Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero chuẩn quốc gia dùng trong kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ──────*****────── NGUYỄN MẠNH KHẢI ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NGÂN HÀNG TẾ BÀO VERO CHUẨN QUỐC GIA DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Y TẾ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ──────*****────── NGUYỄN MẠNH KHẢI ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NGÂN HÀNG TẾ BÀO VERO CHUẨN QUỐC GIA DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Y TẾ Chuyên ngành: Động vật học (Vi sinh vật học) Mã số : 8420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Văn Hùng LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới: - Phòng Đào tạo sau đại học, Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập - TS Phạm Văn Hùng, người thầy có nhiều kinh nghiệm trực tiếp giúp đỡ từ lúc xây dựng đề cương hoàn thành luận văn - Các bạn đồng nghiệp Khoa Kiểm định vắc xin Vi khuẩn, Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp - Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn lớp đồng nghiệp Khoa/ phòng Viện động viên, khích lệ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 11 năm 2018 Học viên Nguyễn Mạnh Khải DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt ATCC BSA CV Tiếng Anh Tiếng Việt American Type Culture Collection Chủng chuẩn Bovine Serum Albumin Huyết bê Coeficient variation Hệ số biến thiên Center for Biologics Evaluation Trung tâm đánh giá nghiên Research cứu sinh học COA Certificate Of Analysis Chứng nhận chất lượng DNA Acide Deoxyribonucleic Acide Deoxyribonucleic WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế Giới MCB Master Cell Bank Ngân hàng tế bào gốc giống MCQG National Reference Standard Mẫu chuẩn quốc gia MCQT International Reference Standard Mẫu chuẩn quốc tế MDBK Madin-Darby bovine kidney cell line Tế bào tiên phát thận bò MRC-5 human diploid cell strain Tế bào lưỡng bội người National Institute for Biological Viện kiểm soát thiết lập chất Standard and Control chuẩn quốc tế CBER NIBSC NRA National Regulatory Authority Cơ quan quản lý quốc gia vắc xin National Institute for Control of Viện Kiểm định Quốc gia Vắc Vaccine and Biological xin Sinh phẩm Y tế NCL National Laboratory Control Phòng kiểm định quốc gia FDA Food and Drug Aministration WCB Working Cell Bank Ngân hàng tế bào làm việc RNA Acide Ribonucleic Axit ribonucleic NICVB Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm Hoa Kỳ Bộ sưu tập chủng vi sinh vật JCM Japan Collection of Microorganisms SOP Standard Operating Procedure Qui trình thao tác chuẩn GLP Good Laboratory Practice Thực hành phòng thí nghiệm tốt GMP Good Manufacturing Practice Thực hành sản xuất tốt PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuyếch đại chuỗi SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn TRS Technical Report Series Báo cáo kỹ thuật KĐQG Nhật Bản Kiểm định Quốc gia MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tế bào động vật sở việc nuôi cấy tế bào động vật 1.1.1 Các tế bào dịch huyền phù 1.1 Các tế bào d nh bám Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật .1 Môi trường nuôi cấy 1.2.2 