Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật tách chất và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu từ đa lượng đến vi lượng mà sắc ký cổ điển không đáp ứng được Ngày nay, kết hợp với một số các phương pháp sắc ký hiện đại khác như sắc ký khí, điện di, điện. Sự phát triển và ứng dụng của kỹ thuật phân tích hiện đại đã đi vào nhiều lĩnh vực trong cuộc sống: Công nghiệp, môi trường, vệ sinh an toàn thực phẩm, sinh học, hình sự,..đặc biệt là trong Y – Dược học.
Lựa chọn cơng nghệ nào? MỞ ĐẦU • Sắc ký lỏng hiệu cao kỹ thuật tách chất phân tích đồng thời chất hỗn hợp mẫu từ đa lượng đến vi lượng mà sắc ký cổ điển khơng đáp ứng • Ngày nay, kết hợp với số phương pháp sắc ký đại khác sắc ký khí, điện di, điện Sự phát triển ứng dụng kỹ thuật phân tích đại vào nhiều lĩnh vực sống: Công nghiệp, môi trường, vệ sinh an tồn thực phẩm, sinh học, hình sự, đặc biệt Y – Dược học • Cơ sở sắc ký lỏng cao áp HPLC dựa tương tác thành phần chất phân tích, pha tĩnh pha động Nội dung Nguyên tắc – Phân loại Máy sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Các thông số đặc trưng Kỹ thuật sắc ký HPLC Tối ưu hóa q trình sắc ký Ứng dụng sắc ký HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Nguyên tắc – phân loại Nguyên tắc – Phân loại 1.1 Nguyên tắc * HPLC kỹ thuật tách chất dựa tổ hợp nhiều trình vừa có tính chất hố học lại vừa có tính chất lý học Nó cân động xảy cột sắc ký pha tĩnh pha động, vận chuyển phân bố lại liên tục chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo lớp qua chất nhồi cột ( pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách * Thứ tự rửa giải chất khỏi cột phụ thuộc vào nhiều yếu tố Vì trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu cột, có chất tan bị lưu giữ Điều dẫn đến kết có q trình tách chất xảy cột sắc ký Flow of Mobile Phase I njector Detector T=0 T=10’ T=20’ Most I nteraction with Stationary Phase Least Các chất tách với thời gian lưu tương ứng CHẤT PHÂN TÍCH F1 F2 CỘT TÁCH PHA TĨNH PHA ĐỘNG F3 Ft = F1 + F2 + F3 1.2 Phân loại * Phân loại HPLC dựa vào kỹ thuật sắc ký Sắc ký phân bố Sắc ký hấp phụ lỏng-rắn Phân bố Sắc ký trao đổi ion Sắc ký loại trừ kích thước Trao đổi ion Sàng lọc Lựa chọn phương pháp sắc ký Lựa chọn kỹ thuật 102 Loại chất Kỹ thuật Pha tĩnh Pha động Neutrals Weak Acids Weak Bases Reversed Phase C18, C8, C4 cyano, amino Water/Organic Modifiers Ionics, Bases, Acids Ion Pair C-18, C-8 Water/Organic Ion-Pair Reagent Compounds not soluble in water Normal Phase Silica, Amino, Cyano, Diol Organics Ionics Inorganic Ions Ion Exchange Anion or Cation Exchange Resin Aqueous/Buffer Counter Ion High Molecular Weight Compounds Polymers Size Exclusion Polystyrene Silica Gel FiltrationAqueous Gel PermeationOrganic •THANK YOU… 6.2 Ứng dụng phân tích dược liệu Sắc ký lỏng cao áp có nhiều ứng dụng nghiên cứu hợp chất tự nhiên nói chung nghiên cứu dược liệu nói riêng Ưu điểm lớn sắc ký lỏng cao áp phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, khả phân tích rộng GC Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích chất từ chất phân cực tới khơng phân cực, từ chất bay tới chất không bay hơi, từ chất trung tính tới chất điện ly Tính linh hoạt sắc ký lỏng cao áp cao phương pháp khác nhờ chế tách, pha tĩnh pha động đa dạng, phong phú Với hiệu tách cao, khả phân tích rộng vậy, sắc ký lỏng cao áp lựa chọn ưu tiên phân tích hay