Sự xâm nhập của kháng nguyên hệ hồng cầu kích thích cơ thể sản sinhkháng thể bất thường, làm xuất hiện các phản ứng miễn dịch không mongmuốn chống lại hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và các
Trang 1Chuyên ngành : Kỹ thuật xét nghiệm y học
Mã số : 8720601
ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS NGUYỄN QUANG TÙNG
Trang 2PHỤ LỤC
Trang 3APTT : Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa.
(Activated Partial Thromboplastin Time)
Trang 6ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay trên thế giới đã phát hiện được rất nhiều hệ nhóm máu hồngcầu, theo Hội Truyền máu Quốc tế đã có 36 hệ thống nhóm máu hồng cầuđược phát hiện với trên 300 kháng nguyên hồng cầu khác nhau [1] Trong đó
hệ thống nhóm máu Rh đóng vai trò quan trọng thứ hai sau hệ thống nhómmáu ABO, và kháng nguyên D của hệ Rh là kháng nguyên quan trọng nhất[2], [3], [4], [5]
Sự xâm nhập của kháng nguyên hệ hồng cầu kích thích cơ thể sản sinhkháng thể bất thường, làm xuất hiện các phản ứng miễn dịch không mongmuốn chống lại hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và các protein trong máu [2]Ngoài ý nghĩa trong truyền máu, kháng nguyên D của hệ Rh còn có vai tròtrong bệnh tan máu trẻ sơ sinh Người mẹ Rh(D) âm mang thai Rh(D) dương,nếu có tổn thương bánh rau hoặc do chuyển dạ, hồng cầu trong máu con cóthể vào tuần hoàn mẹ, gây kích thích sinh kháng thể chống D Kháng thể này
có thể qua bánh rau, gắn lên hồng cầu thai nhi gây ra ngưng kết, phá hủy hồngcầu bào thai Tùy thuộc vào lượng kháng thể cơ thể mẹ sản xuất gây hậu quả
là thai nhi có khả năng bị chết lưu, thiếu máu; trẻ sơ sinh bị vàng da tan huyết,
ứ nước ở não; người mẹ có thể vô sinh do thai lưu liên tiếp [6], [7]
Thai phụ nhóm máu Rh(D) âm cần được quản lý và theo dõi chặt chẽ đểgiảm thiểu các biến chứng với thai nhi cũng như trẻ sơ sinh Để có một đánhgiá chung sơ bộ về các thông số xét nghiệm huyết học ở thai phụ Rh(D) âm
có sinh kháng thể bất thường sau sinh tại Bệnh viện PSTW, chúng tôi tiến
Trang 7hành nghiên cứu: “Nghiên cứu một số chỉ số huyết học ở thai phụ Rh(D)
âm có kháng thể bất thường tại Bệnh viện Phụ sản trung ương” với các
mục tiêu sau:
1 Tìm hiểu tỉ lệ thai phụ nhóm máu Rh(D) âm có sinh kháng thể bất
thường sau sinh.
2 Khảo sát một số chỉ số tế bào máu ngoại vi và đông máu cơ bản ở thai
phụ Rh(D) âm.
Trang 8Chương 1 TỔNG QUAN
1.1 Kháng thể bất thường.
1.1.1 Định nghĩa.
Kháng thể hồng cầu có hai loại là kháng thể tự nhiên và kháng thể miễndịch Kháng thể của một số hệ như MNS, Chido,… là kháng thể tự nhiên, cóbản chất là IgM Các kháng thể này thường ít và cũng ít ý nghĩa lâm sàng.Kháng thể miễn dịch có bản chất là IgG, các KT này thích hợp hoạt động ở37°C và AHG, thuộc các hệ nhóm máu Rh, Kell, Kidd, Duffy, [8]
Kháng thể bất thường là kháng thể xuất hiện sau quá trình tiếp xúc trựctiếp với một hoặc nhiều kháng nguyên lạ từ hồng cầu của người hiến máuhoặc của thai nhi đưa vào cơ thể bệnh nhân hay sản phụ Các KTBT này cóthể là kháng thể tự nhiên (có bản chất là IgM), hoạt động tốt ở 4°C, có thể gâyngưng kết hồng cầu trực tiếp; KTBT cũng có thể là kháng thể miễn dịch (cóbản chất IgG), các kháng thể này thường được cảm nhiễm lên bề mặt hồngcầu, nhưng không gây ngưng kết hồng cầu trực tiếp [10], [11]
Để phát hiện các kháng thể loại IgG trong phòng thí nghiệm, người ta phải áp dụng một số biện pháp như: thay đổi nhiệt độ, sử dụng môi trường có lực ion thấp (đệm Liss),enzyme protein, môi trường đại phân tử và đặc biệt là sử dụng nghiệm phápAHG để hỗ trợ g n các KT miễn dịch này lên HC hoặc làm cầu nối để nối cácHC đã được cảm nhiễm KT, nhờ vậy có thể quan sát được bằng mắt thường hiện tượng ngưng kết [12], [13]
