bai giang sac ky long hieu nang cao hplc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật tách chất và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu từ đa lượng đến vi lượng mà sắc ký cổ điển không đáp ứng được Ngày nay, kết hợp với một số các phương pháp sắc ký hiện đại khác như sắc ký khí, điện di, điện. Sự phát triển và ứng dụng của kỹ thuật phân tích hiện đại đã đi vào nhiều lĩnh vực trong cuộc sống: Công nghiệp, môi trường, vệ sinh an toàn thực phẩm, sinh học, hình sự,..đặc biệt là trong Y – Dược học.

Lựa chọn công nghệ nào?

MỞ ĐẦU

• Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật tách chất và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu từ đa lượng đến vi lượng mà sắc ký cổ điển không đáp ứng được

• Ngày nay, kết hợp với một số các phương pháp sắc ký hiện đại khác như sắc ký khí, điện di, điện Sự phát triển và ứng dụng của kỹ thuật phân tích hiện đại đã đi vào nhiều lĩnh vực trong cuộc sống: Công nghiệp, môi trường, vệ sinh an toàn thực phẩm, sinh học, hình sự, đặc biệt là trong Y – Dược học

• Cơ sở của sắc ký lỏng cao áp HPLC dựa trên sự tương tác của các thành phần chất phân tích, pha tĩnh và pha động

Nguyên tắc – Phân loại

Nguyên tắc – phân loại

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)

1.1 Nguyên tắc

* HPLC là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình

vừa có tính chất hoá học lại vừa có tính chất lý học Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển

và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột ( pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách

* Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào nhiều yếu tố Vì thế

trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan bị lưu giữ ít Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình tách các chất xảy ra trên cột sắc ký.

1 Nguyên tắc – Phân loại

Các chất được tách ra với thời gian lưu tương ứng

T=0

T=10’

T=20’

Most I nteraction with Stationary Phase Least

Flow of Mobile Phase

T=0

T=10’

T=20’

Most I nteraction with Stationary Phase Least

Flow of Mobile Phase

CỘT TÁCH

PHA TĨNH

CHẤT PHÂN TÍCH

PHA ĐỘNG

F3

Ft = F1 + F2 + F3

* Phân loại HPLC dựa vào kỹ thuật sắc ký

Pha tĩnh được nhồi trong cột

Pha động ở trạng thái lỏng: Các dung môi, hỗn hợp dung môi hoặc nước

* Phân loại HPLC dựa vào vật liệu nhồi

 Pha thông thường (Normal phase): vật liệu nhồi là silica đơn giản

 Trao đổi ion: silica biến tính (modified silica)

 Pha đảo (reverse-phase): silica biến tính

Silica biên tính C18

Silica Backbone Quaternary Amine anion exchanger Acetate counter ion

(Standard anion exchanger carries Cl - )

Sử dụng pha đảo trong tách các vitamin tan trong dầu

Cấu tạo máy HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)

2.1 Pha động (Dung môi)

 Có một hoặc nhiều bình chứa dung môi ( Thể tích 500 ml)

 Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và cặn trong dung môi giảm độ rộng

của peak (band spreading) và ảnh hưởng đến chất lượng detector

 Đuổi khí hòa tan trong dung môi bằng khí trơ (sparger)

 Lựa chọn chế độ tách rửa (elution) cho dung môi

 Trang bị các loại valves tỷ lệ (proportionating valves) cho phép đưa

dung môi từ hai bình chứa với các lưu lượng thay đổi liên tục

2.1.1 YÊU CẦU VỚI DUNG MÔI

• Nhiệm vụ: Cung cấp dung môi cho quá trình sắc ký,

đưa chất phân tích ra khỏi cột sắc ký

Polar Solvents

Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile

Non-polar Solvents

N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane

Độ phân cực của một số dung môi sử dụng trong HPLC

 Chủ yếu dựa vào sự phân cực của cấu tử phân tích, pha động, pha tĩnh

 Quy tắc chung: độ phân cực (polarity) của cấu tử cần phân tích và pha động là tương đương còn pha tĩnh có độ phân cực khác biệt → thời gian phân tích ngắn

 Khi độ phân cực của cấu tử và pha tĩnh quá giống nhau: tương tác mạnh giữa cấu tử cần phân tích và pha tĩnh  thời gian phân tích kéo dài

2.1.2 Lựa chọn dung môi

 Sử dụng một dung môi đơn giản có thành phần không đổi:

