THỰC HÀNH VI SINH THỰC PHẨM
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
GVHD: BÙI HỒNG QUÂN
LỚP: ĐHTP5 – NHÓM 5
SVTH: Lê Thị Mỹ Vân
MSSV: 09078531
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011
1
BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH
THỰC PHẨM
MỤC LỤC
Bài 1: Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm và các phương pháp
tiệt trùng vi sinh vật 3
Bài 2: Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật 6
Bài 3: Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 10
Bài 4: phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học 16
Bài 5: Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 19
Bài 6: Phương pháp phân lập vi sinh vật 20
Bài 10: Khảo sát đặc tính sinh hóa của vi sinh vật 23
Bài 13: Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp 35
Bài 14: Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí bằng
phương pháp đếm khuẩn lạc 37
Bài 15: Định lượng Coliform bằng phương pháp MPN 39
Bài 19: Phương pháp định lượng E.coli trong thực phẩm 41
Bài 20: Phương pháp phân tích Salmonella spp. trong thực phẩm 43
Bài 21: Phương pháp phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm 46
Bài 22: Phương pháp phân tích định lượng Staphilococcus aureus
trong thực phẩm 48
Bài 24: Phương pháp phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm 50
2
30%
Chúng Ta Rồi Sẽ Ổn
Thôi
25%
Quốc Gia Khởi Nghiệp
30%
Chúng Ta Rồi Sẽ Ổn Thôi
25%
Nhà Giả Kim
25%
Kẻ Trộm Sách (Tái Bản
2015)
25%
Bên Nhau Trọn Đời Tái Bản 2015 (Tặng Kèm Poster ) cho những đơn
30%
Thiên Đường Nhiệt Đới (Sách Tô Màu)
25%
Quốc Gia Khởi Nghiệp
Xem bản đầy đủ
Trang 2CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT
Báo cáo thực tập
1. Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi ấy vi sinh vật?
Yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật:
Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín
Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt
Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt
Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Có thể dùng hộp
nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng
2. Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh
vật?
Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh
vật:
a. Nồi hấp ướt (autoclave):
Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao, được sử dụng để hấp khử trùng
mô trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm
b. Kính hiển vi:
Công dụng: dùng để nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái,
sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính
c. Các dụng cụ thí nghiệm
Dụng cụ thủy tinh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác,
ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình
định mức…
Phiến kính (lame): dùng làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lý tế bào vi sinh vật
Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vật trong qua
trình nghiên cứu
Đĩa petri: dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy và phân lập
của tế bào vi sinh vật
Que trãi: phân lập vi sinh vật theo phương pháp trãi đĩa
3
Que cấy:
+ Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh trên đối tượng đơn bào như vi khuẩn, nấm
men
+ Que cấy nhón: dùng để cấy sâu trên môi trường rắn
+ Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ nấm
Micro pipette: sử dụng khi cần hút một lượng chính xác môi trường
30%
Chúng Ta Rồi Sẽ Ổn Thôi
25%
Đọc Vị Bất Kỳ Ai Để Không Bị Lừa Dối Và Lợi
Dụng
25%
Khu Vườn Bí Mật (Coloring Book)
25%
Quốc Gia Khởi Nghiệp
30%
Khu Vườn Thời Gian (Sách Tô Màu Dành Cho Người Lớn)
25%
Kẻ Trộm Sách (Tái Bản
2015)
Trang 3Phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
a. Phương pháp lý học:
Nhiệt khô:
Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng là đốt
trục tiếp trên ngọn lửa đèn cồn
Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói và sấy ở 160
0
C trong 12 giờ hoặc 180
0
C trong
30 phút
Nhiệt ẩm:
Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật
làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật. Chỉ diệt tế bào sinh dưỡng,
bào tử vẫn còn