1.1.2 Cơ chế sinh KTBT ở thai phụ.
Trong các trường hợp có bất đồng kháng nguyên nhóm máu giữa mẹ
và thai, các tế bào hồng cầu của thai mang các kháng nguyên được đi truyền
từ người bố, các kháng nguyên này không có trên hồng cầu của mẹ, tổn
Trang 9thương bánh rau trong qua trình mang thai hoặc trong quá trình chuyển dạ vìmột lý do nào đó mà hồng cầu của con lọt vào hệ tuần hoàn của mẹ, cáckháng nguyên này sẽ kích thích hệ miễn dịch của mẹ tạo ra các kháng thể đặchiệu chống lại các kháng nguyên có trên hồng cầu của con Kháng thể đượctạo thành có bản chất là IgG, có thể lọt qua được hàng rào nhau thai Ở nhữnglần mang thai tiếp theo nếu hồng cầu thai nhi vẫn mang các kháng nguyên đó,kháng thể từ mẹ sẽ cố định trên hồng cầu của con, kết hợp sự có mặt của bổthể gây vỡ hồng cầu con, là cơ chế gây bệnh vàng da tan máu ở trẻ sơ sinh[7], [14], [15], [16], [17].
1.1.3 Hậu quả
Gây tai biến truyền máu
Kháng thể bất thường có thể gây phản ứng tan máu Hồng cầu củangười hiến máu có kháng nguyên tương ứng với KTBT của người bệnh, nếungười bệnh được truyền máu thì sẽ xảy ra phản ứng truyền máu [18]
Tùy theo bản chất, hiệu giá và từng loại kháng thể mà mức độ phản ứng của
cơ thể sẽ khác nhau
Phản ứng tan máu trong lòng mạch: Là sự phá vỡ hồng cầu ngay trong
lòng huyết quản, giải phóng hemoglobin vào huyết tương Phản ứng tan máutrong lòng mạch thường gặp trong các trường hợp truyền nhầm nhóm máu hệABO, với các triệu chứng lâm sàng rất nguy kịch và trầm trọng (huyết sắc tốcủa bệnh nhân tụt rất nhanh, trụy mạch, hạ huyết áp, suy thận cấp), nếu không
xử trí kịp thời bệnh nhân có thể tử vong [19], [20], [21], [22]
Phản ứng tan máu ngoài lòng mạch (Phản ứng tan máu muộn): Là sự
phá vỡ HC xảy ra ngoài lòng mạch, các tế bào thực bào của hệ liên võngnội mô thực bào những hồng cầu đã được gắn các kháng thể miễn dịch vàmang chúng ra khỏi hệ thống tuần hoàn đưa tới gan, lách để phá hủy Khángthể gây phản ứng tan máu ngoài lòng mạch thường có bản chất IgG, được
Trang 10phát hiện cùng với sự phát hiện ra các kháng thể của các nhóm máu ngoài hệABO như: kháng thể chống D của hệ Rh, kháng thể chống K của hệ Kell,kháng thể chống Lea và kháng thể chống Leb của hệ Lewis,… hầu hết cáckháng thể này được phát hiện một cách ngẫu nhiên qua nghiên cứu huyếtthanh của những bệnh nhân có phản ứng tan máu muộn hoặc những bà mẹ cócon bị vàng da tan huyết ngay sau sinh [9], [13], [21]
Phản ứng tan máu muộn là phản ứng xảy ra sau một đến vài tuần bệnhnhân được truyền máu không hòa hợp kháng nguyên nhóm máu Các khángnguyên có trên hồng cầu của người cho khi truyền vào cơ thể bệnh nhân sẽkích thích sinh ra các kháng thể chống lại các kháng nguyên đó, sau vài tuầntruyền máu, các kháng thể miễn dịch mới được hình thành này sẽ được cốđịnh lên bề mặt hồng cầu của người cho và gây vỡ hồng cầu Những lầntruyền máu sau, đáp ứng miễn dịch thứ phát sẽ xảy ra khi cơ thể người bệnhlại tiếp tục tiếp xúc với các kháng nguyên tương ứng với các kháng thể đã cósẵn trong huyết thanh của bệnh nhân, gây nên phản ứng tan máu cấp tronglòng mạch [9], [23], [24]
