Hóa phân tích sắc ký lớp mỏng

Sắc Ký Lớp Mỏng SKLM Dàn bài  Giới thiệu - Định nghĩa  Các cơ chế tách trong SKLM  Pha tĩnh  Pha động  Trang thiết bị  Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM  Phát hiện các vết tr

Sắc Ký Lớp Mỏng (Thin Layer Chromatography)

PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Sắc Ký Lớp Mỏng (SKLM)

Mục tiêu: Trình bày được

 Cơ chế chính trong SKLM

 Pha tĩnh và pha động trong SKLM

 Trang thiết bị dùng trong SKLM

 Các bước tiến hành trong SKLM

 Ứng dụng của SKLM trong ngành Dược

Sắc Ký Lớp Mỏng (SKLM)

Dàn bài

 Giới thiệu - Định nghĩa

 Các cơ chế tách trong SKLM

 Pha tĩnh

 Pha động

 Trang thiết bị

 Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM

 Phát hiện các vết trên bản mỏng

 Vài thông số đặc trưng của SKLM

 Ứng dụng của SKLM

 Đánh giá SKLM

Giới thiệu – Định nghĩa

 1938: Izmailov & Schraiber dùng bột oxyd nhôm để phân

tích dịch chiết alcaloid thực vật

 Cơ chế: hấp phụ chiếm phần lớn

 Pha tĩnh: trương nở theo cả chiều dọc và chiều ngang

 Định nghĩa: SKLM là một phương pháp sắc ký dùng chất

hấp phụ làm pha tĩnh trải thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại Quá trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha

động là dung môi di chuyển qua pha tĩnh Do đó SKLM

thuộc sắc ký lỏng - rắn

 SKLM có thể dùng để tìm các điều kiện tối ưu cho sự tách bằng sắc ký lỏng trên cột

Pha tĩnh

 Silicagel (Kieselgel – gel của acid silicic)

 Sử dụng rộng rải nhất

 Kích thước hạt 10 ‟ 60  m, diện tích bề mặt 200 ‟ 400 m2/g

 Hoạt tính hấp phụ do ‟OH trên bề mặt quyết định

 Hàm ẩm tăng sẽ làm giảm hoạt độ

 Hoạt hóa 120oC/1 giờ trước khi sử dụng

Pha tĩnh

 Nhôm oxyd

 Oxyd nhôm trung tính, acid, base

 Hoạt tính tùy thuộc lượng nước

 Hoạt hóa 120oC/1 giờ trước khi sử dụng

 Theo Brockman: 5 bậc oxyd nhôm

Pha tĩnh

 Xác định bậc hoạt tính của nhôm oxyd: dựa vào Rf của màu chuẩn

„Chất màu

„Bậc hoạt tính của oxyd nhôm theo Brockman

Pha tĩnh

 Kieselguhr

 Bột nhẹ, vàng xám chứa 70 ‟ 95% SiO2

 Chất hấp phụ yếu

 Tách các chất phân cực: cetoacid, lacton,…

 Chất mang pha tĩnh trong sắc ký phân bố

 Kieselguhr ‟ silicagel hay kieselguhr ‟ thạch cao (1:1)

 Thạch cao

 Cellulose: không cần chất kết dính, tách các chất thân nước

 Polyamid: tách các phenol

 Nhựa trao đổi ion: silicagel sulfon hóa

Pha tĩnh

 Chất hấp phụ đã được tiêu chuẩn hóa

 Chất hấp phụ có chất kết dính: silicagel G (Gypseum), kieselguhr

G, oxyd nhôm G trộn sẳn 5% thạch cao

 Chất hấp phụ không kết dính: silicagel H, oxyd nhôm H

 Chất hấp phụ có thêm chất chỉ thị huỳnh quang: silicagel GF254, silicagel HF254,…

 Bản sắc ký tráng sẳn với giá đở: thủy tinh, giấy nhôm, polymer

 Ưu điểm bản mỏng tráng sẳn

 Độ ổn định cơ học cao, thao tác đơn giản và dễ dàng hơn

 Tính đồng nhất cao: thích hợp để bán định lượng, định lượng

 Hiệu lực tách cao hơn bản mỏng tráng thủ công

Trang thiết bị – Pha tĩnh

phân chia dùng để phân tách

Silicagel Acid Có hoạt tính Hấp phụ Hầu hết tất cả

Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực

Oxyd nhôm Base Có hoạt tính Hấp phụ Hydrocarbon, alcaloid, chất màu thực

phẩm, lipid

Kieselguhr Trung tính Không có hoạt tính Phân bố Đường, các triglycerid, các acid béo

bậc cao Magie diphosphat Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol

Magie trisilicat Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol

Calci hydroxid Base Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol

Calci phosphat Base yếu Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol

Calci sulfat Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol, các acid béo

glycerid kỵ nước Silicagel + oxyd nhôm (1:1) Acid + base Có hoạt tính Hấp phụ Các chất màu, các acid barbituric Sắt hydroxid Có hoạt tính Hấp phụ Các chất phân cực

Than Có hoạt tính Hấp phụ Các chất không phân cực

Cellulose Thực tế

trung tính Không có hoạt tính Phân bố Acid amin, carbohydrat, nucleotid Polyamid Trung tính Không có hoạt tính (Trao đổi ?) Các flavon

Polyacrylonitril Trung tính Không có hoạt tính (Trao đổi, phân bố ?) Các antoxyan

Nhựa trao đổi ion Acid + base Không có hoạt tính Trao đổi Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,

halogenic Gel sephadex Rây phân tử Polymer, protein, phức kim loại

Pha động

 Thay đổi tùy theo cơ chế tách

 Tăng cường sức rửa giải: thường kết hợp 2 dung môi

 Không có qui tắc cụ thể để lựa chọn dung môi

 Sắc ký sơ bộ để thăm dò hệ dung môi

 Nên chọn hệ dung môi đơn giản và dùng loại tinh khiết

 Hướng dẫn lựa chọn pha tĩnh và pha động:

 Tính chất của mẫu phân tích: độ hòa tan, độ phân cực, số lượng và đặc tính các nhóm chức

 Cơ chế sắc ký của pha tĩnh

 Dung môi: độ bay hơi, độ nhớt, độ tinh khiết, sự phân lớp

 Chất phân tích ion hay phân cực: dung môi phân cực như butanol ‟ nước, thêm acid acetic hoặc amoniac

 Pha tĩnh silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác: độ phân cực pha động quyết định tốc độ di chuyển và Rf

 Điều chỉnh sức rửa giải của pha động để Rf: 0,2 ‟ 0,8 đạt độ phân giải cực trị

Pha động

 Một số nhóm chức có khả năng hấp phụ tăng dần:

CH=CH < OCH3 < COOR < C=O < CHO < SH < NH2 < OH < COOH

 Dung môi với sức rửa giải (sức dung môi) tăng dần:

Ether dầu hỏa 0,01 Ether etylic 0,38 Acetonitril 0,65

Heptan 0,01 Methylen clorid 0,42 Dimethyl sulfoxid 0,76

Cyclohexan 0,04 Dicloroetan 0,49 Isopropanol 0,82

Carbon tetraclorid 0,18 Aceton 0,56 Ethanol 0,88

Ether isopropylic 0,28 Dioxan 0,56 Methanol 0,95

Trang thiết bị – Bản mỏng

 Bản mỏng dính chắc: chất hấp phụ được trộn

thêm 5 ‟ 15% chất kết dính (thạch cao, tinh bột, dextrin)

5 x 20 10 x 20 20 x 20 (cm)

Trang thiết bị – Bình sắc ký

 Bình đáy tròn, vuông hoặc chữ nhật

Các loại bình sắc ký

Các bước tiến hành khi thực hiện SKLMù

 Chuẩn bị bản mỏng, bình sắc ký thích hợp, pha động

 Chấm dung dịch lên bản mỏng: 1-10  g

 Khai triển sắc ký

 Phát hiện các vết trên bản mỏng

 Màu sắc tự nhiên của vết

 Phun thuốc thử hiện màu

 Soi dưới đèn UV 254 hoặc 365 nm: thêm chất

phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh

 Dùng máy đo mật độ quang (densitometer): đo

cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi dưới đèn UV Chất phân tích hấp thụ bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký

Thuốc thử hiện màu

Thuốc thử Màu của vết Ứng dụng phân tích

Thuốc thử chung

Acid phosphomolypdic Xanh tối Nhiều chất hữu cơ

Acid sulfuric đặc Nâu ‟ đen Tất cả các chất hữu cơ

Thuốc thử chọn lọc

Ninhydrin Hồng ‟ tím Acid amin, các nhóm chức amin 2,4-dinitrophenylhydrazon Da cam, đỏ Các hợp chất carbonyl

Xanh hoặc lục

2,7 fluorescein Vàng ‟ lục Nhiều chất hữu cơ

Vanilin/acid sulfuric Xanh ‟ lục ‟ hồng Alcol, ceton

Rhodamin B Huỳnh quang đỏ Các chất lipid

Anisaldehyd/SbCl3 Nhiều màu Các chất steroid

Diphenylamin/Zn2+ Nhiều màu Các chất bảo vệ thực vật

Thông số đặc trưng của SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor)

0

V

V d

d R

- Rf = 0: chất tan hoàn toàn không di chuyển,

nằm tại điểm xuất phát

- Rf = 1: chất tan di chuyển cùng với vận tốc của

dung môi

- dR: khoảng di chuyển được của chất cần tách

- dM: khoảng di chuyển được của dung môi

- v: vận tốc di chuyển của chất cần tách

- V0: vận tốc di chuyển của dung môi

Thông số đặc trưng của SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor)

- Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf

 Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ

 Chiều dày của lớp mỏng, quảng đường sắc ký,

lượng chất chấm

 Vị trí và số lượng chất cần tách trên bản mỏng

 Thành phần và độ tinh khiết của pha động

 Phương pháp khai triển sắc ký

 Độ bão hòa của dung môi trong bình sắc ký

(hiện tượng “bờ”)