Phương pháp Pasteur: chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh, không diệt bào tử và vi khuẩn hoại
sinh. Phương pháp này thường dùng ở nhiệt độ 7075
0
C trong thời gian 1015 phút
Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 7080
0
C, mỗi lần 3060
phút và liên tiếp trong ba ngày liền
Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. Thường dùng ở nhiệt
độ 121
0
C trong 1530 phút
Diệt trùng bức xạ:
Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật
Tia âm cực dùng trong tiệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử trùng
phải bao gói kính
Diệt trung bằng cách lọc:
4
Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose,… có kích thước
lỗ lọc từ 0,20,45μm, thường dùng để lọc những vật phẩm lỏng không khử trùng bằng
nhiệt được
Trang 4màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn
b. Phương pháp hóa học
Chỉ sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu
Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor…
5
BÀI 2: CÁCH PHA CHẾ CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG
I. TRẢ LỜI CÂU HỎI
1. Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh
vật
• Khái niệm môi trường dinh dưỡng
Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này có
nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH
trong môi trường. trong đó các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá
trình trao đổi chất nội bào
• Phân loại môi trường dinh dưỡng
o Theo nguồn gốc
Môi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa,
khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám
Môi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được
xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. Ví dụ như: Czapeck, Hansen,
EMB
Môi trường bán tổng hợp: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên,
ví dụ như: PGA, giá đậu đường
o Theo trạng thái vật lý
Môi trường lỏng: thành phần môi trường này không chứa agar và thường được
sử dụng để nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật
Môi trường đặc: cứ 1000ml môi trường có 15 – 20 Agar
Môi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,3 – 0,7% agar
o Theo công dụng
6
Môi trường phân lập
Môi trường tăng sinh
Môi trường nuôi giữ giống: nghèo dinh dưỡng
Môi trường thử nghiệm sinh hóa
2. Trình bày qui trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Bao gồm các bước sau:
Trang 5• Cân hóa chất
• Phối chế tạo môi trường nuôi cấy
• Điều chỉnh độ pH của môi trường
• Phân phối môi trường vào dụng cụ
• Khử trùng môi trường
• Làm thạch nghiên, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri
• Kiển tra độ vô trùng và bảo quản
3. Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch
đứng
• Làm thạch nghiêng:
Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường và môi trường chưa đông
đặc
Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng và không được
để môi trường chạm vào nút bông
Để yên cho đến khi môi trường đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải thẳng,
nhẵn và liên tục
• Làm thạch đứng:
Đặt các ống nghiệm có môi trường là thạch đứng vào giá, để yên cho môi
trường đông đặc
• Đổ môi trường vào đĩa petri:
Toàn bộ quá trình đổ thạch vào đĩa petri được thực hiện trong tủ cấy vô
trùng và gồm các thao tác sau:
o Mở bao giấy gói các đĩa petri
o Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường
7
o Tay còn lại mở nút bông và hơ miệng bình trên ngọn lửa đền cồn
o Mở hé nắp đĩa petri. Nghiêng bình và rót môi trường vào đĩa petri
o Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn đĩa để môi trường được phân phối đều bên trong đĩa
o Để yên cho môi trường đông đặc
o Lật ngược đĩa lại và bảo quản
4. Giải thích tại sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử
trùng
Vì sẽ làm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn, có thể nhiễm một số tạp
chất vì vậy sau quá trình nuôi cấy khó có thể xác định được kết quả. Có thể tránh được
hơi nước tiếp xúc vào môi trường nuôi cấy và vì sau khi cấy phải để yên môi trường
để cứng môi trường
Trang 6sao?
Nên để ngửa bởi vì làm kín khu vực nuôi cấy, tránh lây nhiễm các vi sinh vật
khác và cũng tránh tiếp xúc với hơi nước
6. Ý nghĩa của việc pha chế môi trường?
