Hóa phân tích Đại cương về sắc ký

Đại Cương Về Sắc Ký Mục tiêu - Trình bày được định nghĩa sắc ký, các giai đoạn của quá trình sắc ký, phân loại sắc ký, hai yếu tố chủ yếu quyết định quá trình tách sắc ký, nguyên tắc củ

Đại Cương Về Sắc Ký

(Chromatography)

PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Đại Cương Về Sắc Ký

Mục tiêu

- Trình bày được định nghĩa sắc ký, các giai đoạn của quá trình sắc ký, phân loại sắc ký, hai yếu tố chủ yếu quyết định quá trình tách sắc ký, nguyên tắc của sắc ký hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử, ái lực

- Giải thích được ý nghĩa của các thông số sắc ký

- Ứng dụng được cách định tính, định lượng bằng phương pháp sắc ký

Đại Cương Về Sắc Ký

Dàn bài

- Lịch sử - Định nghĩa

- Quá trình sắc ký

- Phân loại các phương pháp sắc ký

- Sự tách sắc ký và sắc ký đồ

- Các thông số đặc trưng của sắc ký

- Ứng dụng của sắc ký

t0 t1

 1906: Mikhail Tswett – sắc ký lỏng

hấp phụ trên cột

 1938: Izmailov & Schraiber – xây

dựng phương pháp SKLM

 1958: Stahl – hoàn thiện phương

pháp SKLM

 1941: Martin & Synge – đặt nền tảng

cho sắc ký phân bố: SKG và SKK

 1952: Martin & James – bài báo đầu

tiên về SKK

 Cuối năm 1960: sắc ký lỏng cao áp

ra đời

 1937 – 1972: 12 giải Nobel về sắc ký

 Đầu năm 2005: sắc ký lỏng siêu áp

 2012: Sắc ký hội tu siêu hiệu năng

Lịch sử - Định nghĩa

 Qui trình trong đó chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển khác nhau về động lực học của chúng trong một hệ thống hai hay nhiều pha Một trong các pha này chuyển động một cách liên tục theo một hướng nhất định và trong pha này các chất riêng biệt thể hiện linh độ khác nhau là

do có sự khác nhau về phân bố, hấp phụ, điện tích, kích thước phân tử, độ hòa tan và áp suất hơi

 Sắc ký đòi hỏi hai pha:

 Pha động: lỏng, khí, lỏng siêu tới hạn

 Pha tĩnh: cố định trong cột hay trên bề mặt chất mang rắn trơ hóa học

 Chất rắn hay chất lỏng được tẩm, hấp phụ hay liên kết hóa học chất mang

 Tương tác với chất tan theo các cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, ái lực

 Phương pháp sắc ký được áp dụng trong các ngành khoa học khác nhau

 Ngành Dược: nghiên cứu, phân tích, kiểm nghiệm thuốc

Quá trình sắc ký

 Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh

 Khai triển sắc ký

 Sắc ký khai triển

 Sắc ký rửa giải:

 Quá trình rửa giải

 Dung môi rửa giải (eluent)

 Dung dịch rửa giải (eluate)

 Phát hiện các chất

 Màu của chất

Phân loại các phương pháp sắc ký

 Theo bản chất vật lý các pha

Tên kỹ thuật Pha tĩnh Loại cân bằng

Sắc ký lỏng (liquid

chromatography): pha

động là chất lỏng

- Chất lỏng được hấp phụ trên 1 chất rắn (chất mang)

- Pha liên kết

chromatography, GC):

pha động là chất khí

- Chất lỏng được hấp phụ trên chất rắn

- Pha liên kết

hạn (supercritical fluid

chromatography, SFC):

pha động là chất lỏng

siêu tới hạn

- Pha liên kết - Phân bố giữa pha lỏng

siêu tới hạn và pha liên kết

Phân loại các phương pháp sắc ký

 Theo phương cách cho pha động đi qua pha tĩnh

 Sắc ký khai triển

 Sắc ký rửa giải

 Theo phương cách lưu giữ pha tĩnh

 Sắc ký cột

 Sắc ký lớp mỏng

 Sắc ký giấy

Phân loại các phương pháp sắc ký

 Theo bản chất của quá trình sắc ký

 Sắc ký hấp phụ

 Sắc ký phân bố

 Sắc ký trao đổi ion

 Sắc ký rây phân tử

 Sắc ký ái lực

 Sắc ký cặp ion

Phân loại các phương pháp sắc ký

 Thông thường

 Sắc ký cột (Column Chromatography, CC)

 Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC)

 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)

 Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC)

 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)

 Sắc ký lỏng siêu “hiệu năng” (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC), UHPLC hoặc UFLC (Ultra Fast Liquid Chromatography)

 Sắc ký hội tụ siêu “hiệu năng” (Ultra Performance Convergence Chromatography, UPCC, UPC2)

Cơ chế tách – Phân bố

Chất phân tích hòa tan trong pha tĩnh lỏng bao trên bề mặt chất mang rắn trơ

K

S1 (pha 1) <====> S2 (pha 2)

K: hệ số phân bố

1 ] [ 2 ] [

Chất phân tích

C

C

K KD: hệ số phân bố

biểu kiến

Cơ chế tách – Hấp phụ

n: số mol pha động bị thay thế từ bề mặt

S2 : phân tử chất tan trong pha động

S1 : phân tử chất tan bị hấp phụ

M2 : phân tử pha động

M1 : phân tử pha động bị hấp phụ : bề mặt hoạt động của pha tĩnh

S2 + nM1  S1 + nM2

n

n

M S

M

S K

] ][

[

] ][

[

1 2

2 1



- Pha động luôn chạy theo một chiều nhất định nên luôn xảy ra quá trình

hấp phụ và phản hấp phụ

- Các chất tan sẽ bị kéo theo pha động và có ái lực khác nhau với pha tĩnh

Chất tan hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh

Cơ chế tách – Trao đổi ion

Pha tĩnh là các chất trao đổi ion Gồm 2 loại:

 Nhựa trao đổi cation (cationit):

Cationit acid mạnh -SO3-H+

Cationit acid yếu -COO-H+

 Nhựa trao đổi anion (anionit):

Anionit base mạnh -N(CH3)3+OH

-Anionit base yếu -NH3+OH

-Tiến trình trao đổi: (Mx+ và Ax-: ion chất tan)

Cation: xRSO3-H+ + Mx+ (RSO3-)xMx+ + xH+

Anion: xRN(CH3)3+OH- + Ax- [RN(CH3)3+]xAx-+ xOH-

- Pha động thường là các dung dịch đệm có pH và chất điện ly thích hợp

- Pha động có thêm một số dung môi hữu cơ như MeOH, EtOH,…để làm tăng độ hòa tan hay độ chọn lọc cho chất tan  các ion chất tan cạnh tranh trên mạng ion

Ion phân tích

Ion trái dấu

Ionit

Điện tích cố định

Quá trình trao đổi ion

Cơ chế tách – Trao đổi ion

Sử dụng nhựa trao đổi ion để khử khống nước

Cơ chế tách – Rây phân tử

- Ở trạng thái cân bằng: Cs  Cm

Cs, Cm: nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động Hệ số K được tính theo phương trình:

s V

m

V R

V m

VS: thể tích dung môi giữa các lỗ

VR: thể tích bị lưu giữ của chất tan

- Sắc ký rây phân tử = Sắc ký lọc qua gel = Sắc ký thẩm thấu gel

- Dùng trong sinh hóa để tách các protein, các carbohydrat,…

Cơ chế tách – Aùi lực

- Mới và có tính chọn lọc cao

- Dựa vào tương tác đặc hiệu giữa một

loại phân tử chất tan với một phân tử thứ

hai liên kết cộng hóa trị với pha tĩnh

Ví dụ: phân tử liên kết cộng hóa trị với

pha tĩnh là một kháng thể của một

protein Khi cho hỗn hợp gồm hàng ngàn

protein qua cột, chỉ có một pretein phản

ứng với kháng thể được giữ lại trên cột,

các protein còn lại được rửa khỏi cột

Protein bị giữ lại trên cột sẽ được tách ra

khỏi kháng thể bằng cách thay đổi pH

hay nồng độ ion trong pha động

Sắc ký ái lực

Một phân tử tương tác với phân tử liên kết cộng hóa trị với pha tĩnh

Các phân tử khác được rửa khỏi cột

Quá trình tách sắc ký

Hai cách tách hai chất xen phủ

Sự tách sắc ký và sắc ký đồ

Nồng độ chất tan tại các dãi A và

Các thông số đặc trưng trong sắc ký

Để tách sắc ký được tốt:

 Tốc độ di chuyển của các chất tan

 Hiện tượng giãn pic

 Pic hẹp và cân đối

R M

- Rf = 0: chất tan hoàn toàn không di chuyển, nằm

tại điểm xuất phát

- Rf = 1: chất tan di chuyển cùng với vận tốc của

dung môi

- dR: khoảng di chuyển được của chất cần tách

- dM: khoảng di chuyển được của dung môi

- v: vận tốc di chuyển của chất cần tách

- V0: vận tốc di chuyển của dung môi

Tốc độ di chuyển của các chất

 Sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thời gian lưu t R (phút): thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi

tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ (tính từ

lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic)

 tM (hoặc to): thời gian lưu của

một chất không bị lưu giữ, còn

gọi là thời gian chết của cột

 tR càng lớn, chất tan bị lưu giữ

càng mạnh và tốc độ di chuyển

của nó càng nhỏ

 Thời gian lưu hiệu chỉnh t'R được

7 Van kiểm tra vào

8 Van kiểm tra ra

9 Khử xung

10 Đầu thải

11 Van xả

12 Mồi bơm

13 Lọc dung môi

14 Điều hòa áp suất

ngược

15 Chuyển đổi áp suất

16 Van tiêm mẫu

17 Cột bảo vệ + cột

sắc ký

18 Tới detector

Tốc độ di chuyển của các chất

Thời gian lưu

t’R = tR – tM

Hệ số dung lượng k’

tR = tM (1 + k’)

k’: bản chất các pha, chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột

2 < k’ < 10 (có thể chấp nhận đến 1 < k’ < 20)

Hệ số chọn lọc  =

B lưu giữ mạnh hơn A nên  > 1

1,05 <  < 2,00

K K

k k

t t

B A

B A

,

,

Diện tích pic, chiều cao pic

Hình dạng pic – Sự bất đối của pic

Đường cong phân bố chuẩn Gaussian

AC

BC

AF 

Hệ số đối xứng (0,8 < AF < 1,5)

BC: nửa chiều rộng phía sau của pic được đo ở

1/10 chiều cao của pic

AC: nửa chiều rộng phía trước của pic được đo ở

1/10 chiều cao của pic

Hệ số kéo đuôi (1/20 chiều cao)

AC

BC AC

A s

2





Hình dạng pic – Sự bất đối của pic

Hiệu lực cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến

2

2 / 1

2

54 , 5

t H

L

N: số đĩa lý thuyết biểu kiến H: chiều cao đĩa lý thuyết W: chiều rộng của pic ở đáy pic

W1/2: chiều rộng của pic đo ở nữa chiều cao

N tốt khi N gần bằng Nmax

p

d

L

Nmax  4000

L: chiều dài cột (cm)

dp: đường kính hạt pha tĩnh (m)

Hiệu lực cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến

Sắc ký đồ minh họa cách tính N

Sự giãn pic (peak spreading) – mở rộng dải (band broadening)

 Hiện tượng đặc biệt trong sắc ký

 Nghiên cứu qua thuyết về đĩa và thuyết động học

 Là kết quả di chuyển nhanh chậm khác nhau của các phân tử cùng một chất khi qua cột

 Pic ra muộn tù hơn pic ra sớm

 Cột sắc ký tốt (hiệu lực cao) sẽ cho pic nhọn (ít bị giãn)

