 - A3 CLSI CV phòng xét nghiệm hai mức QC 11,8 11,1 (%), nhỏ CV nhà xuất công bố Giá trị trung bình quan sát hai mức QC nằm khoảng xác nhận Độ chụm độ xét nghiệm TSH sàng lọc suy giáp bẩm sinh xác nhận, xét nghiệm sử dụng cung cấp dịch vụ sàng lọc sơ sinh Từ khóa: suy giáp bẩm sinh, sàng lọc sơ sinh, xác nhận phương pháp, EP15A3 I ĐẶT VẤN ĐỀ Xác nhận phương pháp phân tích phần khơng thể thiếu muốn có kết xét nghiệm đáng tin cậy.1 Việc xác nhận phương pháp phân tích cần tiến hành trước đưa thiết bị mới, kỹ thuật xét nghiệm vào sử dụng nhằm xác nhận tiêu chuẩn kỹ thuật mà nhà sản xuất công bố điều kiện phòng xét nghiệm.2,3 Tuy nhiên, xác nhận phương pháp phân tích việc làm phức tạp, tốn kém, đòi hỏi nhiều thời gian, nhân lực, vật lực Do vậy, cần phải giảm thiểu tối đa chi phí thời gian cho cơng tác xác nhận phương pháp phân tích đảm bảo chất lượng xét nghiệm.3 Viện tiêu chuẩn lâm sàng xét nghiệm Hoa Kỳ (Clinical and Laboratory Địa liên hệ: Nguyễn Thị Phương Cúc Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương Email: phuongcuchmtu@gmail.com Ngày nhận: 13/5/2020 Ngày chấp nhận: 09/06//2020 26 Standards Institute - CLSI) xây dựng hướng dẫn EP 15A3 xác nhận độ chụm độ với quy trình kỹ thuật đơn giản nhằm tiết kiệm tối đa nguồn lực đảm bảo tính nghiêm ngặt, áp dụng phòng xét nghiệm khác trang thiết bị, kỹ thuật, nhân lực.4 Suy giáp bẩm sinh nguyên nhân hay gặp điều trị chậm phát triển tâm thần.5 Đây rối loạn phổ biến liên quan đến suy yếu tâm thần chậm phát triển trẻ sơ sinh Ở nhiều nước, chương trình sàng lọc trẻ sơ sinh thực để chẩn đoán sớm điều trị suy giáp Suy giáp bẩm sinh gặp với tần suất 3000 - 4000 trẻ sơ sinh Hầu hết trẻ sơ sinh bị suy giáp bẩm sinh bình thường sinh khơng có dấu hiệu lâm sàng, điều cho thấy tầm quan trọng chương trình sàng lọc việc phát sớm suy giáp bẩm sinh.5 Hàng năm nước ta có khoảng 1,4 – 1,5 triệu trẻ em TCNCYH 128 (4) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC đời ước tính có khoảng 400 trẻ bị bệnh suy giáp bẩm sinh Nhưng theo báo cáo 10 năm (1989 – 1999) khoa Nội tiết Bệnh viện Nhi Trung ương, tỷ lệ phát điều trị suy giáp bẩm sinh nước ta chiếm 8%, có khoảng 90% số trường hợp bị bỏ sót cộng đồng.6 Hệ thống sàng lọc sơ sinh Perkin Elmer (gồm: máy đục lỗ giấy thấm máu khô, máy lắc ủ, máy rửa, máy đọc huỳnh quang Victor 2D) sử dụng để sàng lọc số bệnh bẩm sinh Để đưa kit sàng lọc bệnh suy giáp bẩm sinh thực hệ thống máy này, cần phải xác nhận phương pháp trước đưa vào sử dụng Do đó, đề tài thực với mục tiêu: Áp dụng hướng dẫn EP15A3 CLSI xác nhận phương pháp định lượng TSH sàng lọc suy giáp bẩm sinh hệ thống máy Perkin Elmer II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Chất liệu nghiên cứu Chất liệu nghiên cứu: Vật liệu kiểm tra chất lượng hãng Perkin Elmer với mức nồng độ cho xét nghiệm định lượng TSH Thiết bị hóa chất sử dụng: Hệ thống máy Perkin Elmer (gồm: máy đục lỗ giấy thấm máu khô, máy lắc ủ, máy rửa, máy đọc huỳnh quang Victor 2D) kit Neonatal hTSH hãng Perkin Elmer Địa điểm thời gian: Khoa Sinh hóa, Bệnh viện Nhi Trung ương, từ tháng 10 - 12 năm 2019 Phương pháp Nghiên cứu thực nghiệm phòng xét nghiệm Nghiên cứu sử dụng thực nghiệm để đánh giá độ chụm độ phương pháp xét nghiệm theo hướng dẫn EP15A3 CLSI Phân tích lặp lại ngày lần hai mức vật liệu kiểm tra chất lượng (QC), tiến TCNCYH 128 (4) - 2020 hành ngày liên tiếp.4 Xác nhận độ chụm Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn SD, hệ số biến thiên CV từ tính tốn SD phịng xét nghiệm Nếu SD phòng xét nghiệm thấp giá trị xác nhận độ chụm xác nhận Xác nhận độ Tính tốn thống kê để đưa khoảng giá trị tin cậy (khoảng giá trị xác nhận) phương pháp Nếu giá trị trung bình vật liệu kiểm tra chất lượng nằm khoảng tin cậy khoảng xác nhận độ phịng xét nghiệm xác nhận phù hợp với công bố nhà sản xuất Nguyên lý kỹ thuật Xét nghiệm định lượng TSH sơ sinh là xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang kiểu sandwich trực tiếp Sự phát huỳnh quang mẫu tỷ lệ thuận với nồng độ hTSH mẫu thử Quy trình sàng lọc sơ sinh bệnh suy giáp bẩm sinh Mẫu máu khô, mẫu QC, mẫu chuẩn kèm với kit hóa chất Perkin Elmer cắt hình trịn đường kính 3,2 mm (1/8 inch) máy đục lỗ vào giếng tương ứng đĩa Thêm dung dịch thuốc thử vào giếng, ủ nhiệt độ phòng Loại bỏ dung dịch giấy lọc Sau đó, bổ sung thêm 200 µl dung dịch Enhancement Solution vào giếng, lắc từ từ phút đo Đạo đức nghiên cứu Vật liệu sử dụng mẫu QC, mẫu bệnh phẩm III KẾT QUẢ Xác nhận độ chụm Các bước thực theo hướng dẫn EP15A3: hai mức QC sử dụng làm vật liệu thực nghiệm Kết thực nghiệm thu được trình bày bảng 27 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Số liệu thu thực nghiệm QC1 Nồng độ TSH (mIU/L) Lần chạy Lần chạy Lần chạy Lần chạy Lần chạy 13,5 15,4 17,4 12,3 15,5 13,8 16,7 18,4 14,9 13,4 12,5 14,6 17,7 14,9 16,1 13,4 18,3 16,2 15,9 17,5 18 15 15,4 16,2 13,6 Lần chạy Lần chạy Lần chạy Lần chạy Lần chạy 61,8 65,3 66,8 72,4 62,6 70,6 75 54,7 58,2 63,9 63,2 70,2 65,2 53 59,7 68,3 83,1 74,2 54,4 62,5 65,1 68,5 63,5 57,4 63,2 QC2 Bước 1: Tổng hợp kết thực nghiệm 7,01= 64,91 ± 21,97 (mIU/L) thu dạng bảng (Bảng 1) Vì tất kết trình bày bảng Bước 2: Test Grubbs cho số liệu lạc nằm giới hạn này, nên khơng có Theo thử nghiệm Grubbs, kết số liệu lạc cần loại bỏ thực nghiệm coi số liệu lạc nằm ngồi giới hạn Bước 3: Ước tính độ chụm sử dụng phân Grubbs tính bằng: tích phương sai chiều (one - way analysis Grubbs’ limits = Mean ± G × SD of variance) Trong đó: Mean: giá trị trung bình số Bước 3.1: Trong nghiên cứu, liệu thu được, G: hệ số Grubbs tra sử dụng phân tích ANOVA chiều để tìm từ bảng Grubbs (G= 3,135), SD: độ lệch chuẩn ước tính độ chụm TSH lần chạy số liệu bao gồm số liệu lạc lần chạy Phân tích ANOVA QC1: Giới hạn Grubbs = 15,46 ± 3,135 × chiều chuẩn bị phần mềm tính tốn 1,81= 15,46 ± 5,67 (mIU/L) ANOVA tự động (Bảng 2) QC2: Giới hạn Grubbs = 64,91 ± 3,135 × Bảng Ước tính độ chụm phân tích phương sai chiều (ANOVA) Nguồn biến thiên QC1 Giữa lần chạy Trong lần chạy Toàn phần Nguồn biến thiên 28 SS DF MS 23,2776 5,8194 (MS1) 54,94 20 2,747 (MS2) 78,2176 24 SS DF MS TCNCYH 128 (4) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Nguồn