Tên dung môi Giới hạn dưới đo UV (nm) Chỉ số khúc

xạ Điểm sôi ( o C) Độ nhớt CP, 25 o C (Theo Snyder) Độ phân cực

• Ảnh hưởng của dung môi khác nhau

Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi thay đổi

• Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi

Tách một số các hợp chất hữu cơ

Chế độ chạy: Đẳng dòng Gradien

* Chương trình trộn dung môi ở áp suất thấp

DUNG MÔI 2

DUNG MÔI 3

BỘ PHẬN HÒA TRỘN

DUNG MÔI 1

2.1.4 Chương trình trộn dung môi

Ưu điểm: Chỉ dùng một bơm

Nhược điểm: Hệ thống 3 van lấy 3 dung môi phức tạp, chi phí ko cao

* Chương trình dung môi ở áp suất cao

BỘ PHẬN HÒA TRỘN

VAN MẪU

Ưu điểm: Độ đúng và độ lặp lại cao hơn

Nhược điểm: Tốn kém và cồng kềnh

2.2 Hệ thống bơm

* Yêu cầu hệ thống bơm

 Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào 5000psi trở lên

 Bơm lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 – 5ml/phút

 Có thể chịu được tác động của nhiều loại dung môi

* Nhiệm vụ: Để bơm pha động (dung môi rửa giả chất) qua cột tách

thực hiện quá trình sắc ký của các chất mẫu đã được nạp vào cột sắc ký

BƠM ĐẨY MỘT PITTONG BƠM ĐẦY NHANH BƠM ĐẨY KÉO

• Ảnh hưởng của tốc độ dòng

* Nguyên lý: Hệ bơm mẫu cho sắc

 Có thể thay thể sampling loops từ 5 l đến 500 l

 Sai số của lượng mẫu nạp dưới 1%

Tiêm mẫu tự động

Step 3

2 4 Cột tách

• Ảnh hưởng của kích thước hạt nhồi

• Ảnh hưởng của loại cột khác nhau

 Cột thông thường:

L = 10 – 30 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn

ID = 4 – 10 mm, kích thước hạt nhồi: 3, 5 và 10m 40.000 – 60.000 đĩa/m cột

 Cột tốc độ cao và hiệu quả hơn

L = 3 - 7 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn

ID = 1 – 4,6 mm, kích thước hạt nhồi: 3 hoặc 5 m 100.000 đĩa/m cột

* Nhiệm vụ: Tách các mẫu chất ra khỏi nhau

* Cấu tạo: Cột nhồi và cột bảo vệ

2.4.3 Ổn định nhiệt độ của cột (Column Thermostats)

 Phần lớn ứng dụng của HPLC được thực hiện ở nhiệt độ phòng

 Tuy vậy chất lượng của sắc ký đồ sẽ tốt hơn nếu duy trì nhiệt độ của cột không thay đổi (sai số < 0,05°C)

 Thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm lò gia nhiệt cho cột (Column heater) ổn định nhiệt độ ở gần 150°C với sai số < 0,05°C

 Trang bị hệ thống phun nước làm lạnh (water jackets fed) từ bể ổn nhiệt để khống chế chính xác nhiệt độ

 Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

* Nhiệm vụ: Phát hiện và đo nồng độ các chất phân tích theo tính chất hóa lý bằng cách chuyển các tín hiệu không điện thành tín hiệu điện

* Một số đặc điểm của detector trong HPLC

Loại Detecter Độ nhạy (mg/ml) tuyến tính Khoảng Đặc điểm Rửa giải gradient

+

Có thay đổi theo nhiệt độ và tốc

độ dòng Không dùng cho gradient, chỉ thích hợp với chất tan ion

-* Detector UV-VIS

Đây là loại được sử dụng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS ( bước sóng 190-800nm) của các chất phân tích

 3 cấu hình của detector hấp thụ UV-VIS

 Detector đo ở bước sóng cố định

 Detector đo ở bước sóng thay đổi

 Detector mảng diod UV-DAD

* Detecter huỳnh quang

 Sử dụng thiết bị huỳnh quang kính lọc hoặc quang phổ huỳnh

quang cho detector huỳnh quang

 Độ chọn lọc và độ nhạy có thể hơn đến 1000 lần detector hấp thụ UV

 Áp dụng: Hợp chất thơm đa vòng, dẫn chất quinolin, steroid, ancaloid

 Do độ nhạy cao nên sử dụng cho phân tích lượng vết, mẫu sinh

học, giám định pháp y,…

Khối phổ

 Phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định.

 Là một kỹ thuật cao, áp dụng cho phân tích được hầu hết các loại chất, chất bền nhiệt hay không bền nhiệt

 Độ nhạy cao, có thể phát hiện được chất có LOD < 1pg

2.6 Máy tính

• Thể hiện thời gian lưu của chất

• Tách chất và xác định hàm lượng của chất thông qua độ hấp thụ

Phổ UV

Sắc ký đồ

Các đại lượng đặc trưng HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)

1

2

3 4

5

mAU

time

6

Với CS   : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.

       CM  : nồng độ cấu tử trong pha động

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.

3.2

3.2 Thời gian lưu

tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột

tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết

tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử. 

Thông số quan trọng để

tách chất, tối ưu hóa quá

trình sắc ký

Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20.

3.4 Hiệu năng ( Số đĩa lý thuyết)

Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ

Với W 1/2 là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí ½ chiều cao pic (phút)

       W là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí đáy pic (phút)

Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách sắc ký của các cấu tử trên cột N càng lớn, hiệu năng tách càng cao. 

