BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH THỰC PHẨM

THỰC HÀNH VI SINH THỰC PHẨM

9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text Xem bản đầy đủ ­30% Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­30% ­25% TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH     VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM GVHD: BÙI HỒNG QN Chúng Ta Rồi Sẽ Ổn Chúng Ta Rồi Sẽ Ổn Thơi ­25% Nhà Giả Kim ­25% Thơi LỚP: ĐHTP5 – NHĨM 5 SVTH: Lê Thị Mỹ Vân MSSV: 09078531 ­25% Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011 Kẻ Trộm Sách (Tái Bản 2015) Bên Nhau Trọn Đời ­ Tái Bản 2015 (Tặng Kèm Poster ) cho những đơn BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH THỰC PHẨM ­30% ­25% MỤC LỤC  Bài 1: Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm và các phương pháp  tiệt trùng vi sinh vật 3 Quốc Gia Khởi Nghiệp Bài 2: Phương pháp pha chế mơi trường ni cấy vi sinh vật 6 Bài 3: Phương pháp ni cấy vi sinh vật 10 Thiên Đường Nhiệt Đới (Sách Tơ Màu) Quốc Gia Khởi Nghiệp Bài 4: phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học 16 Bài 5: Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 19 Bài 6: Phương pháp phân lập vi sinh vật 20 Bài 10: Khảo sát đặc tính sinh hóa của vi sinh vật 23 Bài 13: Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp 35 Bài 14: Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 37 Bài 15: Định lượng Coliform bằng phương pháp MPN 39 Bài 19: Phương pháp định lượng E.coli trong thực phẩm 41 Bài 20: Phương pháp phân tích Salmonella spp. trong thực phẩm 43 Bài 21: Phương pháp phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm 46 Bài 22: Phương pháp phân tích định lượng Staphilococcus aureus  trong thực phẩm 48 Bài 24: Phương pháp phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm 50 http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 1/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text ­30% BÀI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ ­25% CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT Báo cáo thực tập 1. Trình bày u cầu của việc bao gói dụng cụ ni ấy vi sinh vật? u cầu của việc bao gói dụng cụ ni cấy vi sinh vật: ­ Phần giấy bao bên ngồi phải chặt và kín Chúng Ta Rồi Sẽ Ổn Thơi Đọc Vị Bất Kỳ Ai ­ Để Khơng Bị Lừa Dối Và Lợi Dụng ­ Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt ­25% ­ Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khơ khi khử trùng ướt ­25% ­ Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín tồn bộ. Có thể dùng hộp nhơm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng 2. Cơng dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật? Khu Vườn Bí Mật (Coloring Book) Cơng dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật: ­30% Quốc Gia Khởi Nghiệp ­25% a. Nồi hấp ướt (autoclave):  Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao, được sử dụng để hấp khử trùng mơ trường, một số ngun liệu và dụng cụ thí nghiệm b. Kính hiển vi: Khu Vườn Thời Gian (Sách Tơ Màu Dành Cho Người Lớn) Cơng dụng: dùng để nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính Kẻ Trộm Sách (Tái Bản 2015) c. Các dụng cụ thí nghiệm Dụng cụ thủy tinh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định mức… ­ Phiến kính (lame): dùng làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lý tế bào vi sinh vật ­ Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bơi trên tiêu bản cố định vi sinh vật trong qua trình nghiên cứu ­ Đĩa petri: dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm ni cấy và phân lập của tế bào vi sinh vật ­ Que trãi: phân lập vi sinh vật theo phương pháp trãi đĩa ­ Que cấy: + Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh trên đối tượng đơn bào như vi khuẩn, nấm men + Que cấy nhón: dùng để cấy sâu trên mơi trường rắn + Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ nấm ­ Micro pipette: sử dụng khi cần hút một lượng chính xác mơi trường http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 2/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text 4.Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và mơi trường ni cấy vi sinh vật? Phương pháp tiệt trùng dụng cụ và mơi trường ni cấy vi sinh vật: a. Phương pháp lý học: Nhiệt khơ: ­ Đối với dụng cụ cấy kim loại, đơi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng là đốt trục tiếp trên ngọn lửa đèn cồn ­ Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói và sấy ở 160 C trong 1­2 giờ hoặc 180 C trong 30 phút Nhiệt ẩm: ­ Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sơi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đơng kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật. Chỉ diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử vẫn còn ­ Phương pháp Pasteur: chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh, khơng diệt bào tử và vi khuẩn hoại sinh. Phương pháp này thường dùng ở nhiệt độ 70­75 C trong thời gian 10­15 phút ­ Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70­80 C, mỗi lần 30­60 phút và liên tiếp trong ba ngày liền ­ Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. Thường dùng ở nhiệt độ 121 C trong 15­30 phút Diệt trùng bức xạ: ­ Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, khơng xun sâu vào mẫu vật ­ Tia âm cực dùng trong tiệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử trùng phải bao gói kính Diệt trung bằng cách lọc: ­ Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose,… có kích thước lỗ lọc từ 0,2­0,45μm, thường dùng để lọc những vật phẩm lỏng khơng khử trùng bằng nhiệt được http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 3/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text ­ Đối với khử trùng khơng khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn b. Phương pháp hóa học ­ Chỉ sát khuẩn ngồi da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu ­ Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor… BÀI 2: CÁCH PHA CHẾ CÁC LOẠI MƠI TRƯỜNG I. TRẢ LỜI CÂU HỎI 1. Trình bày khái niệm mơi trường và phân loại mơi trường ni cấy vi sinh vật • Khái niệm mơi trường dinh dưỡng Mơi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH trong mơi trường. trong đó các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào q trình trao đổi chất nội bào • Phân loại mơi trường dinh dưỡng o Theo nguồn gốc Mơi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám Mơi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. Ví dụ như: Czapeck, Hansen, EMB Mơi trường bán tổng hợp: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên, ví dụ như: PGA, giá đậu đường o Theo trạng thái vật lý Mơi trường lỏng: thành phần mơi trường này khơng chứa agar và thường được sử dụng để nghiên cứu q trình tổng hợp của vi sinh vật Mơi trường đặc: cứ 1000ml mơi trường có 15 – 20 Agar Mơi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,3 – 0,7% agar o Theo cơng dụng Mơi trường phân lập Mơi trường tăng sinh Mơi trường ni giữ giống: nghèo dinh dưỡng Mơi trường thử nghiệm sinh hóa 2. Trình bày qui trình pha chế mơi trường ni cấy vi sinh vật Bao gồm các bước sau: http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 4/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text • Chuẩn bị dụng cụ • Cân hóa chất • Phối chế tạo mơi trường ni cấy • Điều chỉnh độ pH của mơi trường • Phân phối mơi trường vào dụng cụ • Khử trùng mơi trường • Làm thạch nghiên, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri • Kiển tra độ vơ trùng và bảo quản 3. u cầu của mơi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch đứng • Làm thạch nghiêng:  Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng mơi trường và mơi trường chưa đơng đặc ­ Đặt ống nghiệm có mơi trường lên giá đặt nghiêng và khơng được để mơi trường chạm vào nút bơng ­ Để n cho đến khi mơi trường đơng đặc. u cầu mặt thạch phải thẳng, nhẵn và liên tục • Làm thạch đứng: ­ Đặt các ống nghiệm có mơi trường là thạch đứng vào giá, để n cho mơi trường đơng đặc • Đổ mơi trường vào đĩa petri:  ­ Tồn bộ q trình đổ thạch vào đĩa petri được thực hiện trong tủ cấy vơ trùng và gồm các thao tác sau: o Mở bao giấy gói các đĩa petri o Một tay cầm dụng cụ chứa mơi trường o Tay còn lại mở nút bơng và hơ miệng bình trên ngọn lửa đền cồn o Mở hé nắp đĩa petri. Nghiêng bình và rót mơi trường vào đĩa petri o Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn đĩa để mơi trường được phân phối đều bên trong đĩa o Để n cho mơi trường đơng đặc o Lật ngược đĩa lại và bảo quản 4. Giải thích tại sao khơng phân phối mơi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng Vì sẽ làm nhiễm các vi sinh vật khơng mong muốn, có thể nhiễm một số tạp chất vì vậy sau q trình ni cấy khó có thể xác định được kết