biến thiên QC2 SS DF MS Giữa lần chạy 487,9144 121,9786(MS1) Trong lần chạy 690,552 20 34,5276 (MS2) Toàn phần 1178,466 24 SS: Sum of squares, DF: Degrees of freedom, MS: Mean squares Bước 3.2: Tính tốn phương sai Hai giá trị phương sai tính toán từ bảng ANOVA Vw = MS2 VB = ( MS1 – MS2)/ no Trong đó: Vw: phương sai lặp lại (trong lần chạy), VB: phương sai lần chạy, MS: bình phương trung bình, no số lần chạy (thực nghiệm 5) QC1: VW = MS2 = 2,747 VB = (5,819 – 2,747)/5 = 0,615 QC2: VW = MS2 = 34,528 VB = (121,979 – 34,528)/5 = 17,49 Bước 3.3: Tính độ lệch chuẩn SD: QC1: SR = SB = = = SWL = = 0,78 = QC2: SR = SB = = 1,66 = 1,83 = = = 5,88 = 4,18 SWL = = = 7,21 Trong đó: SR: độ lệch chuẩn lần chạy, SB: độ lệch chuẩn lần chạy, SWL: độ lệch chuẩn phòng xét nghiệm Bước 3.4: Chuyển đổi SD sang CV (%): QC1: CVR = (SR × 100)/ Trung bình= (1,66 ×100)/ 15,5 = 10,7 (%) CVB = (SB × 100)/ Trung bình = (0,78 × 100)/ 15,5 = 5,03 (%) CVWL = (SWL × 100)/ Trung bình = (1,83 × 100)/ 15,5 = 11,8 (%) QC2: CVR = (SR × 100)/ Trung bình = (5,88 ×100)/ 64,9 = 9,06 (%) CVB = (SB × 100)/ Trung bình = (4,18 × 100)/ 64,9 = 6,44 (%) CVWL = (SWL × 100)/ Trung bình = (7,21 × 100)/ 64,9 = 11,1 (%) Trong đó: CVR: Hệ số biến thiên lần chạy, CVB: hệ số biến thiên lần chạy, CVWL: hệ số biến thiên phòng xét nghiệm TCNCYH 128 (4) - 2020 29 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bước 4: So sánh độ chụm ước tính với cơng bố nhà sản xuất Độ chụm ước tính phịng xét nghiệm mức QC1 (CVWL =11,8%) nhỏ công bố nhà sản xuất (20%) mức QC2 (CVWL =11,1%) nhỏ độ chụm công bố nhà sản xuất (Bảng 3) Do vậy, khơng cần thiết tính giới hạn xác nhận (Upper verification limit - UVL) cho độ chụm với thực nghiệm Trong trường hợp độ chụm PXN lớn nhà xản xuất, cần tính UVL để so sánh Cách tính trình bày đây: Tính giới hạn xác nhận cho độ chụm (UVLR): dfR = N – K = 25 – = 20 Trong đó: N: số lần lặp lại, K = no : số lần chạy Hệ số UVL (F) cho độ lặp lại tính tốn theo dfR dựa bảng hướng dẫn EP15 A3: F = 1,31, UVLR = F × CVNSX = 1,31× 20 = 26,2 (%) Bảng So sánh độ chụm ước tính với cơng bố nhà sản xuất Độ chụm PXN Trung bình (mIU/L) N Độ chụm ước tính Cơng bố NSX Giới hạn xác nhận Đánh giá QC1 15,5 25 11,8 % 20% 26,2% Đạt QC2 64,9 25 11,1 % 20% 26,2% Đạt QC Xác nhận độ Các bước thực theo hướng dẫn EP15A3: hai mức QC sử dụng làm vật liệu thực nghiệm Kết thực nghiệm thu được trình bày bảng Bước 1: Tính sai số chuẩn trung bình (sex) sex = 1/nRun × (SWL2 – (nRep – 1)/ nRep × SR2) Trong đó: nRun = 5, nRep = QC1:sex = (1,832–(5 –1)/5×1,662) = 0,483 QC2: sex = (7,212 – (5 – 1)/5×5,882)= 2,209 Bước 2: Sai số chuẩn giá trị đích (seRM) giả định vật liệu sử dụng QC Bước 3: Tính sai số chuẩn kết hợp (sec): seC = x se + se EM seRM = nên seC = sex QC1: seC = sex = 0,483 QC2: seC = sex = 2,209 Bước 4: Tính bậc tự kết hợp (dfC) dfx = nRun – = – = dfC = dfx = ( seC = sex) Bước 5: Cài đặt hệ số nhân với α = 0,05 bậc tự t1 - α/2.nSam,dfc = t1 - α/4,4 = t0.9875,4 = 3,50 Bước 6: Tính khoảng xác nhận (VI – Verification interval) 30 TCNCYH 128 (4) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC QC1: VI = 15,5 ± (3,50 × 0,483) = 15,5 ± 1,7 VI = 13,8 – 17,2 QC2: VI = 63,9 ± (3,50 × 2,209) = 63,9 ± 7,7 VI = 56,2 – 71,6 Như vậy, trung bình số liệu thực nghiệm mức QC1 (15,5) mức QC2 (64,9) nằm khoảng xác nhận Bảng Kết đánh giá độ QC1 QC2 0,483 2,209 0 0,483 2,209 4 3,50 3,50 13,8 – 17,2 (mIU/L) 56,2 – 71,6 (mIU/L) 15,5 (mIU/L) 64,9 (mIU/L) Đạt Đạt Sai số chuẩn TB (sex) Sai số chuẩn giá trị đích (seRM) Sai số chuẩn kết hợp (seC) Bậc tự kết hợp (dfC) Hệ số nhân Khoảng xác nhận Trung bình số liệu thực nghiệm Đánh giá IV BÀN LUẬN Chất lượng kết xét nghiệm tỷ lệ nghịch với mức độ sai số phòng xét nghiệm nghiệm Sai số ngẫu nhiên ước tính qua hệ số biến thiên (CV) sai số hệ thống ước tính qua độ lệch phương pháp định lượng Thực hành chất lượng tốt đòi hỏi phòng xét nghiệm phải có quy trình thẩm định xác nhận phương pháp truy nguyên theo hướng dẫn quốc gia quốc tế Nhiều phòng xét nghiệm giới áp dụng hướng dẫn CLSI cho việc xác nhận hiệu phương pháp.7 EP15 hướng dẫn xuất CLSI để xác nhận độ chụm độ quy trình định lượng EP15 trải qua bốn phiên phiên mới nhất, EP15A3 phát hành vào tháng năm 2014.4 Do cần thực thực nghiệm để đạt hai mục đích đánh giá độ chụm độ đúng, phiên EP15 (EP15A3) thân thiện với người dùng tốn thời gian so với TCNCYH 128 (4) - 2020 phiên trước Nghiên cứu tiến hành áp dụng hướng dẫn EP15A3 nhằm xác nhận phương pháp xét nghiệm sàng lọc sơ sinh bệnh suy giáp bẩm sinh kit thử hệ thống máy Perkin Elmer Kết bảng cho thấy hệ số biến thiên độ chụm chấp nhận Độ chụm ước tính QC1 11.8% nhỏ độ chụm công bố nhà sản xuất 20% Tương tự mức QC2, độ chụm ước tính 11.1% nhỏ 20% Trong trường hợp này, khơng cần tính giới hạn xác nhận cho độ chụm (UVL) Tuy nhiên, CV phòng xét nghiệm lớn CV nhà sản xuất cơng bố, cần tính giới hạn xác nhận so sánh CV phòng xét nghiệm với giới hạn Nếu CV phòng xét nghiệm nhỏ giới hạn xác nhận, độ chụm phương pháp đánh giá chấp nhận Việc sử dụng UVL CLSI khuyến cáo để tránh cho phòng xét nghiệm phải loại bỏ kết thực nghiệm đánh giá độ chụm cách khơng 31 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thích hợp xác suất lớn 5% CV phòng xét nghiệm lớn CV nhà sản xuất.4 Thực nghiệm đánh giá độ sử dụng kết thu thực nghiệm đánh giá độ chụm: phân tích mẫu QC hai mức nồng độ lặp lại lần lần chạy cho lần chạy với mức Độ đánh giá qua giá trị trung bình quan sát, khoảng xác nhận Theo hướng dẫn EP15 - A3 CLSI, giá trị trung bình nằm khoảng xác nhận độ xác nhận (hay độ lệch chấp nhận) Trong nghiên cứu chúng tôi, tất giá trị trung bình mức nồng độ QC nằm khoảng xác nhận tương ứng (bảng 4) Như vậy, kỹ thuật định lượng TSH mẫu máu thấm khô xác nhận độ Về đánh giá độ nghiên cứu này, sử dụng mẫu QC làm vật liệu nghiên cứu, với đại lượng tính tốn khoảng xác nhận mức QC khác Việc sử dụng giá trị trung bình mẫu QC mà nhà sản xuất cung cấp để tính tốn khoảng xác nhận hạn chế nghiên cứu IV KẾT LUẬN Xác định phương pháp định lượng TSH máu thấm khô kit Neonatal hTSH hãng Perkin Elmer hệ thống phân tích Victor2D đáp ứng độ chụm độ nhà sản