Kỹ thuật sắc ký Hóa phân tích

Metanol 205 1,326 65 0,54 5,1b, Tính cân đối của píc sắc ký Cần chọn cột và pha động thích hợp để tránh pic bị kéo đuôi hoặc đổ đầu → Sắc ký hấp phụ pha đảo RP-HPLC sử dụng phổ biến tron

Kỹ thuật trong sắc ký

Bài 1 Sắc ký pha thuận và pha đảo ( thuộc sắc ký phân bố)

a, Chọn pha tĩnh và pha động:

Trong sắc ký có 3 thành phần tương tác với nhau: Pha tĩnh, pha động và chất phân tích

Để phân tích được chất cần lực chọn điều kiện để cân bằng tương tác giữa 3 thành phầnnày Người ta dực chủ yếu vào lực tương tác

- Với pha tĩnh: Dựa vào nhóm thế R của dẫn chất siloxan

- Với pha động: Dựa vào độ phân cực, độ nhớt, giới hạn đo,…

- Với chất phân tích; Dựa vào nhóm chức

Hydrocacbon mạch thẳng < olefin < hydrocacbon thơm < dẫn chất halogen < sunfid <ete < dẫn chất nitro < este ≈ andehyd ≈ xeton < ancol ≈ amin < sunfo < sunfoxid < axitcacboxylic < nước

Tính chất của 1 số dung môi dùng trong sắc ký lỏng

Tên dung môi Giới hạn dưới

đo UV (nm)

Chỉ số khúc xạ

Điểm sôi ( o C)

Độ nhớt

CP, 25 o C

Độ phân cực (Theo Snyder)

Metanol 205 1,326 65 0,54 5,1

b, Tính cân đối của píc sắc ký

Cần chọn cột và pha động thích hợp để tránh pic bị kéo đuôi hoặc đổ đầu

→ Sắc ký hấp phụ pha đảo RP-HPLC( sử dụng phổ biến trong hóa Dược)

• Pha tĩnh trong hệ RP-HPLC

Cũng như sắc ký cột ở áp suất thường, pha tĩnh (stationary phase) trong HPLCchính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích Nó lànhững chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt 3-7µm, diện tích bề mặt

riêng thường từ 80-500m2 /g Pha tĩnh trong HPLC là một yếu tố rất quan trọng quyếtđịnh sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu phân tích.

Trong RP-HPLC thì pha tĩnh là vật liệu kém phân cực, thông thường chất mang trong phatĩnh là các loại silica trung tính đã được thế hoá bề mặt bằng các loại hợp chất kém phâncực như C18 , C8, Pha tĩnh này thường dùng để tách các hợp chất hữu cơ có độ phân cựckhác nhau Khi tiến hành chạy sắc ký trên bề mặt pha tĩnh xảy ra các cân bằng động nhưsau:

MXi chất phân tích trong pha động

Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC) là phương pháp được dùng phổ biến nhất trong quátrình tách phân tích và điều chế các hợp chất đang được quan tâm trong các đối tượngsinh học, hoá học, dược học và y học Hệ RP-HPLC có các ưu điểm nổi trội sau:

1 Có độ linh động và độ chọn lọc cao

2 Có khả năng cân bằng nhanh, cột có hiệu lực cao, các pic cân đối

3 Pha động là nước hay hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thân thiện với môitrường

• Pha động trong RP- HPLC

Pha động thường là các dung môi phân cực như H2O, MeOH, ACN,…hay hỗn hợp của 2hay 3 dung môi này theo những tỷ lệ nhất định Các dung môi hữu cơ trên có thể hoà tanthêm một lượng nhỏ axit hay bazơ hữu cơ

Pha động có độ phân cực gần giống với độ phân cực của chất phân tích thì thời gian lưucủa chất càng ngắn Các yếu tố cần được quan tâm và lựa chọn cho mỗi hệ pha đó là:

1 Bản chất pha động: Thành phần của chất tạo ra pha động, loại dung môi sử dụng,

pH của pha động

2 Tốc độ pha động

→ Sắc ký hấp phụ pha thuận NP-HPLC:

Thành phần pha tĩnh và pha động ngược lại với RP-HPLC

● Pha tĩnh: Là các chất phân cực như triethylen, glycol, nước

● Pha động: Dung môi ít phân cực như hexan, iso propyl ether

Như vậy trong sắc ký pha thuận, chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng độphân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần Trong sắc ký pha đảo thì ngược lại, cácchất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha động, thời gianlưu tăng lên

Ứng dụng: Phân tích dược phẩm, y học, môi trường,….

+ Dược: Kháng sinh, các chất hiamr đau, an thần, steroid

+ Hóa sinh: Aminoaxit, protein, lipit, cacbohydrat,

+ Thực phẩm : Chất làm ngọt, chất phụ gia, chất chống oxy hóa, aflatoxin

+ Hóa công nghiệp : Hợp chất thơm, chất màu, hoạt động bề mặt

+ Môi trường : Các chất trừ sâu, thuốc diệt cỏ, dẫn chất phenol, PCB, PAH

+ Hóa pháp lý : Các chất độc, thuốc ngủ, rượu trong máu,

+ Y học lâm sàng : Các chất chuyển hóa trong cơ thể, dịch sinh học

Bài 2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

1 Nguyên tắc

TLC là phương pháp sắc kí tách hỗn hợp chất bằng cách cho pha động di chuyểnqua pha tĩnh.Chất hấp phụ (pha tĩnh) được rải đều thành lớp mỏng trên tấm kính hoặc

tấm kim loại Trong quá trình chuyển động qua lớp chất hấp phụ, nhờ các quá trình hấpphụ và giải hấp được lặp đi lặp lại nhiều lần, do hệ số phân bố khác nhau các cấu tử dichuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau Từ đó thuđược một sắc đồ trên lớp mỏng.

2 Pha tĩnh:

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30µm được rải đều và kết dínhthành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ Bản mỏng có kích thướckhác nhau 5-20cm, có đưa thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh đểphát hiện chất phân tích

3 Pha động

Pha động cho TLC thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường sức rửa giảithường kết hợp 2 dung môi, nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa 2 phaYêu cầu: - Dung môi cần có độ tinh khiết cao

- Điều chỉnh sức rửa giải pha động dể Rf trong khoảng 0,2-0,8 đạt độ phân giảicực trị

- Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung môi phân cực

- Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ khác, độ phân cực của pha động sẽquyết định tốc độ di chuyển của chất phân tíchvà trị số Rf của chúng, nếu them1ít dung môi ít phân cực vào dung môi không phân cực sẽ làm tăng trị số Rf

- Sức rửa giải của dung môi trong sắc ký lỏng hấp phụ có thể sử dụng cho TLCvới pha tĩnh là silica hoặc alumina

4 Kỹ thuật TLC

- Chuẩn bị bản sắc kí

- Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng

- Khai triển sắc ký với pha động phù hợp

nhỏ chất trơ để kết dính, như calcium sulfate (thạch cao), và nước Hỗn hợp này đượctrải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa.Bản sắc kí này sẽ được để khô và kích hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30phút ở nhiệt độ 110°C Độ dày của lớp hấp phụ thường là 0,1-0,25 mm cho hóa họcphân tích, và khoảng 1-2 mm cho sắc kí lớp mỏng điều chế Trong mọi kĩ thuật sắc kíđều bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh.

b) Kỹ thuật

Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc kí bằng một ốngmao quản, khoảng 1 cm từ dưới lên Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một dung môithích hợp và được đặt vào trong một vật chứa có nắp Dung môi di chuyển lên bản sắc

kí bởi mao dẫn, gặp phải mẫu phân tích và dịch chuyển các cấu tử của mẫu lên bản sắc

kí Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau dochúng có ái lực khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung môi

Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để cóđược chỗ liên kết với pha tĩnh Thí dụ, nếu silicagel được dùng như pha tĩnh, nó đượcxem là phân cực Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tínhphân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết với silicagel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩypha động ra khỏi các chỗ liên kết Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di

chuyển lên cao hơn trên bản sắc kí (kết quả là hệ số lưu Rf sẽ lớn hơn) Nếu pha độngđược thay bằng một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ

có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silicagel, và tất cả các hợp chấttrên bản sắc kí sẽ dịch chuyển lên cao hơn Thay đổi độ phân cực của pha động sẽkhông làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc kí Nếu muốn có mộtthứ tự ngược lại trên bản sắc kí, một pha tĩnh không phân cực sẽ được sử dụng, như làC18 – biến tính silica

Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có tínhphân cực khác với pha tĩnh Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫuthử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệtkhác nhau có thể trộn lẫn vào nhau Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu,

dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực mộtphần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại.

Có 3cách khai triển chủ yếu:

Soi dưới đèn UV, dùng thiết bị densitometer

5 Các đại lượng đặc trưng của TLC

a, Thời gian lưu(t):

b, Hệ số dung lượng( k’):

R

R M d

d d

III

X1 X2

X Tuyến dung môi

Tuyến xuất phát Hỗn hợp chất

phân tích

Rr = =

Giá trị Rr có thể lớn hơn hoặc bé hơn đơn vị Cần chọn chất chuẩn thế nào để giátrị Rr càng gần 1 càng tốt vì lúc đó các điều kiện sắc kí có thể coi hoàn toàn đồng nhất

d, Hệ số phân chia

Đế đặc trưng cho khả năng phân chia có thể dùng hệ số phân chia

Nếu S = 1 tức là K1 = K2 thì sự phân chia của hai chất này trên lớp mỏng là nhưnhau dẫn đến không tách chúng ra khỏi nhau được, khi đó phải thay đổi thành phần hệdung môi hay thay hệ dung môi khác Khi đó nếu hai chất vẫn chưa tách ra khỏi nhauthì thay bằng chất hấp phụ khác

Nếu S ≠ 1 tức K1≠ K2 thì có thể tách chất I ra khỏi chất II

e, Chiều cao đĩa H

W N

d H

Quá trình sắc kí lớp mỏng có thể thực hiện theo nhiều cơ chế khác nhau:

- Cơ chế hấp phụ (chất rắn có ái lực lớn làm pha tĩnh)

Cơ chế phân bố (chiết: pha tĩnh là một chất rắn tẩm một dung môi nào đó thường là dung môi hữu cơ không trộn lẫn với nước và pha động với dung môi lànước)

- Cơ chế trao đổi ion (lớp mỏng được điều chế từ ionit nghiền mịn)

- Cơ chế rây phân tử (sự phân chia do các chất với phân tử lượng nhỏ, kích thướckhác nhau chui qua các lỗ rây của một số chất cao phân tử có cấu trúc đặc biệt)

Trong thực tế thường có sự phối hợp cả 4 phương pháp trên

7 Ưu - nhược điểm của phương pháp

● Nhược điểm: Áp lượng kém cho phân tích vi lượng

Độ lặp lại thấp do thành phần pha động thay đổi trong quá trình khai triển sắc kí

Tăng giãn rộng píc do khuyếch tán vì tốc độ dòng pha động thấp

+ Khi pha tĩnh phân cực sẽ ưu tiên hấp phụ cấu tử phân cực hơn các cấu tử không phâncực

+ Khi pha tĩnh và cấu tử đều phân cực, cấu tử sẽ bị hấp phụ trong dung môi không phâncực mạnh hơn trong dung môi phân cực

* Các loại lực hấp phụ: Lực Vanderwaals: Lực vật lý

Hấp phụ hóa học: Hình thành lien kết hóa học

Liên kết hidro: Hình thành liên kết hidro

+ Không tương tác hóa học với chất càn tách, không có hoạt tính xúc tác

+ Tính chọn lọc cao, tức là có ái lực hấp phụ với các cấu tử trong mẫu khác nhau nhiềucàng tốt