điều chế chất Sắc ký lỏng cao áp thường sử dụng định lượng riêng lẻ chất hỗn hợp phức tạp dịch chiết dược liệu so sánh diện tích đỉnh với chất chuẩn điều kiện phân tích Có thể dễ dàng phân tích chất hỗn hợp mức ppm tới ppb, chí ppt Sắc ký lỏng cao áp quan tâm phân tích điểm chất hỗn hợp Với sắc ký điểm chỉ, người ta xác định nguốn gốc xuất xứ dược liệu, phân biệt dược liệu với loài tương cận, xác định nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu, xác định sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn hiệu… Nhiều nhà nghiên cứu sử dụng thiết bị ghép nối LC-MSNMR-CD để phân tích thành phần dịch chiết xác định cấu trúc chất hỗn hợp mà không cần tách riêng chất Phân lập chất tinh khiết (HPLC điều chế) Về nguyên tắc, sắc ký lỏng cao áp điều chế chia sẻ nguyên lý HPLC phân tích Điểm khác biệt hệ thống sử dụng cột sắc ký lớn hơn, với lượng pha tĩnh nhiều để phân tích nhiều mẫu chất tách khỏi cột thu lại để có chất tinh khiết Theo truyền thống, cột có đường kính lớn 4,7mm xem cột bán điều chế Các cột chế điều chế quy mơ phòng thí nghiệm có kích thước thay đổi từ – 10 cm Trong quy mô công nghiệp, cột sắc ký lỏng cao áp điều chế có đường kính tới 100 cm So với sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp có chi phí cao nên thường sử dụng trường hợp không tác phương pháp sắc ký cột thông thường hay MPLC Triển khai sắc ký ? Xây dựng quy trình phân tích chất nhóm chức phương pháp sắc ký lỏng cao áp Quy trình phân tích Xác định mục tiêu phân tích Chọn kỹ thuật xử lý mẫu Chọn cột tách phù hợp Chọn detecter thích hợp Chọn điều kiện sắc ký Đánh giá phương pháp phân tích QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU DƯỢC PHẨM Nghiền mịn, cân 20mg 20mg thuốc + metanol Lắc, siêu âm 15’ , lọc qua cartrig 0,45m Dung dịch 20mg/20ml BƠM MỘT PITTONG Có pitong lam ngọc, đường kính 3-4mm, dài khoảng 4cm, di chuyển xi lanh thép khơng gỉ, dung tích thay đổi tùy theo đường kính cột Lưu lượng dòng 0,02-2,00ml/phút 0,20-10,0ml/phút áp suất 6000psi Nhược điểm: Trong dòng chảy xuất xung BƠM ĐẦY NHANH Bơm có xi lanh dùng chung pitong Hoạt động: Khi Khi dung môi pha động vào cột, pittong di chuyển trái, pha động bơm vào cột, lúc pha động từ hệ cấp vào buồng bên phải Khi pittong di chuyển trở lại bên phải, lượng pha động buồng phải đẩy buồng trái với tốc độ lớn 100 lần so với tốc độ pha động vào cột Ưu điểm: Giảm xung chu kỳ làm đầy buồng bên trái BƠM ĐẨY KÉO Đây hệ thống kết nối bơm pittông Hai bơm nối đầu với nhau, đường pha động vào đường đến cột chung Khi pitong bơm bên trái tiến lên đẩy pha động vào cột, đồng thời pittong bơm bên phải hút pha động từ hệ cấp vào đầy bơm Sau đó, pittong bơm bên phải tiến lên đẩy pha động vào cột, đồng thời kéo pittong bơm bên trái lùi lại lấy pha động vào Quá trình đẩy kéo diễn liên tục ... sắc ký lỏng cao áp HPLC dựa tương tác thành phần chất phân tích, pha tĩnh pha động Nội dung Nguyên tắc – Phân loại Máy sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Các thông số đặc trưng Kỹ thuật sắc ký HPLC Tối ưu... trình sắc ký Ứng dụng sắc ký HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Nguyên tắc – phân loại Nguyên tắc – Phân loại 1.1 Nguyên tắc * HPLC kỹ thuật tách chất dựa... Sử dụng pha đảo tách vitamin tan dầu Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Cấu tạo máy HPLC 13 Cấu tạo máy HPLC Pha động Bơm Hệ tiêm mẫu Cột Detecter Máy tính 2.1