quả. Có thể tránh được hơi nước tiếp xúc vào mơi trường ni cấy và vì sau khi cấy phải để n mơi trường để cứng mơi trường http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 5/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text 5. Đĩa petri chứa mơi trường trước khi cấy vi sinh vật nên úp hay ngửa? Tại  sao? Nên để ngửa bởi vì làm kín khu vực ni cấy, tránh lây nhiễm các vi sinh vật  khác và cũng tránh tiếp xúc với hơi nước 6. Ý nghĩa của việc pha chế mơi trường? Chúng ta phải pha chế mơi trường cho vi sinh vật vì mơi trường dinh dưỡng là hỗn  hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa­ khử, áp  suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của mơi trường để vi sinh vật có thể  sinh trưởng và phát triển một cách tối ưu nhất có thể Làm mơi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để ni cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng 7. u cầu của một mơi trường dinh dưỡng ni cấy? u cầu của mơi trường dinh dưỡng: có đủ chất dinh dưỡng cần thiết, có độ pH phù hợp. có độ nhớt nhất định, khơng chứa các yếu tố độc hại, hồn tồn vơ trùng,  đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật 8. Nêu ý nghĩa của các thành phần trong mơi trường ni cấy? Peptone chiết xuất cao thịt bò dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao thịt bò chứa các axit amin, peptit, nuclêơtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất  khống. Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm B cũng như nguồn nitơ  và cacbon 9. Có bao nhiêu loại peptone? Có 3 loại peptone o Từ động vật: chiết xuất từ thịt, cao thịt bò, dịch thuỷ phân một phần của thịt bò, cazêin,… dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao thịt bò chứa các  axit amin, peptit, nuclêơtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất khống o Từ thực vật: chiết xuất từ đậu nành,… o Nấm men: cao nấm men, Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm  B cũng như nguồn nitơ và cacbon) 10. Cơ chế làm trong nước của lòng trắng trứng Cách làm trong nước bằng lòng trắng trứng: lòng trắng trứng: nước tỉ lệ 1:1→  đánh tan nổi bọt → cho vào 1 lít mơi trường → đun sơi khoảng 5 phút → để nguội  → lắng cặn →lọc Cơ chế: các protein trong lòng trắng trứng như albumin, ovalbumin dưới tác động của sự khuấy trộn và gia nhiệt bị biến tính khơng thuận nghịch, các liên kết trong protein được kéo dãn làm lộ ra nhiều nhóm chức → hình thành lực hút tĩnh điện với các ion, bụi bẩn có trong nước → sau khi lắng, lọc nước trong hơn.  http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 6/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP NI CẤY VI SINH VẬT PHÂN LẬP SINH VẬT I. Ngun tắc 1. Mục đích của việc ni cấy ­ Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các ngun liệu vật phẩm cần nghiên cứu ­ Tiến hành việc phân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng ­ Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết ­ Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển từng loại của vi sinh vật 2. Ngun tắc ni cấy vi sinh vật Mọi thao tác ni cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vơ trùng để tránh tạp  nhiễm các vi sinh vật khơng mong muốn từ mơi trường ngồi Mơi trường và dụng cụ ni cấy đều phải khử trùng triệt để. Duy trì tốt các điều  kiện ni cấy để vi sinh vật phát triển thuận lợi II. Dụng cụ, mơi trường và hóa chất III. Tiến hành thí nghiệm 1. Phương pháp cấy truyền thạch (mơi trường thạch) 1.1. Cấy truyền trên thạch đĩa Có thể cấy trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau: * Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau: ­ Để đĩa pêtri lên bàn ­ Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và u cầu ở phương pháp chung ­ Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào ­ Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các kiểu sau: + Theo hình chữ chi trên tồn bộ mặt thạch (hình 3.3a) + Theo những đường song song (hình 3.3b) + Theo 4 hình chữ chi 4 góc (hình 3.3c) Hình 3.1 Các kiểu cấy trên thạch đĩa 10 Hình 3.2: Cách dàn vi sinh vật lên bề mặt mơi trường A – que gạt B – dàn bằng que gạt; C: Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn đều  bằng que gạt; D : Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn bằng que cấy 1.2. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng ­ Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 7/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text ­ Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên ­ Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp theo: + Hồ giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm + Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu (hình 3.1) ­ Hình chữ chi ­ Hình vòng xoắn ­ Hình vạch ngang song song d Hình 3.2: Một số kiểu cấy trên ống thạch nghiêng 1.3. Phương pháp cấy trên thạch đứng: cấy sinh vật kị khí • Sử dụng que cấy hình kim • Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ • Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát  thành ống tuỳ u cầu • Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để khơng gây nứt, vỡ mơi trường IV. Trả lời câu hỏi 1. Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật 11 ­ Cấy trun vi sinh vật trên mơi trường lỏng: cấy truyền bằng pipette Pasteur, cấy  truyền bằng que cấy vòng ­ Cấy truyền trên mơi trường lỏng: cấy truyền trên ống truyền thạch nghiêng, trên ống  nghiệm thạch đứng, cấy truyền trên thạch đĩa 2. Các phương pháp giữ ống vi sinh vật a. Phương pháp cấy truyền định kỳ trên mơi trường mới Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản khơng lâu Nhược điểm: tốn mơi trường, cơng sức và thời gian. Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc. Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong q trình bảo quản. Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp cho các chủng bảo  quản. Giống gốc có thể bị mất do sai sót khi dùng mơi trường cấy truyền khơng thích  hợp. Chủng vi sinh vật đễ bị thay đổi các đặc tính sinh học do đột biến xuất hiện sau  mỗi làn cấy truyền b. Phương pháp giữ giống trên mơi trường thạch có lớp dầu khống Ưu điểm: đơn giản nhưng hiệu quả cao nhờ khả năng làm chậm q trình biến  dưỡng và hơ hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại. Mơi trường khơng bị mất nước và khơ c. Phương pháp giữ giống trên đất, cát, hạt… http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 8/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text Ưu điểm: dễ bảo quản các chủng bào tử tiềm sinh, thời gian bảo quản có thể kéo  dài đến 1 năm Nhược điểm: khử trùng mơi trường trước d. Phương pháp lạnh đơng Ưu điểm: nhanh, thuận lợi cho việc bảo quản một số lượng lớn mẫu. vi sinh vật  được bảo quản từ 10­20 năm, tiết kiệm cơng sứcvà sai sót nhãn mác, tạp nhiễm Nhược điểm: giá thành thiết bị, độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt bảo quản là khác nhau. Trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hố trên mơi trường thích hợp một số lần để đảm bảo phục hồi các đặc tính sinh học của chủng vi  sinh vật e. Phương pháp bảo quản lạnh sâu 12 Ưu điểm: thích hợp cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm men, vi  khuẩn, nấm mốc, vỉut, tảo và các dòng tế bào động vật. thời gian bảo quản lâu Nhược điểm: đầu tư kinh phí cho thiết bị, điện q cao, rủi ro cháy nổ, khơng thích hợp cho các chủng vi sinh vật hay dùng đến thường xun 3. Trình bày ngun tắc và mục đích của q trình phân lập ­ Ngun tắc: tách rời các tế bào vi sinh vật, ni cấy các tế bào trong mơi trường dinh  dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ ­ Mục đích: phân tách các chủng vi sinh vật trong mơi trường tự nhiên và cơ lập chúng  nhằm chọn lựa giống vi sinh vật thuần khiết cho những mục đích khác nhau 4. Muốn phân lập nấm men, nấm mốc, vi khuẩn thì nguồn mẫu cần chọn là gì? Trả lời: ­ Phân lập vi khuẩn: nguồn mẫu là cỏ khơ cắt nhỏ ­ Nấm mốc: nguồn mẫu là cơm nguội, xơi làm mốc tương, bánh mì để khơ ­ Nấm men: nguồn mẫu là bề mặt trái cây, dịch ép như táo, lê hoặc trong rượu nếp, bia,  nước mía 5. So sánh sự giống và khác nhau của cách phân lập vi sinh vật hiếu khí và kị khí Trả lời: ­ Giống nhau: nhằm phân tách các chủng vi sinh vật trong mơi trường tự nhiên và cơ  lập chúng nhằm chọn lựa những giống vi sinh vật thuần khiết.Khác nhau: Phân lập vi sinh vật hiếu khí Phân lập vi sinh vật kị khí ­ Hút dịch mẫu đã pha lỗng cho  vao dĩa petri có mơi trường thích  hợp ­ Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 9/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text ­ Tiếp tục dùng que gạt mẫu cho  đều khắp mặt thạch đĩa thứ 2 rồi  đĩa thứ 3 ­ Ủ ấm ở nhiệt độ thích hợp sau  một thời gian nhất định ta sẽ nhận  