Hóa phân tích sắc ký lớp mỏng

Sắc Ký Lớp Mỏng (Thin Layer Chromatography) PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Sắc Ký Lớp Mỏng (SKLM) Mục tiêu: Trình bày  Cơ chế SKLM  Pha tónh pha động SKLM  Trang thiết bò dùng SKLM  Các bước tiến hành SKLM  Ứng dụng SKLM ngành Dược Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Sắc Ký Lớp Mỏng (SKLM) Dàn  Giới thiệu - Đònh nghóa  Các chế tách SKLM  Pha tónh  Pha động  Trang thiết bò  Các bước tiến hành thực SKLM  Phát vết mỏng  Vài thông số đặc trưng SKLM  Ứng dụng SKLM  Đánh giá SKLM Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Giới thiệu – Đònh nghóa  1938: Izmailov & Schraiber dùng bột oxyd nhôm để phân tích dòch chiết alcaloid thực vật  Cơ chế: hấp phụ chiếm phần lớn  Pha tónh: trương nở theo chiều dọc chiều ngang  Đònh nghóa: SKLM phương pháp sắc ký dùng chất hấp phụ làm pha tónh trải thành lớp mỏng kính, nhựa hay kim loại Quá trình tách hợp chất xảy cho pha động dung môi di chuyển qua pha tónh Do SKLM thuộc sắc ký lỏng - rắn  SKLM dùng để tìm điều kiện tối ưu cho tách sắc ký lỏng cột Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Pha tónh  Silicagel (Kieselgel – gel acid silicic)  Sử dụng rộng rải  Kích thước hạt 10 ‟ 60 m, diện tích bề mặt 200 ‟ 400 m2/g  Hoạt tính hấp phụ ‟OH bề mặt đònh  Hàm ẩm tăng làm giảm hoạt độ  Hoạt hóa 120oC/1 trước sử dụng HO OH HO Si Si O Nguyễn Đức Tuấn OH HO OH Si O Đại học Y Dược TPHCM Pha tónh  Nhôm oxyd  Oxyd nhôm trung tính, acid, base  Hoạt tính tùy thuộc lượng nước  Hoạt hóa 120oC/1 trước sử dụng  Theo Brockman: bậc oxyd nhôm Bậc hoạt tính % nước Nguyễn Đức Tuấn I II III IV 10 V 15 Đại học Y Dược TPHCM Pha tónh  Xác đònh bậc hoạt tính nhôm oxyd: dựa vào Rf màu chuẩn „Bậc hoạt tính oxyd nhôm theo Brockman „Chất màu „II „III „IV „V „Giá trò Rf „Aminoazobenzen „0,59 „0,74 „0,85 „0,95 „Sudan đỏ „0,00 „0,10 „0,33 „0,56 „Sudan vàng „0,01 „0,25 „0,57 „0,78 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Pha tónh  Kieselguhr  Bột nhẹ, vàng xám chứa 70 ‟ 95% SiO2  Chất hấp phụ yếu  Tách chất phân cực: cetoacid, lacton,…  Chất mang pha tónh sắc ký phân bố  Kieselguhr ‟ silicagel hay kieselguhr ‟ thạch cao (1:1)  Thạch cao  Cellulose: không cần chất kết dính, tách chất thân nước  Polyamid: tách phenol  Nhựa trao đổi ion: silicagel sulfon hóa Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Pha tónh  Chất hấp phụ tiêu chuẩn hóa  Chất hấp phụ có chất kết dính: silicagel G (Gypseum), kieselguhr G, oxyd nhôm G trộn sẳn 5% thạch cao  Chất hấp phụ không kết dính: silicagel H, oxyd nhôm H  Chất hấp phụ có thêm chất thò huỳnh quang: silicagel GF254, silicagel HF254,…  Bản sắc ký tráng sẳn với giá đở: thủy tinh, giấy nhôm, polymer  Ưu điểm mỏng tráng sẳn  Độ ổn đònh học cao, thao tác đơn giản dễ dàng  Tính đồng cao: thích hợp để bán đònh lượng, đònh lượng  Hiệu lực tách cao mỏng tráng thủ công Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Trang thiết bò – Pha tónh Tính chất Các chất Pha tónh Độ acid Hoạt tính Tác dụng phân chia dùng để phân tách Silicagel Acid Có hoạt tính Hấp phụ Hầu hết tất Phân bố Các chất phân cực Hấp phụ Hydrocarbon, alcaloid, chất màu thực phẩm, lipid Phân bố Đường, acid béo Không có hoạt tính Phân bố Đường, triglycerid, acid béo bậc cao Magie diphosphat Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol Magie trisilicat Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol Dẫn chất siloxan Oxyd nhôm Base Có hoạt tính Cát biển Kieselguhr Trung tính Calci hydroxid Base Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol Calci phosphat Base yếu Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol, acid béo glycerid kỵ nước Có hoạt tính Hấp phụ Các chất màu, acid barbituric Sắt hydroxid Có hoạt tính Hấp phụ Các chất phân cực Than Có hoạt tính Hấp phụ Các chất không phân cực Calci sulfat Silicagel + oxyd nhôm (1:1) Acid + base Cellulose Thực tế trung tính Không có hoạt tính Phân bố Acid amin, carbohydrat, nucleotid Polyamid Trung tính Không có hoạt tính (Trao đổi ?) Các flavon Polyacrylonitril Trung tính Không có hoạt tính (Trao đổi, phân bố ?) Các antoxyan Nhựa trao đổi ion Acid + base Không có hoạt tính Trao đổi Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại, halogenic Rây phân tử Polymer, protein, phức kim loại Gel sephadex Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Thuốc thử màu Thuốc thử Màu vết Ứng dụng phân tích Acid phosphomolypdic Xanh tối Nhiều chất hữu Acid sulfuric đặc Nâu ‟ đen Tất chất hữu Hơi iod Nâu Nhiều chất hữu Ninhydrin Hồng ‟ tím Acid amin, nhóm chức amin 2,4-dinitrophenylhydrazon Da cam, đỏ Các hợp chất carbonyl Xanh lục bromocresol Vàng Các acid hữu 2,7 fluorescein Vàng ‟ lục Nhiều chất hữu Vanilin/acid sulfuric Xanh ‟ lục ‟ hồng Alcol, ceton Rhodamin B Huỳnh quang đỏ Các chất lipid Anisaldehyd/SbCl3 Nhiều màu Các chất steroid Diphenylamin/Zn2+ Nhiều màu Các chất bảo vệ thực vật Thuốc thử chung Thuốc thử chọn lọc Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Thông số đặc trưng SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor) dR V Rf   d M V0 ===> - Rf = 0: chất tan hoàn toàn không di chuyển, nằm điểm xuất phát - Rf = 1: chất tan di chuyển với vận tốc dung môi - dR: khoảng di chuyển chất cần tách - dM: khoảng di chuyển dung môi - v: vận tốc di chuyển chất cần tách - V0: vận tốc di chuyển dung môi Nguyễn Đức Tuấn Đường dung môi  Rf  dM dR x x Đại học Y Dược TPHCM Thông số đặc trưng SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor) - Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf  Chất lượng hoạt tính chất hấp phụ  Chiều dày lớp mỏng, quảng đường sắc ký, lượng chất chấm  Vò trí số lượng chất cần tách mỏng  Thành phần độ tinh khiết pha động  Phương pháp khai triển sắc ký  Độ bão hòa dung môi bình sắc ký (hiện tượng “bờ”)  nh hưởng cấu tử khác có thành phần hỗn hợp cần tách  Độ ẩm, nhiệt độ pH Nguyễn Đức Tuấn Hiện tượng “bờ” Đại học Y Dược TPHCM Thông số đặc trưng SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor) - Sử dụng chất đối chiếu OX R f ( X ) OF OX Rs ( X )    OA OA R f ( A) OF * Hai chất giống phải có Rf Rs * Hai chất phải có lượng chấm triển khai điều kiện sắc ký Nguyễn Đức Tuấn F X A O x x x Sắc ký đồ sắc ký đối chứng Đại học Y Dược TPHCM Thông số đặc trưng SKLM Hệ số dung lượng Số đĩa lý thuyết biểu kiến Độ phân giải dM  dR 1 R f k'  dR Rf  dR  N  16  W  2[d B  d A ] Rs  WA  WB Đường dung môi dB WB dM dA dR W WA x x Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Các kỹ thuật khai triển SKLM  Sắc ký chiều  Sắc ký hai chiều  Mẫu phân tích nhiều chất  Sắc ký chiều không đủ độ tin cậy Kỹ thuật sắc ký hai chiều Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Các kỹ thuật khai triển SKLM Đường dung môi Đường chấm mẫu Dung môi B Dung môi A Sắc ký đồ SKLM hai chiều vài acid amin Dung môi A: toluen/2-chloroetanol/pyridine Dung moâi B: Chloroform/benzyl alcohol/acid acetic acid aspartic, acid glutamic, serine, alanine, glycine, alanine, methionine, valine, isoleucine, 10 cysteine Nguyễn Đức Tuấn Sắc ký đồ dẫn chất xanthin mỏng pha đão C-18 Pha động: metanol/K2HPO4 0,1 M (55:45 tt/tt) Phát hiện: iod Thời gian khai triển: Các giá trò Rf: theobromin 0,68; theophylin 0,56; cafein: 0,44; 3-isobutylmetyl xanthin 0,21 Đại học Y Dược TPHCM Các kỹ thuật khai triển SKLM Sắc ký chế hóa  Tách chất với lượng nhỏ trường hợp tách phương pháp khác Kỹ thuật sắc ký chế hóa (đánh dấu cạo riêng vùng) Dung môi Dung môi CHP chứa B CHP chứa A phản hấp phụ Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng SKLM  Đònh tính thử tinh khiết  Dựa vào Rf  Sắc ký so sánh chất thử X với chất đối chiếu A sắc đồ  Điều kiện X A: Rf(X) = Rf(A) với hệ dung môi khác  Chất thử coi tinh khiết sắc ký đồ vết lạ  Bán đònh lượng – đònh lượng  Tách chiết chất phân tích vết sắc ký dung môi thích hợp, làm dòch chiết, đònh lượng kỹ thuật thích hợp: dùng, tốn thời gian  Đònh lượng trực tiếp mỏng: đo diện tích hay cường độ màu vết sắc ký  Dùng máy đo mật độ quang (Densitometer): chiếu chùm tia vào vết sắc ký đo cường độ hấp thụ huỳnh quang  Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số độ phân giải cao: quét mỏng với hệ thống phân tích thu nhận hình ảnh vết sắc ký Xử lý liệu ảnh máy tính Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM SKLM hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)  Sử dụng mỏng tráng sẵn có bề dày 0,1 mm  Pha tónh silica pha liên kết siloxan m  Tăng độ tin cậy kết phân tích  Tăng độ phân giải độ nhạy:  Vết sắc ký nhỏ  Thời gian sắc ký ngắn  Lượng dung môi dùng  Sai số phương pháp: ‟ 10% chủ yếu đưa mẫu lên mỏng Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM SKLM hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM SKLM hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM SKLM hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Đánh giá SKLM: Ưu điểm  Phương pháp đơn giản: thử tinh khiết, xác đònh giới hạn tạp chất, phát chất lạ, đònh tính, bán đònh lượng đònh lượng  Sử dụng phổ biến để nghiên cứu, sàng lọc  Kỹ thuật thiết bò đơn giản  Sử dụng linh hoạt: dễ thay đổi chất hấp phụ, dung môi khai triển thuốc thử phát hiện, kể loại thuốc thử ăn mòn mà sắc ký giấy không dùng  Thời gian tiến hành nhanh (15 - 30 phút, tối đa vài giờ) độ nhạy cao sắc ký giấy  Là phương pháp vi phân tích  Có thể dùng để tìm điều kiện tối ưu cho tách sắc ký lỏng cột  Phạm vi ứng dụng rộng rãi: kiểm tra hiệu chiết tách phương pháp khác sắc ký cột, chiết xuất, chưng cất, tái kết tinh,…  Phát tất chất kể chất không di chuyển theo pha động  Thực tách dễ dàng mẫu có nhiều thành phần Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Đánh giá SKLM: Nhược điểm  Trò số Rf có độ lặp lại thấp thành phần pha động thay đổi trình khai triển sắc ký  Tăng giãn rộng vết khuếch tán tốc độ dòng pha động thấp Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM ... Dược TPHCM Các kỹ thuật khai triển SKLM  Sắc ký chiều  Sắc ký hai chiều  Mẫu phân tích nhiều chất  Sắc ký chiều không đủ độ tin cậy Kỹ thuật sắc ký hai chiều Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược... dày lớp mỏng, quảng đường sắc ký, lượng chất chấm  Vò trí số lượng chất cần tách mỏng  Thành phần độ tinh khiết pha động  Phương pháp khai triển sắc ký  Độ bão hòa dung môi bình sắc ký (hiện... xạ từ bề mặt mỏng soi đèn UV Chất phân tích hấp thụ xạ ghi lại thành pic sắc ký Nguyễn Đức Tuấn Triển khai sắc ký Đại học Y Dược TPHCM Thuốc thử màu Thuốc thử Màu vết Ứng dụng phân tích Acid phosphomolypdic