xuất Lời cảm ơn Các tác giả xin cảm ơn Khoa Sinh hóa, Bệnh viện Nhi Trung ương hỗ trợ kỹ thuật cho triển khai nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Linnet K, Boyd JC Selection and analytical evaluation of methods – with statistical techniques In: Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, ediyors Tietz textbook of clinical chemistry 4thed Philadelphia: Sauders; 2006 International Organization for Standardization Medical laboratories: Particular requirements for quality and competence ISO 15189 International Organization for Standardization (ISO), Geneva; 2012 James O Westgard, PhD Basic Method Validation, 3rd Edition Westgard QC, Inc., Copyright ©2008; 19: 221 – 240 Clinical and Laboratory Standards Institute User verification of precision and estimation of bias; approved guideline - 3rd (ed) CLSI document EP15 - A3 Wayne, PA, USA: CLSI; 2014 Atilla Büyükgebiz (2013) Newborn Screening for Congenital Hypothyroidism J Clin Res Pediatr En docrinol 2013; 5(Suppl 1): - 12 Nguyễn Thu Nhạn, Phạm Bá Nhất Đánh giá kết sàng lọc bệnh suy giáp trạng bẩm sinh sau đẻ Hà Nội từ năm 2000 - 2003 Tạp chí nghiên cứu y học 2003; 26 (6):149 154 Srinivas Narasimhachar Chakravarthy, Satish Ramanathan, Smitha S, Thirumalai Nallathambi, et al EP15A3 Based Precision and Trueness Verification of VITROS HbA1C Immunoassay Ind J Clin Biochem Jan - Mar 2019; 34(1): 89–94 Summary APPLICATION OF CLSI EP15A3 GUIDELINE FOR VERIFICATION OF TSH MEASUREMENT METHOD IN NEWBORN SCREENING Analytical method verification is essential for laboratories before proceeding to patients’ samples testing The aim of this study was to verify the performance of TSH measurement in dry blood samples 32 TCNCYH 128 (4) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC on Perkin Elmer system for newborn screening of congenital hypothyroidism The Perkin Elmer’s Neonatal hTSH kit and quality control materials were used to conduct the assessment of precision and trueness on Perkin Elmer’s analyzer according to CLSI EP15 - A3 guidelines The laboratory CVs of two QC levels were 11.8 and 11.1 (%) respectively, lower than the manufacturer’s CVs (20%) The observed mean value of two QC levels were within the verification intervals The precision and trueness of this TSH assay were verified, consequently, it can be used for neonatal screening Keywords: congenital hypothyroidism, newborn screening, method verification, EP15A3 TCNCYH 128 (4) - 2020 33 ... bẩm sinh thực hệ thống máy này, cần phải xác nhận phương pháp trước đưa vào sử dụng Do đó, đề tài thực với mục tiêu: Áp dụng hướng dẫn EP15A3 CLSI xác nhận phương pháp định lượng TSH sàng lọc. .. nghiệm giới áp dụng hướng dẫn CLSI cho việc xác nhận hiệu phương pháp. 7 EP15 hướng dẫn xuất CLSI để xác nhận độ chụm độ quy trình định lượng EP15 trải qua bốn phiên phiên mới nhất, EP15A3 phát... EP15 (EP15A3) thân thiện với người dùng tốn thời gian so với TCNCYH 128 (4) - 2020 phiên trước Nghiên cứu tiến hành áp dụng hướng dẫn EP15A3 nhằm xác nhận phương pháp xét nghiệm sàng lọc sơ sinh