được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các  đĩa thứ 2, 3  ­ Dùng mơi trường đặc trong ống nghiệm đem  chưng cách thủy để loại bỏ khơng khí ­ Để nguội mơi trường còn 45­50 o C ­ Hút dịch nghiên cứu cho vào ống mơi trường, đậy  nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm ­ Rút nhanh, đậy nhanh tránh cho ống nghiệm có  khơng khí ­ Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 đĩa  petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp ­ Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc  riêng rẽ trong mơi trường, dùng que cấy cắt cả khối  mơi trường rồi cấy vào mơi trường lỏng thích hợp 6. Tại sao khi đi cân hố chất chỉ cần 2­3 người? Do dụng cụ trong phòng hố chất có hạn, đi cân hố chất cần 2­3 người đã đảm  bảo về thời gian,hiệu quả làm việc 13 BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT KÍNH HIỂN VI BẰNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC 1. Trình bày cấu tạo và ngun tắc hoạt động của kính hiển vi quang học a. Cấu tạo Kính hiển vi quang học gồm có hai phần: ­ Hệ thống cơ học: giá kính gồm có chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, ổ gắn  và xoay vật kính, bán kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển thanh trượt,  kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh thơ sơ cấp, ốc điều chỉnh  thứ cấp (vi cấp) ­ Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màng chắn sáng, nguồn  chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng hoặc kính chiếu sáng). Ngồi ra, ở kính dùng nguồn  chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện,  http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 10/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng b. Ngun tắc hoạt động 14 Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng đại mẫu vật. Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngồi cùng hướng vào tiêu bản có độ phóng đại lớn nhất. Độ phóng đại của kính phụ thuộc vào tiêu cự, tức bán kính cong của thấu kính. Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng đại càng lớn Có hai loại vật kính • Vật kính khơ độ phóng đại nhỏ như x4,x10,x15,x40 • Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90,x100 Thị kính cũng có độ phóng đại phức tạp, gồm hai thấu kính, một hướng về phía mắt người xem, một hướng về vật kính. Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật kính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn Độ phóng đại của kính = Độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính x100, độ phóng đại của thị kính x10. Như vậy độ phóng đại của kính : 100x10=1000 lần Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính để chọn kính hiển vi 2. Có bao nhiêu loại kính hiển vi? Đặc điểm của từng loại? Có 5 loại kính hiển vi ­ Kính hiển vi viền đen Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào xung quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng chiếu vào, giúp ta thấy rõ từng hạt bụi trong khơng khí bị tia sáng chiếu vào. Chức năng: quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi thường khó quan sát 15 ­ Kính hiển vi đổi pha Ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quang kính, vật kính và thị kính. Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên mao, các lớp màng ­ Kính hiển vi huỳnh quang Chùm tia tử ngoại chiếu vào các tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh quang. Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau Chức năng: quan sát và phân biệt các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh vật http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 11/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text ­ Kính hiển vi điện tử Chùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải cao, giúp phân biệt hai điểm rất gần nhau. Chức năng: quan sát vỉut, cấu trúc phân tử của tế bào ­ Kính hiển vi quang học Dùng bước sóng 500 nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo năng suất phân li lớn giúp phân biệt hai điểm cách nhau khoảng 0.2 µm trở lên. Hệ thống phóng to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận: vật kính và thị kính. Mỗi bộ phận là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp. Chức năng của kính hiển vi quang học là dùng để quan sát tế bào vi sinh vật, kí sinh trùng, tế bào động vật, thực vật 3. Tại sao khi quan sát ở vật kính 100 phải cho 1 giọt dầu soi kính? Do chiết suất ánh sáng của khơng khí nhỏ hơn thuỷ tinh, nên tia sáng khi đi qua tiêu bản thuỷ tinh sẽ bị khúc xạ một phần. Phần phía ngồi cuả tia sáng do bị khúc xạ nên khơng đi vào được vật kính. Vật kính có độ phóng đại càng lớn thì đường kính của thấu kính càng nhỏ, lượng tia sáng đi vào vật kính rất ít nên khơng nhìn rõ ảnh Để hạn chế nhược điểm này ta dùng dầu soi kính có chiết suất ánh sáng gần bằng thuỷ tinh. Thuỷ tinh và dầu soi được xem là một mơi trường đồng nhất. ánh sáng đi qua khơng bị khúc xạ nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh 16 BÀI 5. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VI SINH VẬT Báo cáo thực tập 1. Sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có màu đỏ vàng hay đỏ tía. Giải thích ngun nhân? Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ có màu xanh đen hay tím, còn vi khuẩn Gram âm có màu đỏ vang (nhuộm safranin O) hay đỏ tía (Fuchsin Ziehl). Sở dĩ có màu như vậy là do vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm có sự khác biệt về thành phần hóa sinh của thành tế bào vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương thì có nhiều peptidoglycan (phức chất protein­đường) và các peptidoglycan này được liên kết chặt chẽ với nhau từ đó có thể giúp cho tế bào kháng lại chất tẩy màu nên sau khi rửa bằng cồn thì crystal violet khơng bị rửa trơi và vẫn giữ được màu tím, sau đó nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, nhưng khơng có sự thay đổi màu nhiều. Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thành phần lipid ở nồng độ cao cho nên chúng có thể hòa tan trong chất khử màu (aceton, alcohol,…) và bị rửa trơi cùng với crystal violet (màu tím), sau khi nhỏ dung dịch tẩy màu, ta nhuộm them bằng dung dịch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, lúc này vi khuẩn Gram âm có màu đỏ vàng hay đỏ tía 17 http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 12/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text 2. Nếu khơng nhuộm bổ sung thuốc thử safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn Gram âm có màu gì? Tại sao? Nếu khơng nhuộm bổ sung thuốc thử safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn Gram âm sẽ khơng có màu. Bởi vì ở giai đoạn tẩy màu bằng cồn đã rửa trơi crystal violet (có màu tím) nên sau giai đoạn tẩy màu vi khuẩn Gram âm đã bị mất màu của crystal violet được nhuộm ở trước đó. Hoặc trường hợp vi khuẩn Gram âm sẽ có màu tím cũng có thể ở giai đoạn tẩy rửa, ta khơng tẩy màu cho đến khi giọt dung dịch cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính là khơng màu BÀI 6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT 1. Trình bày ngun tắc và phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết? Ngun tắc: ­ Gieo cấy vi khuẩn đã pha lỗng trên mơi trường dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch hay còn gọi là agar) ­ Ni dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau ­ Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống mơi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết Phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết: 1.1. Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật hiếu khí: Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn. Một số kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc ,kỹ thuật ria tia ,kỹ thuật ria liên tục Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn được thực hiện như sau: 18 a. Kỹ thuật hộp ria: ­ Dùng que cấy vòng thao tác vơ trùng thu giống ­ Ria các đường trên đĩa pêtri chứa mơi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn góc). Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khithực hiện đường ria tiếp theo ­ Bao gói đĩa pêtri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm b. Kỹ thuật hộp trải: ­ Dùng pipetman và đầu típ vơ trùng, thao tác vơ trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt mơi trường trong đĩa pêtri ­ Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 70 , hơ qua ngọn lửa để khử trùng Để đầu thanh gạt nguội trong khơng gian vơ trùng của ngọn lửa ­ Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 13/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text ­ Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt mơi trường ­ Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm c. Kỹ thuật hộp đổ: ­ Dùng pipetman và đầu típ vơ trùng, thao tác vơ trùng chuyển 1 m dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt mơi trường trong đĩa pêtri ­ Đổ khoảng 15 ­ 20 ml mơi trường đã đun chảy và để nguộ đến 45 ­ 55 C vào đĩa petri đã cấy mẫu ­ Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống được trộn đều trong mơi trường cấy ­ Đậy nắp đĩa pêtri, để đơng tự nhiên 19 1.2. Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật hiếu khí: ­ Dùng mơi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ khơng khí trong mơi trường ­ Để nguội mơi trường còn 45 ­ 50 C ­ Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống mơi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm ­ Rót nhanh mơi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và mơi trường khơng còn khơng khí ­ Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp ­ Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối mơi trường, dùng que cấy cắt cả khối mơi trường rồi cấy vào mơi trường lỏng thích hợp 2. Ngun tắc của việc ni tích lũy? Ngun tắc của việc ni tích lũy: trường hợp số vi khuẩn có trong mẫu ít thì phải ni tích lũy bằng cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng và các điều kiện lý hóa cần thiết hoặc bổ sung các chất ức chế sinh trưởng của các vi sinh vật đi kèm.  3. Thế nào là chuẩn vi khuẩn thuần khiết (chủng sạch)? Chuẩn vi khuẩn thuần khiết (hay còn gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con, cháu, dòng có nguồn gốc từ một tế bào riêng lẻ. Các chủng vi sinh vật được thu nhận từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì một khuẩn lạc có thể được hình thành bởi một hoặc nhiều tế bào, bào tử, vì thế phải làm sạch nhiều lần mới thu http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 14/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text được chủng vi sinh vật thuần khiết 20 BÀI 10: CÁC PHẢN ỨNG SINH HĨA 1. Phản ứng tạo indol Mục đích: Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol   các VSV có hệ emzym tryptophanase Sơ đồ: 21 Kết quả, dương tính (màu hồng) và âm tính (màu vàng) Thuốc thử Kovac’s 37 o C 24h Chủng  Vi Sinh Vật Mơi Trường: NB và Tripton Âm tính 37oC / 24h Chủng  Vi Sinh Vật Mơi Trường Dương tính Âm tính Cơ chế phép thử: Vi sinh vật tiết enzyme tryptophannase chuyển hóa tryptophan trong mơi trường thành Indol. Indol sẽ kết hợp với para­dimethylaminbenzaldehyd trong thuốc thử kovac’s tạo thành phức chất có màu hồng cánh sen Ý nghĩa:  • Phép thử cho biết các chủng loại vi sinh vật có khả năng tiết enzyme tryptophannase, giúp ta định danh được một số chủng loại vi sinh vật  Là phản ứng giúp phân biệt ◦ E. coli (+) với Klebsiella (­) ◦ Proteus mirabilis (­) với Proteus khác (+) ◦ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (­)… http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 15/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text  Đối chứng (+) Proteus rettgeri (­) Serratia marcescens 22 Môi trường MR­VP Chủng vi sinh vật Kết quả, màu đỏ (Dương tính), màu vàng: (âm tính) Chủng  Vi Sinh Vật Mơi Trường 2­4 ngày Dương tính Âm tính 2. Phản ứng MR (methyl red)  Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong q trình  lên men glucose Cơ chế:  Cơ sở sinh hóa: ◦ Chất chỉ thị pH: methyl red ◦ MR (+) – càng kéo dài thời gian ni cấy – mơi trường càng acid ◦ MR (­) – càng kéo dài thời gian ni cấy – các chất có tính acid bị  chuyển hóa – mơi trường dần trung tính 23 24h, 37 o C Methyl Red Dưới 4,4 5,0 – 5,8 Trên 6,0 Mơi trường MR­VP Chủng vi sinh vật 24h, 37oC KOH 10% (NaOH 40%) Kết quả,màu đỏ hồng (Dương tính), khơng đổi màu (âm tính) ­naphthol Âm tính Dương tính  Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37 o http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 16/18 9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text C Cơ chế: một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa Glucose qua q trình đường  phân tạo thành acid pyruvic, rồi từ Acid pyruvic chuyển hóa thành acetyl coenzyme  A, đi qua chu trình Kreps tạo ra các acid: acid citric, acid succinic, acid fomic, a cid  malic, a cid oxalic… hoặc từ Acid pyruvic chuyển trực tiếp thành các acid lactic, acid  fomic,… Trong mơi trường MR­VP có PH= 6.9±0.2 có K2HPO4 (đệm phosphat) giúp ổn  định PH, khi có mặt các acid hữu cơ mạnh sẽ tấn cơng và phá vỡ thế PH ổn định làm  cho PH giảm mạnh, PH