Sự giãn pic và lý thuyết động học

Phương trình Van Deemter

Cu u

B A

Khuếch tán xoáy A

Khuếch tán dọc B

Chuyển khối C

Mối liên quan của H với các yếu tố động học

trong quá trình rửa giải:

 Khuếch tán chất tan khi di chuyển trong cột

 Thiết lập cân bằng theo tương tác: chất tan

– pha động – pha tĩnh

 Tốc độ của các quá trình tương tác diễn ra

trong cột

Khắc phục A

- Hạt pha tĩnh nhỏ

- Cột mao quản được bao pha tỉnh ở bề mặt bên trong

Sự giãn pic và lý thuyết động học

Phương trình Van Deemter

Cu u

B A

Khuếch tán xốy A

Sự giãn pic và lý thuyết động học

Phương trình Van Deemter

Cu u

B A

Sự giãn pic và lý thuyết động học

u

B A

Khắc phục C

- Cột mao quản bao một lớp pha tĩnh mỏng và đều

- Chất mang bao một lớp pha tĩnh mỏng và đều

- Tăng nhiệt độ cột  giảm độ nhớt pha động và

giảm quá trình chuyển khối

Pha tĩnh

Chất mang

Sự mở rộng dải do các nguyên nhân khác

Dòng chảy tầng

u: tốc độ dòng của pha động

DM: hệ số khuếch tán trong pha động

Aûnh hưởng của tốc độ dòng lên hiệu lực cột

(a) sắc ký lỏng

Tốc độ dòng (cm/s)

H

(mm)

(b) Sắc ký khí - lỏng

H (mm)

Tốc độ dòng (cm/s)

Aûnh hưởng của kích thước hạt nhồi cột

Aûnh hưởng của cỡ mẫu lên hiệu lực cột

HETP (mm)

g mẫu/g chất nhồi cột

Cột Spherisorb ODS

Độ phân giải

R s = 0,75: hai pic không tách tốt, còn xen

phủ nhau nhiều

R s = 1,0 : hai pic tách khá tốt, còn xen

phủ nhau 4%

R s = 1,5 : hai pic tách hoàn toàn (chỉ

xen phủ 0,3%)

Mối liên quan giữa R s – t R – H và k’

Rs là hàm

số của

k’(1+k’)

Aûnh hưởng của hiệu lực cột lên độ phân giải

Gia tăng hiệu lực cột

Aûnh hưởng của hiệu lực cột

lên độ phân giải trong trường

hợp hệ số chọn lọc không đổi

(a) Hiệu lực cột thấp

(b) Hiệu lực cột cao

Hiệu lực cột cao và hệ số chọn lọc giảm

(a) Hiệu lực cột tối đa với hệ số chọn lọc thấp

(b) Gia tăng hệ số chọn lọc và vẫn giữ hiệu lực cột tối đa

Độ phân giải

thể giảm tốc độ dòng pha động

- Tăng k' B : bằng cách thay đổi thành phần pha động (sắc ký lỏng), nhiệt

độ (sắc ký khí) k’B tăng sẽ tăng thời gian phân tích Để dung hòa Rs và

thời gian rửa giải : 2 < k’ B < 5

- Tăng  bằng cách thay đổi loại pha tĩnh hoặc thành phần pha động, kể cả pH Việc tăng  có ảnh hưởng mạnh đến Rs

 Định tính và thử tinh khiết

f

R M

- Rf = 0: chất tan hoàn toàn không di chuyển,

nằm tại điểm xuất phát

- Rf = 1: chất tan di chuyển cùng với vận tốc của

dung môi

- dR: khoảng di chuyển được của chất cần tách

- dM: khoảng di chuyển được của dung môi

- v: vận tốc di chuyển của chất cần tách

- V0: vận tốc di chuyển của dung môi

Ứng dụng của sắc ký

- Sử dụng chất đối chiếu

OX OF OA OF

OX OA

s

f f

* Hai chất phải có cùng lượng chấm như nhau

và được triển khai trong cùng điều kiện sắc ký

 Sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thời gian lưu t R (phút): thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi

tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho peak trên sắc ký đồ (tính từ

lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của peak)

 tM (hoặc to): thời gian lưu của

một chất không bị lưu giữ, còn

gọi là thời gian chết

 tR càng lớn, chất tan bị lưu giữ

càng mạnh và tốc độ di chuyển

của nó càng nhỏ

 Thời gian lưu hiệu chỉnh t'R được

tính theo công thức:

t'R = tR - tM (hay t'R = tR - to)