Gây bệnh vàng da tan máu ở trẻ sơ sinh
Kháng thể bất thường có sẵn trong huyết thanh của người mẹ có thểqua nhau thai vào máu thai nhi, nếu có bất đồng kháng nguyên hồng cầu giữa
mẹ và con sẽ gây bệnh vàng da tan máu ở trẻ sơ sinh [7], [14]
Một số đặc điểm lâm sàng của tan máu trẻ sơ sinh thứ phát do bất đồng
Rh bao gồm lờ đờ, xanh xao, vàng da, xơ cứng bì, nhịp tim nhanh, nhịp timnhanh và hạ huyết áp thai nhi thiếu máu tán huyết nghiêm trọng, đe dọa tínhmạng (xuất hiện ít nhất hai trong số các trường hợp sau: phù, tràn dịch màngtim, tràn dịch màng phổi, cổ trướng) và có liên quan đến tỷ lệ tử vong đáng kểước tính là hơn 50% [25] [26]
Trang 111.2 Nhóm máu hệ Rh
1.2.1 Lịch sử phát hiện
Từ năm 1939, Levine và Stetson đã phát hiện một kháng thể bất thườngtrong huyết thanh của một sản phụ có con bị bệnh vàng da tan máu, kháng thểnày ngưng kết với hồng cầu của cha và con nhưng không làm ngưng kết hồngcầu của mẹ Năm 1940, Karl Lansteiner và Wiener dùng hồng cầu khỉ Rhesusgây miễn dịch trên thỏ, thu được một kháng thể mà gây ngưng kết với khoảng85% hồng cầu người và họ đã gọi tên yếu tố đó là Rh Tuy nhiên người đượccông nhận phát hiện ra kháng nguyên D là Levine và cộng sự [3], [27]
Năm 1941, thêm ba kháng nguyên của hệ Rh được phát hiện là C, E, c bởiWiener, Race và Levine Năm 1945, Mourant phát hiện thêm kháng nguyên ecủa hệ Rh Cho đến nay khoảng 55 kháng nguyên khác nhau của hệ Rh đãđược phát hiện, tuy nhiên kháng nguyên chính của hệ Rh vẫn là kháng nguyên
19 % ở người da trắng và 3% ở người da đen [2] [30] [31]
Cho đến nay đã có rất nhiều kháng nguyên của hệ nhóm máu Rh đãđược phát hiện Người ta tìm thấy kháng nguyên D yếu, trên hồng cầu ngườimang kháng nguyên này có kháng nguyên D nhưng không ngưng kết với tất
cả kháng thể chống D Trong truyền máu người D yếu được coi là Rh dươngkhi cho máu và nếu nhận thì coi là Rh âm Kháng nguyên C(w) là một sảnphẩm biến thể của allen C và c Mẹ không có C(w) mang thai có C(w) có thểtạo kháng thể và gây vàng da tan máu sơ sinh.[2], [3], [32]
Trang 121.2.3 Kháng thể hệ Rh
Kháng thể của hệ Rh hầu hết là kháng thể miễn dịch có bản chất là IgG,chúng có thể lọt qua đường hàng rào nhau thai Kháng thể tự nhiên của hệ Rhrất hiếm gặp Kháng thể của hệ Rh được sinh ra do quá trình miễn dịch bởicác kháng nguyên của hệ Rh thường do người có nhóm máu Rh âm nhận máu
Rh dương hoặc do bất đồng nhóm máu mẹ con hệ Rh, mẹ nhóm máu Rh âm
và con nhóm máu Rh dương Kháng thể quan trọng nhất có ý nghĩa trên lâmsàng của hệ Rh là kháng thể chống D [2],[3] [21] [30]
Bất đồng nhóm máu Rh khác nhau giữa các quần thể Ước tính rằng tầnsuất bất đồng Rh xảy ra thường xuyên hơn ở những người gốc da trắng (Bắc
Mỹ và châu Âu) (15% đến 17%) so với người gốc Phi (4% đến 8%) hoặc gốc
Á (0,1% đến 0,3%) [33] [34]
1.2.4 Khả năng sinh kháng thể của kháng nguyên D hệ Rh
Các kháng nguyên D, C, c, E, e của hệ Rh đều có khả năng gây miễndịch tạo ra các KT tương ứng, tuy nhiên tính sinh miễn dịch của khángnguyên D là mạnh nhất
Bảng 1.1 Tính sinh miễn dịch của một số kháng nguyên [30]