Chúng ta phải pha chế môi trường cho vi sinh vật vì môi trường dinh dưỡng là hỗn
hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp
suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường để vi sinh vật có thể
sinh trưởng và phát triển một cách tối ưu nhất có thể
Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng
thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng
7. Yêu cầu của một môi trường dinh dưỡng nuôi cấy?
Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ chất dinh dưỡng cần thiết, có độ pH
phù hợp. có độ nhớt nhất định, không chứa các yếu tố độc hại, hoàn toàn vô trùng,
đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật
8. Nêu ý nghĩa của các thành phần trong môi trường nuôi cấy?
8
Peptone chiết xuất cao thịt bò dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao
thịt bò chứa các axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất
khoáng. Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm B cũng như nguồn nitơ
và cacbon
9. Có bao nhiêu loại peptone?
Có 3 loại peptone
o Từ động vật: chiết xuất từ thịt, cao thịt bò, dịch thuỷ phân một phần của thịt bò,
cazêin,… dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao thịt bò chứa các
axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất khoáng
o Từ thực vật: chiết xuất từ đậu nành,…
o Nấm men: cao nấm men, Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm
B cũng như nguồn nitơ và cacbon)
10. Cơ chế làm trong nước của lòng trắng trứng
Cách làm trong nước bằng lòng trắng trứng: lòng trắng trứng: nước tỉ lệ 1:1→
đánh tan nổi bọt → cho vào 1 lít môi trường → đun sôi khoảng 5 phút → để nguội
→ lắng cặn →lọc
Cơ chế: các protein trong lòng trắng trứng như albumin, ovalbumin dưới tác động
của sự khuấy trộn và gia nhiệt bị biến tính không thuận nghịch, các liên kết trong
protein được kéo dãn làm lộ ra nhiều nhóm chức → hình thành lực hút tĩnh điện với
các ion, bụi bẩn có trong nước → sau khi lắng, lọc nước trong hơn.
Trang 7BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT
PHÂN LẬP SINH VẬT
I. Nguyên tắc
1. Mục đích của việc nuôi cấy
Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu
Tiến hành việc phân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng
Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết
Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển từng loại của vi sinh vật
2. Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật
Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp
nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài
Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải khử trùng triệt để. Duy trì tốt các điều
kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển thuận lợi
II. Dụng cụ, môi trường và hóa chất
III. Tiến hành thí nghiệm
1. Phương pháp cấy truyền thạch (môi trường thạch)
1.1. Cấy truyền trên thạch đĩa
Có thể cấy trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau:
* Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau:
Để đĩa pêtri lên bàn
Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở
phương pháp chung
Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào
Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một
trong các kiểu sau:
+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch (hình 3.3a)
+ Theo những đường song song (hình 3.3b)
+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc (hình 3.3c)
Hình 3.1 Các kiểu cấy
trên thạch đĩa
10
Hình 3.2: Cách dàn vi sinh vật lên bề mặt môi trường
A – que gạt B – dàn bằng que gạt; C: Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn đều
bằng que gạt; D : Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn bằng que cấy
1.2. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng
Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí
Trang 8 Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp
theo:
+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu (hình 3.1)
Hình chữ chi
Hình vòng xoắn
Hình vạch ngang song song
d
Hình 3.2: Một số kiểu cấy trên ống thạch nghiêng
1.3. Phương pháp cấy trên thạch đứng: cấy sinh vật kị khí
• Sử dụng que cấy hình kim
• Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ
• Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát
thành ống tuỳ yêu cầu
• Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường
IV. Trả lời câu hỏi
1. Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật
11
Cấy truyên vi sinh vật trên môi trường lỏng: cấy truyền bằng pipette Pasteur, cấy
truyền bằng que cấy vòng
Cấy truyền trên môi trường lỏng: cấy truyền trên ống truyền thạch nghiêng, trên ống
nghiệm thạch đứng, cấy truyền trên thạch đĩa