Kỹ thuật nuôi tế bào động vật 1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 10 1.3.1 Nuôi cấy tạo tế bào lai soma động vật 10 1.3 Công nghệ nhân vô t nh động vật 11 1.3.3 Ứng dụng lĩnh vực y tế 13 1.4 Lịch sử ứng dụng nuôi cấy tế bào sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế, khái niệm ngân hàng tế bào 14 1.5 Dòng tế bào Vero 16 1.6 Hướng dẫn WHO thiết lập mẫu chuẩn quốc gia dùng cho kiểm định 18 1.7 Hướng dẫn WHO thiết lập đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào dùng cho sản xuất kiểm định chất lượng vắc xin sinh phẩm 19 1.7.1 Thử nghiệm nhận dạng 20 1.7.2 Thử nghiệm vô trùng 21 1.7.3 Kiểm tra độ sống 21 1.7.4 T nh đồng ống tế bào 21 1.7.5 Thử nghiệm Mycoplasma 22 1.7.6 Thử nghiệm kiểm tra tác nhân ngoại lai 22 1.7.7 Kiểm tra phát vi khuẩn lao 23 1.7.8 Kiểm tra tính ổn định ngân hàng tế bào MCB WCB theo thời gian bảo quản điều kiện tối ưu -70 C 23 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 .1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 24 2.3 Vật liệu nghiên cứu 25 2.3.1 Mẫu chuẩn mẫu thử 25 2.3.2 Các sinh phẩm, hóa chất: 25 2.3.3 Các thiết bị 26 2.3.4 Các dụng cụ nguyên vật liệu khác 26 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Thiết kế mơ hình nghiên cứu 27 2.4.2 Kỹ thuật nghiên cứu 29 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 Qui trình sản xuất ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A vero 76 NICVB-WCB01-18B chuẩn quốc gia 37 3.2 Quy trình chuẩn Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin sinh phẩm y tế” theo tiêu chuẩn WHO TRS No 978, phần 3, 2013 38 3.2 Kết kiểm tra chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A NICVB-MCB01-18B 38 3.2.1 Kết kiểm tra nhận dạng tế bào vero 76 MCB01-18A WCB01-18B 38 3.2.2 Kết kiểm tra vô trùng tế vero 76 MCB01-18A WCB01-18B 39 3.2.3 Kết kiểm tra độ sống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A NICVB- WCB0118B 40 3.2.4 Kết kiểm tra t nh đồng ống tế bào vero 76 NICVB-MCB0118A NICVB-WCB01-18B 42 3.2.5 Kết kiểm tra Mycoplasma tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A NICVB-WCB01-18B 44 3.2.6 Kết kiểm tra tác nhân ngoại lai tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A 44 3.2.7 Kết kiểm tra vi khuẩn lao tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A NICVB-WCB01-18B 45 3.2.8 Kết kiểm tra tính ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB010 18A NICVB-WCB01-18B bảo quản điều kiện -70 C theo thời gian 46 CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 50 4.1 Tính cấp thiết việc thiết lập đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero đạt tiêu chuẩn WHO TRS No 978, 2013 50 4.2 Xây dựng qui trình chuẩn Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin sinh phẩm y tế” đạt tiêu chuẩn WHO 51 4.3 Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A NICVB-WCB01-18B 52 4.4 Tính ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A NICVB0 WCB01-18B bảo quản theo thời gian nhiệt độ tối ưu -70 C 53 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG ảng 1.1 Thành phần môi trường Eagle 1959 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR nhận dạng tế bào vero 31 Bảng Điều kiện phản ứng chu kỳ nhiệt PCR nhận dạng tế bào vero 31 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR phát Mycoplasma 34 Bảng Điều kiện phản ứng chu kỳ nhiệt PCR phát Mycoplasma 34 Bảng 3.1 Kết kiểm tra vô trùng 40 Bảng 3.2 kết kiểm tra độ sống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A NICVBMCB01-18B 41 Bảng 3.3 Kết t nh đồng ống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A 42 Bảng 3.4 Kết t nh đồng ống tế bào vero 76 NICVB-WCB01-18B 43 Bảng 3.5 Kết kiểm tra tác nhân ngoại lai ngân hàng tế bào vero 76 NICVBMCB01-18A 45 Bảng 3.6 Kết kiểm tra phát trực khuẩn lao tế bào vero 76 NICVBMCB01-18A NICVB-WCB01-18B 46 Bảng 3.7 Kết đánh giá t nh ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB0118A bảo quản nhiệt độ tối ưu theo thời gian 47 Bảng 3.8 Kết đánh giá t nh ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-WCB0118B bảo quản nhiệt độ tối ưu theo thời gian 48 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Các tế bào động vật thường sử dụng ni Hình 1.2 Hình ảnh tế bào vero môi trường nuôi cấy MEM 10%FBS 17 Hình 2.1 Mơ hình nghiên cứu 29 Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A vero 76 NICVB-WCB01-18B chuẩn quốc gia 37 Hình 3.2 Tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A NICVB-WCB01-18B 38 Hình 3.3 Kết nhận dạng MCB01 WCB01 39 Hình 3.4 Kết hình thái đặc trưng vero 76 mơi trường ni cấy 41 Hình 3.5 Kết xác định Mycoplasma mẫu tế bào ngân hàng vero 76 NICVB-MCB01-18A NICVB-WCB01-18B 44 Hình 3.6 Kết tính ổn định độ sống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A 48 Hình 3.7 Kết tính ổn định độ sống tế bào vero 76 NICVB-WCB01-18B 49 Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 - Máy tách chiết DNA – RNA t động SaMag 12-Sacase Biotechnology - Giá từ (Thermo, Mỹ) - Pipetma oại 50 µ , 100-200µl, 1000 µl, 5000 µl (Gilson): mã GG29329, EJ87599, EG53274, 467106 - Máy ắc JK Mã : VT 03 VR/ Thermo VT 04 VR - Pipet aid Model 4-000-220, USA - Bơm châ khô g (Ga ekamp) mã VP 01 VR - Bể ổ hi t (She - Lab) mã WB 03 VR - Máy đo pH (Themor) mã pH-14 VR - Tủ cấy vô trùng (Nuaire) mã LH 06 VR - Câ phâ tích độ nhạy 0.0001g (Sartorius, Đức) - Kính hiển vi quang học (Olympus SZ61, Nhật Bản) - Bộ ọc c đườ g kí h mà g ọc 0,22μm o - Tủ ấm CO2 Astec SCA-165DS - Miseq Reagent Kit (MS-102-2002) - Library Quantification Kit – Illumina (KK4824) - Các viên bi từ tính (Ampure Bead) - Kit real-time RT-PCR Invitrogen - Kit tách chiết DNA ARN (Qiage , Đức) - Bộ sinh ph m PCR (Qiage , Đức) - Dung dịch AMPure XP bead 2-8 C - Hóa chất n di DNA - Bộ thuốc nhuộm Zeihl Neelsen (Nam Khoa) - Tế bào Vero (ATCC, CRL-1587) - L- Glutamin 200 mM (Sigma, M3641) - FBS (Sigma, F2442): 100 ml - Kháng sinh: Peniciline Streptomycine 10mg/ml (Gibco, 14200-075) - NaHCO37,5% (Gibco, 25080-094) - Môi trườ g MEM 10%FBS - Môi trườ g MEM 2%FBS 3/14 Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 o o - Môi trườ g tă g si h Thioglycolate/30-35 C Soybean/20-25 C loại 10 ống cho thử nghi m - Neutral Red (mp- bio, 1023438) - Du g dịch phủ thạch MEM 2X - Agarose ME (Nisui-Nhật bả ) - Eagle MEM (Wako –Nhật bả ) - Tuýp tế bào: 01 tuýp - Môi trườ g MEM 10%FBS D-MEM 5%FBS - Trypsin EDTA 0,25%: 100ml 2 - Chai uôi tế bào oại 25cm , 75 cm , 125 cm - Bộ ọc 1l c đườ g kí h mà g ọc 0,22μm lo - Qu áo, kh u tra g, gă g tay vô trù g - Khă khô g si h bụi - Pipét h a vô trù g 2m , 5m , 10m , 25m - Pipét aid - Bơm kim tiêm vô trù g (1m , 5m , 10m ) - Typ h a vô trù g: 5m , 15m , 25m - Cốc thủy ti h c mỏ - PBS (-) 1X: 500 ml - Độ g vật thí ghi m: Chuột hắt trằ g trưở g h trọ g ượ g 15-20g/chuột số ượ g 20 co cho thử ghi m Chuột a g trọ g ượ g 350-450g/chuột số ượ g co cho thử ghi m Trứ g gà c phôi 10-11 gày tuổi số ượ g 10 cho thử ghi m 5.2 Pha mơi trường ni cấy, hóa chất 5.2.1 Pha mơi trường MEM/DMEM o - Bất hoạt FBS hi t độ 56 C/30 phút tro g bể ổ hi t - Hòa ta g i MEM DMEM (9,6g) cốc mỏ đ + MEM/DMEM 2% FBS: 960ml 4/14 g ước cất : + MEM/DMEM 5% FBS: 930ml + MEM/DMEM 10% FBS: 880ml 5/14 Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 - Hút ượ g FBS bất hoạt phù hợp vào cốc: + MEM/DMEM 2% FBS: 20ml + MEM/DMEM 5% FBS: 50ml + MEM/DMEM 10% FBS: 100ml - Thêm 10 ml kháng sinh Penicillin-Streptomyci ,khuấy - Chỉ h pH bằ g NaHCO37,5% để pH 7,1-7,4 - Thêm 10ml Hepes - Đổ du g dịch pha vào cốc ọc Bật bơm hút châ khô g - Sau ọc xo g, tắt bơm Tháo cốc ọc, đậy ắp b h - Ghi hã : tê môi trườ g, số oạt, gười pha, gày pha, hạ sử dụ g o - Bảo môi trườ g tro g tủ mát 2-8 C, hạ sử dụ g 06 thá g 5.2.2 Pha dung dịch PBS(-) 1X - Hút 100m du g dịch PBS 10X vào chai thủy ti h - Thêm 900 m ước cất - Lọc bằ g cốc ọc đườ g kí h mà g ọc 0,22μm - Đo pH Tiêu chu : pH 7,0-7,4 o - Hấp ti t trù g 121 C/15 phút - Ghi hã : tê môi trườ g, số oạt, gười pha, gày pha, hạ sử dụ g o - Bảo tro g tủ mát 2-8 C, hạ sử dụ g 06 thá g 5.2.3 Pha dung dịch Hepes - Câ 14g Hepes, đổ hẹ hà g vào b h đị h mức 200 m - Thêm từ từ ước cất cho đế vừa đủ 200 m - Lắc hẹ cho đế ta hoà - Đổ vào cốc ọc c đườ g kí h mà g ọc 0,22μm - Lọc, đậy ắp b h - Ghi hã : tê môi trườ g, số oạt, gười pha, gày pha, hạ sử dụ g o - Bảo tro g tủ mát 2-8 C, hạ sử dụ g 06 thá g 5.3.1 Thủ tục bảo hộ lao động - Mặc qu áo vô trù g, đeo gă g tay, kh u tra g th c hi - Thử ghi m tiế hà h tro g tủ a si h học cấp độ II 6/14 thử ghi m Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 5.3.2 Khui tế bào - Tuýp tế bào từ b h itơ ỏ g từ tủ âm sâu, cho gay vào cốc đ g o ước cất giữ hi t độ khoả g 37 C cho đế ta bă g hoà o - Đưa tuýp tế bào vào tủ cấy vô trù g, sát trù g goài tuýp bằ g cồ 70 - Hút hỗ dịch tế bào vào ố g fa co oại 15m Bổ su g 5m MEM 10%FBS (hoặc DMEM 5%FBS với tế bào MA-104) - Ly tâm tốc độ 1500 vòng/phút phút Nhẹ hà g đổ ph chứa ước thải, giữ ại ph ước ổi vào cốc kết tủa - Hút 6m môi trườ g MEM 10% FBS (hoặc DMEM 5%FBS với tế bào MA-104) vào chai uôi tế bào oại 25 cm - Hút 1m môi trườ g MEM 10% FBS (hoặc DMEM 5%FBS với tế bào MA-104) vào tuýp tế bào, hút trộ hẹ hà g cho ta kết tủa - Hút huyề dịch tế bào từ tuýp vào chai uôi o - Ủ chai uôi tế bào tro g tủ ấm 37 C, 5% CO2 - Sau 24h kiểm tra độ bám tế bào, ếu hiều tế bào chết th tiế hà h thay môi trườ g: + Đổ môi trườ g tro g chai uôi vào cốc đ g ước thải + Bổ su g 7m môi trườ g MEM 10% FBS(hoặc DMEM 5%FBS với tế bào MA-104) - Sau 3-5 gày, tế bào mọc kí ớp th tiế hà h cấy chuyể (tách tế bào) 5.3.3 Cấy chuyển tế bào - Khi tế bào mọc kí , hút bỏ tồ mơi trườ g tro g chai 2 - Bổ su g PBS(-) 1X : 3ml/chai 25cm , 10 ml/chai 75 cm , 15 ml/chai 125 cm , láng vài , sau đ đổ bỏ hết PBS Lặp ại 2 - Bổ su g Trypsi EDTA 0,25% : ml/chai 25cm , ml chai 75 cm , ml/chai 125 o cm để tro g tủ ấm 37 C, 5% CO2 khoả g 1-2 phút cho đế tế bào co trò - Đổ bỏ Trypsi EDTA 0,25% - Vỗ hẹ vào h chai cho tế bào bo g hồ tồ - Lấy 3m mơi trườ g MEM 10% FBS cho vào chai, g bề mặt chai,dùng pipét hộ cho tế bào tách rời hoà - Đếm tế bào theo SOP MT 06-16 : Quy tr h chu 7/14 đếm tế bào Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 2 - Hút MEM 10% FBS cho vào chai 8ml/chai 25cm , 25ml/ chai 75 cm , 40 ml/chai 125 cm 6 - Tí h toá để hút tế bào vào chai khoả g 1.10 tế bào/ chai 25 cm , 3.10 tế bào/ chai 75 cm , 5.10 tế bào/ chai 75 cm o - Ủ chai uôi tế bào tro g tủ ấm 37 C, 5% CO2 - Khi tế bào mọc kí chai, tiếp tục tách tế bào cho đế đạt số ượ g tế bào theo yêu c u thử ghi m Ghi chú: Tế bào lấy từ nitơ lỏng phải cấy chuyển lần trước đưa vào làm thử nghiệm Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 6.1 Kiểm tra nhận dạng tế bào vero Phươ g pháp: Sử dụ g phươ g pháp hậ g tr c tiếp PCR với cặp mồi đặc hi u trê tr h t DNA gười cho tế bào vero 76 CRL1587 trê Ge ba k-NCBI mã số L13119 Tiế hà h: + Tách chiết DNA: Mẫu thử tế bào vero mẫu âm tí h tế bào MDBK ATCCCCL-10 sau uôi cấy trê môi trườ g MEM10%FBS c g độ 2x10 tế bào/typ/m tách chiết bằ g Kit DNA extract Qiage Sau đ xác đị h g độ DNA trê máy Na odrop bước s g 260 m Sử dụ g mẫu dươ g tí h WHO vero 76 ATCC-CRL 1587 NIBSC cu g cấp + Primer: Sử dụ g cặp mồi đặc hi u thiết kế ph mềm (Primer3 software http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input htm) trê tr h t DNA gười tế bào vero vị trí (loci) D19525 Genbank-NCBI mã số L13119 kích thước 245bp c tr h t (FGACCTGCAATCAGCCATTTT R-GTTCTTGCAGTCTGTGGCTTG) tham khảo từ báo khoa học (Almeida et al BMC Biotechnology 2011, 11:102) + Thà h ph phả ứ g PCR tổ g thể tich 50µl 8/14 Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 Bảng Thành ph n phản ứng PCR Hóa chất Thể tích/ống phản ứng (µl) F:Mồi xi 0.20mg/m (µ ) µl R: Mồi gược 0.20mg/m (µ ) µl dNTPs 250 μM µl μM MgC µl U AmpliTaq Gold DNA Polymerase µl 1ì GeneAmp PCR Gold buffer àl 0.16 mg/mL BSA µl DNA mẫu 10 g/µl 5µl Tổng thể tích 50 µl + Điều ki phả ứ g PCR trê máy App ied Biosystem, Mỹ Bảng Điều ki n phản ứng chu kỳ nhi t PCR Nhiệt độ o 95 C o Thời gian 11 phút 94 C phút 59 C o phút o phút o 15 phút 72 C 60 C o Số chu kì 4C ∞ - Tiêu chu đá h giá: 100% tr h t 45 uc eic DNA tế bào vero giố g mẫu chu quốc tế so sá h trê Ge ba k code ocut cô g bố trê NCBI quốc tế + Đi di sả ph m PCR trê thạch Agarose 3% điều ki 100v thời gia 35 phút, kiểm tra kết PCR máy SONY-UV soi ge c chụp ả h - Đọc kết quả: Thử ghi m c giá trị xuất hi kích thước mồi 245bp, mẫu âm khô g xuất hi 1500bp 9/14 bă g bă g di mẫu âm tươ g ứ g với di, bă g DNA marker Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 - Tiêu chu chấp thuậ : Xuất hi bă g di tươ g ứ g với mồi kích thước 245bp mẫu thử ghi m tế bào vero 6.2 Kiểm tra vô trùng - Phươ g pháp: Nuôi tr c tiếp trê môi trườ g tă g si h thích hợp o o - Mơi trường nhi t độ nuôi cấy: Thioglycolate/30-35 C Soybean/20-25 C - Số ượng ống tế bào kiểm tra: 10 ống - Số ượng ố g môi trường: ống Thioglycolate ống Soybean - Thể tích cấy: 1ml dung dịch tế bào 10 tế bào/ố g môi trường - Tiêu chu n chấp thuận: Không phát hi n thấy nấm tạp khu n sau 14 ngày nuôi theo dõi 6.3 Kiểm tra độ sống typ (ống) tế bào vero Phươ g pháp: Kiểm tra độ sống bằ g phươ g pháp uôi cấy tế bào trê môi trường MEM10%FBS nhằm xác định nồ g độ tế bào sống vị ống sau cất giữ tế bào hoàn thành ngân hàng MCB WCB o Đọc kết quả: Sau uôi cấy tế bào trê môi trườ g MEM10%FBS với tủ ấm 37 C, 5% CO2, qua sát h h thái đếm độ số g tế bào trê kí h hiể vi qua g học Tiêu chu đá h giá: Số ượ g tế bào số g ố g tế bào ≥ 90% so với cất tế bào 2x10 tế bào/typ/m theo tiêu chu WHO TRS No 978,2013 6.4 Kiểm tra tính đồng ống tế bào vero Phươ g pháp: Xác đị h độ sống ống tế bào vero giai đoạ đ u, cuối qui trình phân ống (typ) tế bào nhằm xác đị h tí h đồng ống tế bào vero MCB WCB Tiế hà h: Xác đị h số độ số g đặc tí h phát triể (h h thái, độ số g, thời gia hâ đôi tế bào) với số ượ g ố g tế bào gẫu hiê giai đoạ (đ u- giữacuối tro g tr h chia týp tế bào) Tiêu chu đá h giá: Độ số g ố g tế bào ≥ 90% so với cất giữ ( g độ 2x10 tế bào/typ/m ) Số ượ g tế bào số g ố g tế bào ằm tro g khoả g ±2SD đặc tí h phát triể ố g tế bào hư hau 6.5 Kiểm tra phát Mycoplasma 9/14 Phươ g pháp: Sử dụ g phươ g pháp PCR với cặp mồi tổ g hợp ge e 16S rRNA kích 10/14 Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 thước 1500bp sử dụ g tr h t ge e 16S rRNA M.capricolumsubsp capricolumstrain California Kid (Genbank-NCBI: 83283139) tham khảo từ tạp chí khoa học (Audrey Jean et al pone.0172358 February 22, 2017) Tiế hà h: + Tách chiết DNA: Mẫu thử tế bào vero tách chiết máy tách chiết t động RNA/DNA SaMag 12-Sacase Biotechnology (Sắp xếp protocol vào máy theo thứ t có sẵ , đá h số thứ t mẫu, g dươ g Mycoplasma pneumoniae ® ATCC 29342, chứng âm DNA virus viêm gan B (Hepatitis B virus ATCC® VR3232SD™) vào ố g đ ng mẫu ố g đ ng DNA khay mẫu máy tách chiết DNA/RNA t động, dùng micropipette hút 10µl RNA carier 10µl g dươ g vào ố g đ ng mẫu, hút 200 µl dung dịch tế bào MCB WCB, g dươ g, vào ố g đ ng mẫu theo số thứ t , đặt khay đ ng mẫu vào máy tách chiết DNA-RNA t độ g, dù g đ u đọc mã code FCO AS-8120 để nhập protocol barcode, sample volume, elution tube type elution volume vào máy, ấ E ter trê mà h h để máy bắt đ u tách chiết DNA DNA sau tách chiết xác định nồ g độ DNA máy Nanodrop bước sóng 260nm bảo quản tủ -20°C Sau đ xác định nồ g độ DNA máy Nanodrop bước sóng 260nm Sử dụng mẫu dương tính DNA WHO vero 76 ATCC-CRL 1587 NIBSC cung cấp + Primer: Sử dụ g cặp mồi đặc hi u thiết kế ph mềm (Primer3 software http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input htm) hư sau: 16S U1 F- GTTTGATCCTGGCTCAGGAYDAAC 16S U8 R- GAAAGGAGGTRWTCCAYCCSCAC Tham khảo (Audrey Jean et al pone.0172358 February 22, 2017) + Thà h ph phả ứ g PCR tổ g thể tich 40µl Bảng Thành ph n phản ứng PCR Hóa chất Thể tích/ống phản ứng (µl) F: Mồi xi 20µM µl R: Mồi gược 20µM µl 11/14 dNTPs 250 μM µl 12/14 Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 μM MgCl µl Enzym µl Buffe µl H2 O µl DNA mẫu 10 g/µl 5µl Tổng thể tích 40 µl + Điều ki phả ứ g PCR trê máy App ied Biosystem, Mỹ Bảng Điều ki n phản ứng chu kỳ nhi t PCR Nhiệt độ Thời gian o 95 C 10 phút o 95 C phút 65 C o phút o phút o 10 phút 72 C 72 C o 4C Tiêu chu Số chu kì 40 ∞ đá h giá: - Đọc kết quả: Thử ghi m c giá trị xuất hi bă g với kích thước mồi 1500bp, mẫu âm khơ g xuất hi 1500bp di mẫu dươ g tươ g ứ g bă g di, bă g DNA marker di sả ph m PCR trê thạch Agarose 3% điều ki 100v thời gia 35 phút, kiểm tra kết PCR trê máy SONY-UV soi ge c chụp ả h - Tiêu chu chấp thuậ : Khô g phát hi Mycop asma tro g mẫu tế bào vero 6.6 Kiểm tra tác nhân ngoại lai ngân hàng vero 6.6.1 Kiểm tra tác nhân ngoại lai chuột nhắt trưởng thành Phươ g pháp: Phát hi virus gây độc ngoại lai nhiễm vào tế bào hư virus viêm màng não mủ, coxsackieviruses, flavivirus, virus Dại nhiễm vào tế bào q trình ni cấy đ g ố g trê động vật chuột nhắt trưởng thành 13/14 Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 Tiến hành: Gây nhiễm hỗn dịch tế bào trê động vật thí nghi m với tỷ l tế bào x 10 tế bào/ml/10ml số ượng chuột 10 trọ g ượng 15-20 gram/chuột Và 10 chuột nhóm chứng Liều tiêm/Đườ g tiêm/số ượ g chuột: 0,5m /ổ bụ g/10 co 10 co / h m g sau đ theo dõi tu (21 gày) hằm Tiêu chu : ≥ 80% chuột số g khỏe mạ h, khô g c dấu hi u b ý 6.6.2 Kiểm tra tác nhân ngoại lai chuột lang: Mục đích: Phươ g pháp: Phát hi bào tro g virus goại vi khu tr h uôi cấy đ g ao c thể gây hiễm vào tế ố g trê chuột Tiế hà h: Gây hiễm hỗ dịch tế bào trê độ g vật thí ghi m với tỉ a g tế bào x 10 tế bào/m /40m với số ượ g chuột co với trọ g ượ g 350-450 gram/chuột sau đ theo dõi 42 ngày Liều tiêm/Đườ g tiêm/số ượ g chuột: m /ổ bụ g/co Tiêu chu : ≥ 80% chuột số g khỏe mạ h, khô g c dấu hi u b h ý 6.6.3 Kiểm tra tác nhân ngoại lai trứng gà có phơi: Phươ g pháp: Phát hi tác hâ gây hiễm tế bào tro g tr h uôi cấy gặt oại virus cúm, sởi, quai bị c thể ây hiễm tro g tr h uôi cấy đ g ố g Tiế hà h: Gây hiễm hỗ dịch tế bào trê trứ g gà c phôi với tỉ tế bào x 10 tế bào/m /10m với số ượ g trứ g gà c phôi 10 10-11 gày tuổi Liều tiêm: 0,5 m /quả Nhi t độ thời gia Tiêu chu uôi cấy: điều ki o 36±1 C/72h đá h giá: ≥ 80% phôi gà số g sau 72h theo dõi dịch i u khô g c vi rút gư g kết hồ g c u gà 6.7 Kiểm tra phát vi khuẩn lao Phươ g pháp: Phát hi n vi khu n lao tế bào vero 76 MCB01-18A WCB0118B bằ g phươ g pháp huộm Zielh-Neelsen phát hi n tr c khu quan sát kính hiển vi 14/14 ao đặc hi u Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 Tiến hành: Nuôi cấy 12 m môi trường nuôi cấy tế bào trê môi trường Lowenstein o Jenssen điều ki n 36±1 C thời gian 28 ngày Nhuộm Zielh-Neelsen quan sát kính hiển vi vật kính d u để phát hi n s có mặt tr c khu n Lao Tiêu chu n: Không phát hi n vi khu n lao mẫu thử 6.8 Kiểm tra tính ổn định ngân hàng tế bào vero bảo quản điều kiện tối ưu -70 C điều kiện ni tơ lỏng Phươ g pháp: Xác đị h độ sống ống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A NICVB-WCB01-18B bằ g phươ g pháp uôi cấy trê môi trường MEM10%FBS thời điểm khác hau tro g điều ki n bảo quản tối ưu Tiế hà h: Kiểm tra độ số g gâ hà g tế bào vero 76 MCB01-18A WCB 01-18B bảo hi t độ tối ưu -70 C tro g Nitơ ỏ g theo thời gia sau sả xuất thá g; thá g; 12 thá g Tại thời điểm thử ghi m ặp ại Tiêu chu : Tại thời điểm số ượ g tế bào số g trê ố g tế bào ≥ 90% so với úc sả xuất (2 x 10 tế bào/typ/m ) HỒ SƠ: Ghi chép tr h th c hi vào biểu mẫu - Biểu mẫu MT06-16-F1: Biểu mẫu uôi cấy tế bào - Biểu mẫu MT06-16-F2: Biểu mẫu kiểm tra hậ g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F3: Biểu mẫu kiểm tra vô trù g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F4: Biểu mẫu kiểm tra độ số g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F5: Biểu mẫu kiểm tra tí h đồ g hất ố g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F6: Biểu mẫu kiểm tra mycop asma tro g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F7: Biểu mẫu kiểm tra tác hâ goại tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F8: Biểu mẫu kiểm tra vi khu ao tro g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F9: Biểu mẫu kiểm tra tí h ổ đị h tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F10: Phiếu pha môi trườ g MEM 10%FBS - Biểu mẫu MT06-14-F11: Phiếu pha PBS(-) 1X - Biểu mẫu MT06-14-F12: Pha du g dịch Hepes 15/14 Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (NICVB) SOP: Đán h giá ch ất lư ợ ng tế bào ver o MT06-16 TÀI LIỆU VIỆN DẪN - Qui tr h chu - Qui tr h chu phối mẫu chu (SOP-KĐQG MT-06-14) uôi cấy gặt tế bào (SOP-KĐQG số 31) hướ g dẫ ý, bảo phâ dù g tro g kiểm đị h chất ượ g vắc xi si h ph m - WHO (2013) Guidelines for preparation, characterization and establishment of International and other standard and refneuce for biological substances N 800, Annex - WHO (2013), Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for the characterization of cell banks, WHO Expert Committee on Biological Standardization, Sixty-first report Geneva, World Health Organization, WHO Technical Report Series, No 978, Annex PHỤ LỤC - Biểu mẫu MT06-16-F1: Biểu mẫu uôi cấy tế bào - Biểu mẫu MT06-16-F2: Biểu mẫu kiểm tra hậ g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F3: Biểu mẫu kiểm tra vô trù g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F4: Biểu mẫu kiểm tra độ số g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F5: Biểu mẫu kiểm tra tí h đồ g hất ố g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F6: Biểu mẫu kiểm tra mycop asma tro g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F7: Biểu mẫu kiểm tra tác hâ goại tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F8: Biểu mẫu kiểm tra vi khu ao tro g tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F9: Biểu mẫu kiểm tra tí h ổ đị h tế bào vero - Biểu mẫu MT06-16-F10: Phiếu pha môi trườ g MEM 10%FBS - Biểu mẫu MT06-14-F11: Phiếu pha PBS(-) 1X - Biểu mẫu MT06-14-F12: Pha du g dịch Hepes 16/14 ... qui trình chuẩn Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin sinh phẩm y tế đạt tiêu chuẩn WHO 51 4.3 Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A... xuất ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A vero 76 NICVB-WCB01-18B chuẩn quốc gia 37 3.2 Quy trình chuẩn Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin sinh. .. chuẩn quốc gia dùng cho kiểm định chất lượng vắc xin sinh phẩm y tế nhu cầu cấp thiết phù hợp với y u cầu thực tế nâng cao lực quan NRA kiểm định quốc gia công tác kiểm định giám sát chất lượng vắc