Hay

3.5 Độ chọn lọc

Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột

Giá trị chọn lọc luôn lớn hơn 1

Giá trị lớn hay nhỏ đều tác động đến quá trình tách sắc ký

3.6 Độ phân giải

Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó được xác định qua phương trình sau:

Kỹ thuật tách HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)

4 Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Sắc ký phân bố (partition chromatography)

 Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn

(adsorption or liquid-solid chromatography)

 Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)

 Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography)

VD: nguyên lý sắc ký trao đổi ion

(acide amine)

Sắc ký loại trừ kích thước

4.1 Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn

(adsorption or liquid-solid chromatography)

* Nguyên lý: Là quá trình hấp phụ chất phân tích trên bề mặt chất rắn Pha tĩnh là chất rắn phân cực Chất phân tích tranh chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh Lưu giữ chất phân tích bằng lực hấp phụ

* Ứng dụng: Các chất phân tích có khối lượng phân tử dưới

5000, ít tan trong nước hoặc trong hỗn hợp nươc-dung môi hữu cơ không thích hợp với sắc ký pha đảo Có thế mạnh trong việc tách các đồng phân vị trí các hợp chất hữu cơ, Phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm

4.2 Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)

* Nguyên lý: Dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích dương trên pha tĩnh hút anion chất tan Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích âm sẽ hút cation chất tan Chất trao đổi cation và anion là polymer không tan trong nước mang các nhóm trao đổi ion

* Ứng dụng: Dùng để tinh chế nguyên liệu loại tạp chất ; Tăng nồng độ các thành phần vi lượng trong dung dịch đủ để phân tích ; Áp dụng cho săc ký hiện đại

4.3 Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography)

* Nguyên lý: Sự tách ở đây dựa theo kích thước của phân tử của các chất mẫu được phân bố khác nhau vào trong các lỗ xốp của pha tĩnh Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui vào bên trong lỗ xốp của hạt pha tĩnh nên được rửa giải ra sau Các phân tử có kích thước lớn nằm ở ngoai nên được rửa giải ra trước

* Ứng dụng: Tách các mẫu có khối lượng phân tử lớn: polyme, protmaauxo enzyme, xenlulo,

* Nguyên lý: Sự tách loại săc ký này tuân theo các quy luật phân bố của chất tan giữa 2 pha không trộn lẫn là pha động và lớp màng pha tĩnh

* Ứng dụng: Sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion

có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000)

4.4 Sắc ký phân bố

4.4.1 Chọn pha tĩnh và pha động:

 Với pha tĩnh: Dựa vào nhóm thế R của dẫn chất siloxan

 Với pha động: Dựa vào độ phân cực, độ nhớt, giới hạn đo,…

 Với chất phân tích: Dựa vào nhóm chức

Hydrocacbon mạch thẳng < olefin < hydrocacbon thơm < dẫn chất halogen < sunfid < ete < dẫn chất nitro < este ≈ andehyd ≈ xeton < ancol

≈ amin < sunfo < sunfoxid < axit cacboxylic < nước

Pha tĩnh

Mặc dầu có nhiều lý thuyết nghiên cứu về việc sử dụng pha đảo nhưng phần lớn các chương trình

HPLC pha đảo đều thu được từ phương pháp thử và sai (by trial

and error).

* SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT và sắc ký pha đảo – SKPĐ

* Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha

động Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực

SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.

* SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít

phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực

4.4.2 Phân loại

4.4.3 Sắc ký pha đảo

a, Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo  

* Nhiệm vụ: Tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích

* Yêu cầu:

+ Phải trơ và bền dưới tác dụng của các điều kiện môi trường sắc ký, không

có các phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích, đảm bảo cơ chế tách theo đúng bản chất của pha tĩnh và không làm mất chất phân tích cần tách

+ Có tính chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất định của hệ pha HPLC

+ Tính chất bề mặt phải ổn định, độ xốp không bị biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rã dưới áp suất cao của quá trình sắc ký

+ Cân bằng động học của sự tách sắc ký phải xẩy ra nhanh, thuận nghich và lặp lại tốt

+ Cỡ hạt tương đối đồng nhất để cột tách có hiệu lực tách cao

Pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

 Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography)

 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

Sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng

* Phân loại

 Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.

 Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng

* Thành phần cấu tạo

Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo HPLC chính là chất nhồi cột, nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, diện tích bề mặt riêng lớn

 Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt

này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm)

được xử lý (thủy phân) bằng cách đun

nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai

ngày để tạo ra những nhóm SiOH như

sau (thông thường chỉ có khoảng 8

µmol SiOH/m2 bề mặt)

 Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.

Bề mặt silica đã thủy phân

• Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như  không phân cực hoặc ít phân  cực Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl Người

ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên sử dụng nhiều nhất

Cấu trúc của cột ODS

Không sử dụng được trong môi trường quá acid (pH < 2) hoặc trong môi trường bazơ (pH > 7)