 Aûnh hưởng của các cấu tử khác có trong thành

phần hỗn hợp cần tách

 Độ ẩm, nhiệt độ và pH

Hiện tượng “bờ”

Thông số đặc trưng của SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor)

- Sử dụng chất đối chiếu

OX OF OA OF

OX OA

s

f f

* Hai chất phải có cùng lượng chấm như nhau

và được triển khai trong cùng điều kiện sắc ký

Thông số đặc trưng của SKLM

f

f R

R M

R

R d

WB

dA

dB

WA W

B A

A B

s

W W

d

d R

Các kỹ thuật khai triển SKLM

 Sắc ký một chiều

 Sắc ký hai chiều

 Mẫu phân tích nhiều chất

 Sắc ký một chiều không đủ độ tin cậy

Kỹ thuật sắc ký hai chiều

Các kỹ thuật khai triển SKLM

Sắc ký đồ SKLM hai chiều của một vài acid amin

Dung môi A: toluen/2-chloroetanol/pyridine

Dung môi B: Chloroform/benzyl alcohol/acid

acetic

-alanine, 5 glycine, 6 -alanine, 7 methionine, 8

valine, 9 isoleucine, 10 cysteine

Dung môi A

Dung môi B

Sắc ký đồ các dẫn chất xanthin trên bản mỏng pha đão C-18

Pha động: metanol/K2HPO4 0,1 M (55:45

tt/tt) Phát hiện: hơi iod Thời gian khai

triển: 1 giờ Các giá trị R f : theobromin 0,68;

theophylin 0,56; cafein: 0,44; metyl xanthin 0,21

3-isobutyl-Đường dung môi 3-isobutyl-Đường chấm mẫu

Các kỹ thuật khai triển SKLM

Sắc ký chế hóa

 Tách các chất với lượng nhỏ trong trường hợp không thể tách bằng các phương pháp khác

Kỹ thuật sắc ký chế hóa

(đánh dấu và cạo riêng từng vùng)

Dung môi Dung môi

CHP chứa A

CHP chứa B

phản hấp phụ

Ứng dụng của SKLM

 Định tính và thử tinh khiết

 Dựa vào Rf

 Sắc ký so sánh chất thử X với chất đối chiếu A trên cùng một sắc đồ

 Điều kiện X là A: Rf(X) = Rf(A) với các hệ dung môi khác nhau

 Chất thử được coi là tinh khiết khi trên sắc ký đồ không có vết lạ

 Bán định lượng – định lượng

 Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp, làm sạch dịch chiết, định lượng bằng kỹ thuật thích hợp: ít dùng, tốn thời gian

 Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện tích hay cường độ màu vết sắc ký

 Dùng máy đo mật độ quang (Densitometer): chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang

 Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số độ phân giải cao: quét bản mỏng với hệ thống phân tích thu nhận hình ảnh của vết sắc ký Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính

SKLM hiệu năng cao

(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

 Sử dụng bản mỏng tráng sẵn có bề dày 0,1 mm

 Pha tĩnh silica và pha liên kết siloxan 5  m

 Tăng độ tin cậy của kết quả phân tích

 Tăng độ phân giải và độ nhạy:

 Vết sắc ký nhỏ hơn

 Thời gian sắc ký ngắn hơn

 Lượng dung môi dùng ít hơn

 Sai số của phương pháp: 5 ‟ 10% chủ yếu do đưa mẫu lên bản

mỏng

SKLM hieäu naêng cao

(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

SKLM hieäu naêng cao

(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

SKLM hieäu naêng cao

(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

Đánh giá SKLM: Ưu điểm

 Phương pháp đơn giản: thử tinh khiết, xác định giới hạn tạp chất, phát hiện các chất lạ, định tính, bán định lượng và định lượng

 Sử dụng phổ biến để nghiên cứu, sàng lọc

 Kỹ thuật và thiết bị đơn giản

 Sử dụng linh hoạt: dễ thay đổi chất hấp phụ, dung môi khai triển cũng như thuốc thử phát hiện, kể cả các loại thuốc thử ăn mòn mà sắc ký giấy không dùng được

 Thời gian tiến hành nhanh (15 - 30 phút, tối đa vài giờ) và độ nhạy cao hơn sắc ký giấy

 Là một phương pháp vi phân tích

 Có thể dùng để tìm các điều kiện tối ưu cho sự tách bằng sắc ký lỏng trên cột

 Phạm vi ứng dụng rộng rãi: kiểm tra hiệu quả chiết tách của các phương pháp khác như sắc ký cột, chiết xuất, chưng cất, tái kết tinh,…

 Phát hiện tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động

 Thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần

Đánh giá SKLM: Nhược điểm

 Trị số Rf có độ lặp lại thấp do thành phần pha động thay đổi trong quá trình khai triển sắc ký

 Tăng giãn rộng vết do khuếch tán vì tốc độ dòng pha động thấp