+ Diện tích bề mặt riêng và kích thước hạt phải phù hợp Ví dụ khi Rf lớn có thể dùng

cỡ hạt thô và ngước lại

+ Độ ổn định cao nhằm thu được kết quả trùng lặp

Các chất hấp phụ thường gặp: Silicagel ( SiO2.xH2O) , nhôm oxit (Al2O3 ), than hoạttính, điatonit,…

1.3.2 Chọn dung môi ( pha động) – pp rửa giải

• Yêu cầu

+ Hòa tan tương đối tốt tất cả các cấu tử trong mẫu

+ Bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh

+ Không phản ứng hóa học với cấu tử trong mẫu và chất hấp phụ

+ Độ tinh khiết của dung môi

Thông thường rửa liên tiếp bằng các dung môi có khả năng giải hấp cấu tử phân tích tăng dần

Có thể chọn dung môi theo dãy elutrop sau

1.4 Cột sắc ký

+ Vật liệu làm cột: Thuỷ tinh, thép , nhôm, đồng,

nhựa,…

+ Cột không quá ngắn, không quá dài, thông

thường chiều dài gấp 40 – 100 lần

+ Dùng phương pháp đi lên hoặc đi xuống để tách,

có hoặc không có tạo áp suất chân không, áp suất

cao

1.5 Lấy mẫu và phân tích mẫu

+ Phân tích trực tiếp các lớp trên cột+ Phân tích dung dịch chảy ra khỏi cột: Đochỉ số khúc xạ, mật độ quang, độ dẫn điện,

+ Rây vô cơ: Silicagen xốp, thủy tinh xốp, zeolite…

+ Rây hữu cơ: Polivinyl axetat, polistirol, dextran mạng, ankyl hóa…

Yêu cầu + Có khả năng tách được các chất có trọng lượng phân tử trong vùng cần phân

tích Có tính ổn định, độ bền cơ học tốt, bền nhiệt, độ trương nhỏ

+ Cần làm mất khả năng hấp phụ pha tĩnh bằng cách xử lý hóa học hoặc hấpphụ bằng dung môi phân cực

2.3 Pha động

Việc chọn dung môi chủ yếu phụ thuộc vào tính tan của hỗn hợp tách và loại detecter sửdụng

2.4 Cột sắc ký

3 Sắc ký trao đổi ion

3.1 Nguyên tắc và phân loại ionit

3.1.1 Nguyên tắc:

+ Sắc ký trao đổi ion dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên phatĩnh Nhóm mang điện tích dương trên pha tĩnh hút anion chất tan, nhóm mang điện tích

âm hút cation chất tan

+ Ionit: Chất trao đổi cation và chất trao đổi anion là polymer không tan trong nướcmang các nhóm trao đổi ion được gọi là chất trao đổi ion hoặc nhựa trao đổi ion (ionit).Ionit là các đại phân tử axit hoặc bazo không tan trong nước và các dung môi hữu cơ,chứa trên mạng lưới những ion linh động có khả năng trao đổi theo đương lượng vàthuận nghịch với các ion cùng dấu trong dung dịch chất điện ly

3.1.2 Phân loại ionit:

Nhựa trao đổi ion ( ionit) là vật liệu polymer có chứa các nhóm ion

+ Khi ion trao đổi mang điện tích dương gọi là cationit: HR, NaR, CaR2 , MgR2,

Nhựa cationit : Loại axit mạnh mang nhóm acid sulfonic (RSO3-H+), loại yếu mangnhóm acid carboxylic (R-COOH)

+ Khi ion trao đổi mang điện tích âm gọi là anionit : ROH, RCl, R2CO3, R2SO4

Nhựa anionit: Có nhóm bazơ amin liên kết với phân tử polymer Chất trao đổi bazơmạnh có nhóm amin bậc bốn RN(CH3)3+OH- , dạng bazơ yếu có nhóm amin bậc haihoặc bậc 3

+ Ionit lưỡng tính : Có khả năng trao đổi cả khả năng trao đổi cả ion dương và âm cùngmột lúc

+ Ionit vô cơ thiên nhiên ( zeolit, đất sét, gluconit) , ionit vô cơ tổng hợp ( nhómpermutit, nhóm zeolit)

+ Ionit hữu cơ thiên nhiên (xelulo, than bùn, than nâu, ), ionit hữu cơ tổng hợp ( ởcationit: -SO3H, -SO3Na, ở anionit : - NH2, =NH, ≡N )

Cấu tạo : + Nguyên liệu chế tạo nhựa trao đổi ion: Copolymer styrene và divinylbenzen

Divinylbenzen là cầu nối, lien kết ngang giữa các mạch thẳng polymer Hàm lượng của

nó thay đổi trong khoảng 1-16% Vòng benzen có gắn các nhóm chức khác nhau sẽbiến copolymer thành chất trao đổi anion hoặc cation

(Bảng thống kê một số nhóm hoạt động của nhựa trao đổi ion ( SGT ))

3.1.3 Cơ chế trao đổi ion

Mạng lưới của ionit là mạng không gian cao phân tử không đồng đều của các mạch liênkết hidrocacbon Khả năng trao đổi ion của ionit phụ thuộc rất lớn vào mạng lưới cấutrúc của ionit : Mức liên kết ngang, số lượng và bản chất các nhóm chức

Ví dụ : Tính ưa nước của của ionit được quyết định bởi cấu trúc của nó, khả năngtrương trong nước cho phép các ion từ dung dịch khuếch tan nhiều hay ít bên trongmạng lưới

Khi ngâm nhựa vào nước, nhựa trương nở, các nhóm chứa ion trở nên linh động hơn và

có thể bị phân li 1 phần, các phản ứng trao đổi xảy ra giữa các ion pha tĩnh và các iontrong dung dịch, khi dung dịch chứa nhiều ion cùng có khả năng trao đổi ion với nhựathì sẽ có sự cạnh tranh giữa các ion trong dung dịch và quá trình trở nên phức tạp

3.2 Độ lựa chọn và các yếu tố ảnh hưởng

+ Độ lựa chọn biểu thị ái lực của ion này so với ion khác đối với ionit

AR + B+ ↔ BR + A+

2AR + B2+ ↔ BR2 + 2A+

Độ lựa chọn được biểu thị qua hệ số lựa chọn K

Dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch chất nghiên cứuvới các ion gắn trên cột

Khảo sát nhựa R-Li+ trao đổi cation với Na+

R-Li+ + Na+ ↔ R-Na+ + Li+

Áp dụng định luật tác dụng khối lượng:

[ ][ ] [ − +][ ]+

+ +

−

=

Na Li R

Li Na R K

K được gọi là hệ số lựa chọn , đánh giá tính chọn lọc tương đối của nhựa trao đổi cationvới Li+

Thứ tự ưu tiên khi trao đổi

Đối với nhựa cationit axit mạnh :

Fe3+ > Al3+ > Ca2+ > Mg2+ > K+ > H+ > Li+

Đối với nhựa cationit axit yếu:

H+ > Fe3+ > Al3+ > Ca2+ > Mg2+ > K+ > Na+ > Li+

Đối với nhựa anionit kiềm mạnh và nhựa anionit kiềm yếu

Ở hàm lượng ion thấp nhiệt độ bình thường và những ion cùng hóa trị , khả năng trao đổităng khi số điện tử cỉu ion trao đổi lớn ( bán kính hydrat hóa lớn)

Ở hàm lượng ion cao, khả năng trao đổi của các ion không khác nhau nhiều

+ Độ lựa chọn phụ thuộc : Cường độ axit, bazo của nhóm chức, lực ion, nồng độ dungdịch chất điện ly, tính chất của ion bị hấp phụ, nhiệt độ, áp suất,…

3.3 Tốc độ trao đổi ion