Kháng nguyên hồng cầu Hệ nhóm máu Tính sinh miễn dịch (%)
Trang 131.3 Một số nghiên cứu liên quan
Nghiên cứu của tác giả Derek trên 629 phụ nữ mang thai thu được tỷ lệ
có KTBT là 0,57% , trong đó bao gồm 373 kháng thể có ý nghĩa lâm sàngđược tìm thấy ở 261 bà mẹ (0,24%) [35]
Altuntas N và cộng sự nghiên cứu trên 4840 phụ nữ mang thai ở ThổNhĩ đã xác định có 743 phụ nữ có kiểu hình âm tính với kháng nguyên D(15,35%) Tỷ lệ sinh KTBT được xác định là 8,74% trong nhóm Rh(D) âm,trong đó kháng thể chống D chiếm 68,57% Trong khi tỷ lệ alloim hóa đối vớikháng nguyên D là 6,46%, tỷ lệ alloim hóa không D là 2,69% ở phụ nữ mangthai Rh âm tính [36]
Nghiên cứu của Sabija Izetbegovic trên tổng số 596 sản phụ Rh(D) âmtính có A RhD âm tính 42%; O Rh D âm 33%; B Rh D âm 17% và AB Rh D âm8% Hầu hết các kháng thể miễn dịch xuất hiện ở những bà mẹ có nhóm máu O
Rh D âm Sự xuất hiện của các KTBT ở những bà mẹ âm tính Rh D là 1% [37]
1.4 Kỹ thuật sàng lọc kháng thể bất thường
1.4.1 Kỹ thuật Scangel/Gelcard
Nguyên lý: Dựa vào phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể có trong huyết
tương/ huyết thanh bệnh nhân với kháng nguyên tương ứng có trên bề mặthồng cầu, sau đó được lọc qua cột gel để phát hiện ngưng kết
Các cột gel chứa đựng hạt gel và dung dịch NaCl 0,9% (cột gel nướcmuối 0,9%) hoặc cột gel có chứa các hạt gel, dung dịch liss và thuốc thử AHG(cột gel AHG) Dung dịch hồng cầu được phân bố trong mỗi cột gel cùng vớihuyết thanh hoặc huyết tương Cột gel được ủ hoặc ly tâm trực tiếp theohướng dẫn của nhà sản xuất Những tế bào hồng cầu không ngưng kết lọt quacác hạt gel và tập trung ở dưới đáy của cột gel sau khi ly tâm, trong khi nhữngđám ngưng kết sẽ phân bố dọc theo chiều dài của cột gel tùy thuộc vào mức
độ ngưng kết
Trang 14Đánh giá các mức độ ngưng kết của kỹ thuật gelcard:
• Không ngưng kết : Hồng cầu tự do lắng xuống đáy cột gel;
• Ngưng kết 1+: Các đám hồng cầu ngưng kết tập trung chủ yếu ở 1/3 dướicủa cột gel, nhiều hồng cầu tự do ở đáy cột gel;
• Ngưng kết 2+: Các đám hồng cầu ngưng kết trải theo chiều dài 1/2 trêncủa cột gel, có khá nhiều hồng cầu tự do ở đáy cột gel;
• Ngưng kết 3+: Các đám hồng cầu ngưng kết tập trung chủ yếu ở 1/3 trêncủa cột gel, rất ít hồng cầu tự do ở đáy cột gel;
• Ngưng kết 4+: Ngưng kết là một đám lớn tập trung trên bề mặt của cộtgel, không còn hồng cầu tự do ở đáy cột gel
1.4.2 Bộ panel sang lọc kháng thể bất thường
Tại các nước tiên tiến ở Châu Âu và Châu Mỹ, việc sàng lọc KTBTđược thực hiện rất sớm từ những năm đầu của thập kỷ 70 để ngăn các tai biếntruyền máu [38]
Bộ panel HC sàng lọc KTBT thường được xây dựng bao gồm 3 hồngcầu của người nhóm O, trên cả 3 hồng cầu đã được lựa chọn phải có cáckháng nguyên : D, C, c, E, e, M, N, S, s, Mia, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka,
Jkb Mỗi một bộ panel hồng cầu sàng lọc KTBT của một lô sản xuất sẽ đượcnhà sản xuất được cung cấp kèm theo một bảng danh sách cụ thể các khángnguyên có trên mỗi hồng cầu, điều này có ý nghĩa hết sức quan trọng để giúpcho người sử dụng phân tích được kết quả xét nghiệm sàng lọc KTBT Tạikhoa Huyết học bệnh viện phụ sản trung ương sử dụng bộ panel sàng lọc doviện Huyết học truyền máu Trung ương sản xuất và phân phối
1.5 Kết quả xét nghiệm huyết học ở thai phụ bình thường
Khi có thai, cơ thể người phụ nữ có nhiều thay đổi:
Khối lượng máu tăng cao nhất vào tháng thứ 7, sau đó hằng định trongnhững tuần lễ cuối của thai kỳ Sau đẻ, khối lượng máu giảm nhanh và dần
Trang 15dần trở lại bình thường Do khối lượng huyết tương tăng nhiều hơn hồng cầu,nên số lượng hồng cầu, lượng huyết sắc tố, hematocrit trong máu giảm nhẹ.
Độ quánh của máu cũng giảm, máu có xu hướng loãng làm cho máu thiếumáu nhược sắc và giảm áp lực thẩm thấu [39] [40] [41]
Số lượng tiểu cầu ở phụ nữ có thai thường giảm nhẹ Nguyên nhân cóthể do các yếu tố pha loãng máu hoặc tăng dung nạp tiểu cầu Giảm tiểu cầu
do thai xuất hiện ở hình thái giảm tiểu cầu sinh lý trên thai kỳ bình thường Sốlượng tiểu cầu thường giảm nhẹ: 80G/L – 150 G/L Số lượng tiểu cầu trở vềbình thường 2 đến 12 tuần sau sinh [42] [43]
Phụ nữ có thai có sư thay đổi hê thống đông cầm máu theo hướng tăngđông để giảm thiểu nguy cơ chảy máu trong thời gian mang thai và đặc biệttrong lúc chuyển dạ Đây là một trong những phản ứng tự bảo vệ của cơ thể.Fibrinogen bình thường 2 – 4 g/l, khi có thai thường tăng 50%
Trang 16Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Toàn bộ các thai phụ đến khám và sinh con tại Bệnh viện phụ sản Trungương trong thời gian từ 01/01/2018 đến 30/04/2020
2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu
Bệnh nhân được chỉ định làm xét nghiệm tổng phân tích tế bào máungoại vi, đông máu cơ bản, sang lọc kháng thể bât thường
2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ
- Mẫu máu huyết tán; bị đông dây; mẫu máu lấy sai thể tích quy định
- Bệnh nhân có kết quả xét nghiệm Coombs trực tiếp dương tính
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang, hồi cứu
2.2.2 Phương pháp chọn mẫu
Sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện, có chủ đích
2.2.3 Các biến số nghiên cứu
• Thông tin chung
- Thông số đông máu: TT, PT(%), APTT, fibrinogen
2.2.4 Quy trình nghiên cứu
- Lựa chọn đối tượng nghiên cứu
- Thực hiện xét nghiệm sàng lọc kháng thể bất thường
Trang 17Kỹ thuật scangel/gelcard Bệnh nhân nhóm máu Rh(D)âm
Thu thập KQ XN tế bào máu ngoại vi, đông máu
Mô tả tỷ lệ, phân bố
Bệnh nhân không có KTBT Bệnh nhân có KTBT
- Thu thập kết quả XN tế bào máu ngoại vi, đông máu cơ bản
- Tính giá trị trung bình của từng loại thông số
- So sánh các giá trị giữa các nhóm
• Sơ đồ thiết kế các bước nghiên cứu:
Sơ đồ nghiên cứu theo mục tiêu
2.2.5 Phương tiện và vật liệu nghiên cứu
• Mẫu máu xét nghiệm:
- Lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống nhựa không có chất chống đông: Mẫu máu được để đông tự nhiên, ly tâm ống máu, tách huyết thanh để làm XN sang lọc kháng thể bất thường, ghi tên, tuổi, mã bệnh nhân, ngày lấy mẫu
Trang 18- Lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống nhựa có sẵn chất chống đông bằng EDTAnước, làm xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi.
- Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào ống nghiệm có sẵn chất chống đông natricitrate 3,2% với tỉ lệ 1/10, lấy huyết tương làm các xét nghiệm đông máu cơbản
- Mẫu máu phải không có biểu hiện tan máu, nhiễm trùng
- Hệ thống máy làm gelcard: máy ủ, máy ly tâm, máy nhóm máu tự động
SA-120 hãng Hybiome (TRung Quốc)
- Máy ly tâm ống máu hãng Hitachi (Nhật Bản)
- Tấm gelcard nước muối: Neutral gelcard: bên trong cột gel có chứa sẵn hạtgel và dung dịch NaCl 0,9%
- Tấm gelcard định nhóm máu hệ ABO và hệ Rh(D), trong cột gel chứa sẵn cácloại kháng thể
- Bộ panel hồng cầu sàng lọc kháng thể bất thường do Viện Huyết học Truyềnmáu Trung ương sản xuất gồm có 3 hồng cầu nhóm O (O1, O2, O3) mang cáckháng nguyên của hệ nhóm máu Rh và các hệ ngoài ABO khác
- Dung dịch pha loãng hồng cầu: Matrix TM diluent – 2 LISS
- Dung dịch nước muối NaCl 0,9%
Trang 192.2.6 Các kỹ thuật xét nghiệm được sử dụng.
2.2.6.1 XN định nhóm máu hệ ABO và Rh(D)
Được thực hiện trên cùng một tấm gelcard trên máy phân tích tự động SA-120
Quy trình:
- Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, sinh phẩm
+ Bật máy SA-120; bật máy tính và kiểm tra kết nối với hệ thống mạng
+ Kiểm tra hoá chất
- Nhận bệnh phẩm và kiểm tra thông tin, chất lượng bệnh phẩm
- Chạy mẫu:
+ Đặt mẫu vào từng rack và quay barcode ra ngoài
+ Chọn xét nghiệm cần chạy
+ Kích vào biểu tượng bắt đầu
+ Máy sẽ tự động phân tích và đẩy kết quả ra hệ thống mạng
2.2.6.2 Xét nghiệm sàng lọc KTBT (Kỹ thuật Scangel/Gelcard):
Nguyên lý: sử dụng huyết thanh kháng globulin người (AHG) để xác
định sự có mặt của các kháng thể miễn dịch (Bao gồm các kháng thể hoặcthành phần bổ thể là globulin) có tự do trong huyết thanh của người bệnh
Các bước thực hiện:
- Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, hóa chất, sinh phẩm
- Tách huyết thanh bệnh nhân: ly tâm ống máu 3000 vòng/phút trong 3 phút ởnhiệt độ phòng
- Chuẩn bị hồng cầu 1%: trong 4 ống nghiệm sạch, trộn lần lượt 50 µl hồng cầuO1, O2, O3 với 200 µl dung dịch pha loãng hồng cầu Diluent-2 vào 3 ống;
Trang 20trộn 10 µl hồng cầu bệnh nhân với 1ml Diluent-2 vào ống thứ 4, lắc nhẹnhàng cả 4 ống để trộn đều.
• Sàng lọc KTBT ở điều kiện nhiệt độ phòng 22°C
- Ghi thông tin bệnh nhân lên tấm gelcard, nhỏ 50 µl hồng cầu O1, O2, O3 1%lần lượt vào ba cột gel
- Nhỏ tiếp 50 µl dung dịch hồng cầu bệnh nhân 1% vào cột gel thứ tư để làmchứng tự thân
- Nhỏ vào mỗi cột 25 µl huyết thanh bệnh nhân
- Ủ gelcard ở nhiệt dộ phòng 22 °C trong 15 phút
- Ly tâm gelcard 900 vòng/phút trong 10 phút bằng máy ly tâm chuyên dụng
- Đọc kết quả
• Sang lọc KTBT ở điều kiện 37 °C và AHG
Tương tự như ở điều kiện 22°C Nhưng sử dụng tấm gelcard AHG và ủtấm gelcard ở 37°C trong 15 phút bằng máy ủ chuyên dụng
• Nhận định kết quả
- Đọc kết quả khi chứng tự thân âm tính
- Nếu phản ứng ngưng kết ở 1 hoặc cả 2, 3 hồng cầu panel sang lọc KTBT,ngưng kết với 1 hoặc tất cả các điều kiện: Dương tính
- Nếu phản ứng không ngưng kết với tất cả hồng cầu panel ở tất cả các điềukiện: Âm tính
2.2.6.3 Hiệu giá kháng thể miễn dịch
Nguyên lý: Kỹ thuật này được sử dụng để đo lường mức độ kháng thể
liên kết với các kháng nguyên, bằng cách pha loãng mẫu cần được xác địnhkháng thể theo một bậc nhất định, sau đó cho hồng cầu vào, xác định sựngưng kết ở nồng độ pha loãng tối đa Ở độ pha loãng tối đa mà vẫn nhìn thấyđược sự ngưng kết thì gọi là hiệu giá
Kỹ thuật hiệu giá kháng thể được thực hiện trên gelcard AHG và sửdụng hồng cầu trong bộ panel sàng lọc kháng thể bất thường
Các bước thực hiện:
- Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, hóa chất, sinh phẩm
Trang 21- Tách huyết thanh bệnh nhân: ly tâm ống máu 3000 vòng/phút trong 3 phút
ở nhiệt độ phòng
- Chuẩn bị hồng cầu 1%: trong 1 ống nghiệm sạch, pool 3 loại hồng cầuO1, O2, O3 mỗi loại 50 µl Thêm 600 µl dung dịch pha loãng hồng cầuDiluent-2, lắc nhẹ
- Chuẩn bị huyết thanh pha loãng:
+ Trong 10 ống nghiệm sạch được đánh số theo bậc 2^(-1-n) (1/2, 1/4,1/8, …, 1/1024), phân bố 100 µl nước muối 0,09% vào mỗi ống
+ Trộn đều 100 µl huyết thanh vào ống thứ nhất (1/2), hút ra 100 µldung dịch chuyển sang ống thứ hai (1/4) trộn đều, hút ra 100 µl ở ốngthứ hai và tiếp tục làm tới ống số 10
- Ghi thông tin bệnh nhân lên tấm gelcard, nhỏ 50 µl hồng cầu 1% lần lượtvào 10 cột gel đã đánh số
- Nhỏ vào mỗi cột 25 µl huyết thanh huyết thanh pha loãng theo thứ tự
- ủ gelcard ở nhiệt độ 37°C trong 15 phút
- Ly tâm gelcard 900 vòng/phút trong 10 phút bằng máy ly tâm chuyên dụng
- Đọc kết quả Hiệu giá kháng thể bằng cột gel cuối cùng còn ngưng kết
2.2.6.4 Kỹ thuật xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu trên máy phân tích huyết học tự động DxH600 của Beckman couter
Tiến hành hiệu chuẩn khi:
- Thay lô QC mới
- Kết quả QC vi phạm luật 10x (lỗi hệ thống)
- Sau bảo dưỡng thay thế các bộ phận quan trọng của máy
Kiểm tra chất lượng:
- Bảo dưỡng máy hàng ngày, hàng tuần và hàng tháng
- Hoá chất khi đem sử dụng cần được kiểm tra xem còn hạn sử dụng không
- Đảm bảo chất lượng xét nghiệm theo quy trình đảm bảo chất lượng:
+ Chạy nội kiểm (3 mức: Control High, Control Low và Control Normal)đầu ngày làm việc, sau khi bảo dưỡng và sửa chữa máy
+ Thực hiện ngoại kiểm theo quy trình ngoại kiểm