Ứng dụng của sắc ký

* Hai chất giống nhau lần lượt phải có tR và t’R bằng nhau

* Hai chất phải có cùng thể tích tiêm mẫu như nhau và

được triển khai trong cùng điều kiện sắc ký

Nếu trên trục hoành của sắc ký đồ sử dụng đơn vị đo là thể tích dung môi:

- thể tích lưu VR

- thể tích lưu hiệu chỉnh V'R

- thể tích chết của cột VM (thể tích rỗng Vo): thể tích dung môi từ nơi tiêm trong cột đến detector

Ứng dụng của sắc ký

 Sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ứng dụng của sắc ký

 Định lượng

Nguyên tắc chung: dựa trên sự so sánh chiều cao hoặc diện tích của

pic trong mẫu thử với một hay nhiều mẫu chuẩn

 Pic hẹp và đối xứng: đo chiều cao của pic

 Pic tù hay lệch phương: đo diện tích của pic

 Phương pháp định lượng

 Xây dựng đường chuẩn (chuẩn ngoại nhiều điểm)

 So sánh trực tiếp (chuẩn ngoại 1 điểm)

 Thêm chuẩn

 Nội chuẩn

 Chuẩn hóa diện tích

Ứng dụng của sắc ký

 Dùng đường chuẩn (chuẩn ngoại nhiều điểm)

 Pha các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau

 Tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn

 Vẽ đường chuẩn độ biểu diễn sự phụ thuộc chiều cao hay diện tích pic theo nồng độ

 Tiến hành sắc ký mẫu thử Dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ mẫu thử

Ứng dụng của sắc ký

 So sánh trực tiếp (chuẩn ngoại 1 điểm)

 Phân tích bằng chiều cao của pic:

ho: Chiều cao pic chuẩn, hx: Chiều cao pic thử

 Phân tích bằng diện tích pic:

So: Diện tích pic của chuẩn, Sx: Diện tích pic của thử

h

x o



C0 và Cx càng gần nhau kết quả càng chính xác

 Phương pháp nội chuẩn

 Kết quả phân tích không lặp lại khi áp dụng phương pháp ngoại chuẩn (xử

lý mẫu qua nhiều giai đoạn, hàm lượng chất phân tích thấp hay thể tích tiêm mẫu không lặp lại)

 Nguyên tắc

 Thêm cùng hàm lượng một chất chuẩn khác (chuẩn nội) với chất cần định lượng vào mẫu thử và chuẩn

 Mẫu phân tích gồm nhiều chất: chọn một trong các chất làm chuẩn nội

 Tỷ số diện tích pic của chất phân tích và chuẩn nội là thông số được sử dụng để xây dựng đường chuẩn (S/SIS, C)

 Yêu cầu của chuẩn nội

 Pic của chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác

 tR của chuẩn nội phải gần với tR của chất phân tích

 Nồng độ chuẩn nội thêm vào gần bằng nồng độ chất phân tích

Phương pháp định lượng bằng HPLC

 Phương pháp nội chuẩn

 Độ nhạy phát hiện của chuẩn nội và chất phân tích thường khác nhau

 Xác định yếu tố hiệu chỉnh Fs của chuẩn nội và chất phân tích

 Sử dụng dung dịch chuẩn tinh khiết

i s



- Cs: nồng độ của dung dịch chuẩn ngoại

- Ci: nồng độ của dung dịch chuẩn nội

- Ss: diện tích đỉnh của chuẩn ngoại

- Si: diện tích đỉnh của chuẩn nội

Phương pháp định lượng bằng HPLC