2. Các phương pháp giữ ống vi sinh vật
a. Phương pháp cấy truyền định kỳ trên môi trường mới
Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu
Nhược điểm: tốn môi trường, công sức và thời gian. Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến
mất chủng giống gốc. Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo
quản. Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp cho các chủng bảo
quản. Giống gốc có thể bị mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích
hợp. Chủng vi sinh vật đễ bị thay đổi các đặc tính sinh học do đột biến xuất hiện sau
mỗi làn cấy truyền
b. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng
Ưu điểm: đơn giản nhưng hiệu quả cao nhờ khả năng làm chậm quá trình biến
dưỡng và hô hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại. Môi trường không bị mất nước và
khô
c. Phương pháp giữ giống trên đất, cát, hạt…
Trang 9dài đến 1 năm
Nhược điểm: khử trùng môi trường trước
d. Phương pháp lạnh đông
Ưu điểm: nhanh, thuận lợi cho việc bảo quản một số lượng lớn mẫu. vi sinh vật
được bảo quản từ 1020 năm, tiết kiệm công sứcvà sai sót nhãn mác, tạp nhiễm
Nhược điểm: giá thành thiết bị, độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo
các đợt bảo quản là khác nhau. Trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi
trường thích hợp một số lần để đảm bảo phục hồi các đặc tính sinh học của chủng vi
sinh vật
e. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
12
Ưu điểm: thích hợp cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm men, vi
khuẩn, nấm mốc, vỉut, tảo và các dòng tế bào động vật. thời gian bảo quản lâu
Nhược điểm: đầu tư kinh phí cho thiết bị, điện quá cao, rủi ro cháy nổ, không thích
hợp cho các chủng vi sinh vật hay dùng đến thường xuyên
3. Trình bày nguyên tắc và mục đích của quá trình phân lập
Nguyên tắc: tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trong môi trường dinh
dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ
Mục đích: phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên và cô lập chúng
nhằm chọn lựa giống vi sinh vật thuần khiết cho những mục đích khác nhau
4. Muốn phân lập nấm men, nấm mốc, vi khuẩn thì nguồn mẫu cần chọn là gì?
Trả lời:
Phân lập vi khuẩn: nguồn mẫu là cỏ khô cắt nhỏ
Nấm mốc: nguồn mẫu là cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô
Nấm men: nguồn mẫu là bề mặt trái cây, dịch ép như táo, lê hoặc trong rượu nếp, bia,
nước mía
5. So sánh sự giống và khác nhau của cách phân lập vi sinh vật hiếu khí và kị khí
Trả lời:
Giống nhau: nhằm phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên và cô
lập chúng nhằm chọn lựa những giống vi sinh vật thuần khiết.Khác nhau:
Phân lập vi sinh vật hiếu khí Phân lập vi sinh vật kị khí
Hút dịch mẫu đã pha loãng cho
vao dĩa petri có môi trường thích
hợp
Dùng que gạt thủy tinh phân phối
dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch
Trang 10đều khắp mặt thạch đĩa thứ 2 rồi
đĩa thứ 3
Ủ ấm ở nhiệt độ thích hợp sau
một thời gian nhất định ta sẽ nhận
được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các
đĩa thứ 2, 3
Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem
chưng cách thủy để loại bỏ không khí
Để nguội môi trường còn 4550
o
C
Hút dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy
nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm
Rút nhanh, đậy nhanh tránh cho ống nghiệm có
không khí
Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 đĩa
petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp
Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc
riêng rẽ trong môi trường, dùng que cấy cắt cả khối
môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp
6. Tại sao khi đi cân hoá chất chỉ cần 23 người?
Do dụng cụ trong phòng hoá chất có hạn, đi cân hoá chất cần 23 người đã đảm
bảo về thời gian,hiệu quả làm việc
13
BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT KÍNH HIỂN VI BẰNG KÍNH
HIỂN VI QUANG HỌC
1. Trình bày cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học
a. Cấu tạo
Kính hiển vi quang học gồm có hai phần:
Hệ thống cơ học: giá kính gồm có chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, ổ gắn
và xoay vật kính, bán kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển thanh trượt,
kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh thô sơ cấp, ốc điều chỉnh
thứ cấp (vi cấp)
Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màng chắn sáng, nguồn
chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng hoặc kính chiếu sáng). Ngoài ra, ở kính dùng nguồn
chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện,