BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ VI SINH

BÁO CÁO THỰC HÀNH, CÔNG NGHỆ VI SINH

ĐẠI HỌC Y DỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC BỘ MÔN VI SINH – KÝ SINH BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ VI SINH Nhóm thực tập: IV Buổi thực tập: Chiều thứ tƣ Bàn số Tiểu nhóm: Lớp: DCQ2010 STT Họ tên sinh viên Tổ GHI CHÚ (Nhóm IV – Chiều thứ – Bàn số – Tiểu nhóm Lê )Thanh Chi 12 Đặng Hữu Thanh Hà 12 Nguyễn Thành Long 12 Trần Khánh Ngọc 12 Hoàng Võ Nghĩa Nhân 12 Đào Tiến Trung 12 Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH DANH SÁCH SINH VIÊN THỰC TẬP MỤC LỤC CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT - SINH KHỐI VI SINH VẬT ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI CỦA VI KHUẨN PROBIOTIC TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINAT CỐ ĐỊNH CGTase LÊN ALGINAT CẢM ỨNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP - ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE (PAGE) 12 TINH CHẾ PROTEIN BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC & SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION 14 Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang ii Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH TUẦN 01 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT SINH KHỐI VI SINH VẬT (Ngày 04/12/2013) -oOo - TÓM TẮT LÝ THUYẾT 1.1.Chọn lọc giống vi sinh vật − Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm:  Phân lập từ tự nhiên  Gây đột biến  Phát dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn  Bảo quản giống − Một số phương pháp phát giống vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào yếu tố sau:  Chất chuyển hóa tạo ra: kháng sinh, sắc tố,…  Enzym ngoại bào tác động lên chất môi trường  Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng vi sinh vật  Sự thay đổi hình thái − Một số phương pháp bảo quản giống (thường mang tính kinh nghiệm)  Giữ giống thạch  Giữ giống lớp dầu khống  Giữ giống cát  Đơng lạnh  Đông khô 1.2.Sinh khối vi sinh vật − Sinh khối toàn số vi sinh vật thu sau lên men Trong công nghệ vi sinh, người ta sản xuất sinh khối để thu sản phẩm nội bào probiotic − Trong thực nghiệm tiến hành thu sinh khối vi sinh vật nuôi cấy 30 C 37 C mơi trường TSB có bổ sung khống khơng bổ sung khống, điều kiện có lắc khơng lắc để xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu theo phương pháp: đo độ đục máy đo qua ng đếm sống  Phương pháp đo độ đục: Chọn bước sóng thích hợp Ví dụ: Đo OD600 với Bacillus indicus  Phương pháp đếm sống: Pha lỗng dịch ni cấy thành nhiều cấp độ chọn nồng độ thích hợp đếm sống (từ 15 đến 300 khóm hộp thạch) Bảng 1.1 So sánh phương pháp đếm số lượng tế bào Đo độ đục Đếm sống − Thao tác nhanh, gọn − Đếm xác số khóm Ƣu điểm → Số lượng vi khuẩn sống tương ứn g Nhƣợc điểm − Gây sai số thừa do:  Xác vi khuẩn chết  Tạp chất dịch nuôi cấy − − Dễ bị ngoại nhiễm Khi cấy phải pha loãng huyền tr ọc vi khuẩn nhiều cấp độ KẾT QUẢ THỰC HÀNH 2.1.Chọn lọc giống vi sinh vật 2.1.1 Phân lập chủng có khả tiết amylase ngoại bào Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH Màu − Loại Phƣơng pháp: Cấy dịch nuôi cấy lên địa thạch tinh bột ủ qua đêm Số lƣợng C Dùng dung dịch Lugol để nhận biết khuẩn lạc có khả thủy phân tinh bột tiết amyl ase ngoại bào Bên ngồi − Kết quả: Có 20 khuẩn lạc chia thành loại Kết chi tiết trình bày bảng 1.2 Màu trắng mm Bảng 1.2 KếtBên quảngồi phânđục lập chủng có khả tiết amylase ngoại bào Đƣờng kính vò ng Trƣớc nhỏ Lugol Sau nhỏ Lugol phân giải tinh bột − Đục Bên đục Bên trắng Màu nâu đen - Màu trắng mm Có kết tủa đục Bìa cưa Kêt luận: Chủng tạo khuẩn lạc có khả tiết amylase ngoại bào Nên sử dụng chủng số để có hiệu suất thu hoạch amylase cao 2.1.2 Phân lập chủng có khả tiết protease ngoại bào − Phƣơng pháp: Cấy dịch nuôi cấy lên địa thạch gelatin ủ qua đêm 37 C Dùng dung dịch TCA 50% để nhận biết khuẩn lạc có khả phân giải protein tiết prolase ngoại bào − Kết quả: Có 15 khuẩn lạc chia thành loại Kết chi tiết trình bày bảng 1.3 Bảng 1.3 Kết phân l ập chủng có khả tiết protease ngoại bà o Loại Số lƣợng nhỏ TCA − Màu Đƣờng kính vòng Sau phân giải protein Trƣớc nhỏ TCA Viền trắng, đục 3 Đục, bìa cưa Đục, bìa dợn sóng Khơng có kết tủa đục 4 Đốm trắng nhỏ Có kết tủa đục Khơng có kết tủa đục mm mm Kêt luận: Chủng tạo khuẩn lạc có khả tiết protease ngoại bào Nên sử dụng chủng số để có hiệu suất thu hoạch protease cao 2.1.3 Phân lập chủng có khả kháng kháng sinh − Chủng thử nghiệm: Staphylococcus aureus − Phương pháp vạch thẳng vng góc :  Tiến hành : Cấy chủng thử nghiệm hộp thạch cấy sẵn chủng khảo sát (Đã ủ qua đêm 37 C), đường cấy chủng thử nghiệm vuông góc với đường cấy chủng khảo sá t Ủ qua đêm 37 C  Kết : Khảo sát hai chùng Chỉ có chủng (1) có khả tiết kháng sinh với khoảng cách ức chế 12 mm → Nên sử dụng chủng (1) để nghiên cứu sản xuất kháng sinh − Phương pháp khuếch tán  Tiến hành : Trải chủng khảo sát lên hộp thạch Đục lỗ đường kinh 6mm bằn g dụng cụ tiệt trùng Nạp vào lỗ dịch nuôi Sốcấy tế bào/mL chủng kiểm tra lọc qua giấy lọc 0,45µm Nhiệt độ Mơi trƣờng TSB để loại bỏ tế bào Tiến hành songOD song với mẫu trắng = 2,142 OD = 2,366 Lắc Lắc  Kết : Bảng 1.4 Kết phân l ập chủng có khả tiết kháng si OD = 1,163 OD = 1,938 nh Tĩnh Tĩnh Lắc Chủng OD = 2,224 Đường kính vòng ức chế (mm) Lắc OD = 2,867 19 10 Chứng OD = 0,408 OD = 1,140 Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số Tĩnh – Tiểu nhóm Tĩnh Trang Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH  Kết luận : Có chúng tiết kháng sinh với mức độ tăng dần (2) < (4) < (1) → Nên sử dụng chủng (1) để nghiên cứu sản xuất kháng sinh Có ngoại nhiễm xảy ô chứa chủng (2), nguyên nhân cói thể dịch ni cấy chưa lọc tế bào sinh dưỡng 2.2.Sinh khối vi sinh vật 2.2.1 Kết − Chủng khảo sát: Bacillus indicus (vi khuẩn hiếu khí) − Cơng thức :  Đo độ đục: Số tế bào/mL = OD600 × 0,8 × 10 số thứ tự hộp +  Đếm sống: Số tế bào/mL = Số khóm × 10 − Kết xử lý số liệu Bảng 1.3 Ảnh hưở ng c điều kiện nuôi cấy đến sinh khối vi sinh vật Môi trƣờng TSB Số tế bào/mL (.10 ) (Bổ sung khoán (.10 ) g) 30 C 37 C 1, Không đạt 7136 1,8928 - 162 khóm (5X) 0,16 64 khóm (5X) 0,0 63 khóm (5X) 1,7792 2,2936 0,063 34 khóm (6X) 88 khóm (5X) 0,34 64 0,088 0,3264 0,912 0, 9304 1,5504 Khơng đạt - 15 khóm (6X) 0,1 2.2.2 Nhận xét – Kết luận − Theo phƣơng pháp đo OD600  Nhiều nhất: 37 C, lắc, môi trường TSB có bổ sung khống  Ít nhất: 37 C, tĩnh, môi trường TSB − Theo phƣơng pháp đếm sống:  Nhiều nhất: 37 C, lắc, môi trường TSB  Ít nhất: 30 C, lắc, mơi trường TSB − Nhận xét: Có khơng tương đồng kết quả, nguyên nhân  Thao tác đo quang chưa xác  Thao tác cấy gây nhiễm tạp, sai số đếm − Kết luận: Dựa phương pháp đếm sống, B.indicus tăng trưởng mạnh mơi trường có nhiều oxy (lắc), nhiệt độ việc bổ sung khống vào mơi trường ni cấy ảnh hưởng k hơng rõ Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH TUẦN 02 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI CỦA VI KHUẨN PROBIOTIC (Ngày 11/12/2013) -oOo - TÓM TẮT LÝ THUYẾT − Probiotic vi sinh vật sống đưa vào thể với số lƣợ ng đủ dạng sản phẩm lên men hay tế bào khơ tạo ảnh hưởng có lợi đến cân vi sinh v ật đường tiêu hóa có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe − Các vi sinh vật dùng làm probiotic phải đạt tiêu chuẩn GRAS Ngoài ra, s dụng chủ yếu đường uống nên chủng phải đáp ứng số đặc điểm sinh họ c khả chịu đựng acid dịch vị dịch mật − Bài thực tâp khảo sát tỉ lệ sống sót vi sinh vật probiotic tiếp xúc với môi trường dịch vị nhân tạo dịch mật nhân tạo sau khoảng thời gian quy định phƣơn g pháp đếm sống KẾT QUẢ THỰC HÀNH 2.1.Vật liệu thực nghiệm − Chủng vi sịnh vật khảo sát  Tế bào sinh dưỡng vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 nuôi qua đêm TSB đ ã điều chỉnh với dung dịch NaCl 0,85% đạt khoảng 0,4.10 tế bào/mL (OD600 = 0,5)  Bào tử Bacillus subtilis PY79 nuôi 48h thạch DSM điều chỉnh với dung dịch NaCl 0,85% đạt khoảng 0,4.10 tế bào/mL (OD600 = 0,5) − Môi trường dịch vị nhân tạo: Dùng HCl đặc điều chỉnh pH 1,5 ; − Môi trường dịch mật nhân tạo (pH 6,8): Điều chỉnh đạt nồng độ muối mật 0,15 ; 0,3 0,5% 2.2.Kết thí nghiệm 2.2.1 Đánh giá khả chịu đựng dịch vị nhân tạo − Tế bào sinh dưỡng Bảng 2.1 Khảo sát khả chịu đựng dịch vị nhân tạo dạng sinh dưỡng Số tế bào/mL (.10 ) Đối chứng ắc 50rpm (ph út) pH 1,5 − Thời gian l 0,134 pH 0,46 pH - 60 - - 6.5.10 90 - 84 - 0,048 −4 0,49 4,9 Bào tử (độ pha loãng) Bảng 2.2 Khảo sát khả chịu đựng dịch vị nhân tạo dạng bào tử Số tế bào/mL (.10 ) Thời gian l Đối chứng ắc 50rpm (ph út) pH pH pH 12,10 0,85 - 8,10 60 - - 1,85 9,50 90 1,62 0,75 2,00 16,80 Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH − Nhận xét: v − Kết luận: v 2.2.2 Đánh giá khả chịu đựng muối mật − Tế bào sinh dưỡng (độ pha loãng) Bảng 2.3 Khảo sát kh ả chịu đự ng d ịch mật nhân t ạo d ạng s inh dưỡ ng Số tế bào/mL (.108) Thời gian lắc 50rpm (phút) Đối chứng Muối mật 0,15% Muối mật 0,30% Muối mật 0,50% − 0,286 0,0153 0,12 4,1.10 60 - - 2,3.10 120 0,928 - 0,008 −3 3,5.10 −3 −3 - Bào tử (độ pha loãng) Bảng 2.4 Khảo sát khả chịu đựng dịch mật nhân tạo dạng b tử Số tế bào/mL (.108) Thời gian lắc 50rpm (phút) Đối chứng Muối mật 0,15% Muối mật 0,30% Muối mật 0,50% − − Nhận xét: v Kết luận: v 4,30 7,30 0,096 1,03 60 2,30 0,104 - - 120 2,00 0,084 - - Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH Tuần 03 TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGI NAT (Ngày 18/12/2013) -oOo - TÓM TẮT LÝ THUYẾT − Emzyme amylase có lực mạnh liên kết glycoside nên có nhiều ứng dụng Amylase thơ thu nhận từ nhiều nguồn tinh chế để ứng dụng y dược − Bài thực tập sử dụng amylase thu từ khoai lang, hấp phụ natri algi nate 2% (đệm AcONa 0,2M ; pH 4,8), kết tủa lại dung dịch CaCl2 0,7M giải hấp glucose ∆OD 2% Enzyme tinh chế xác định hàm lượng hoạt tính So sánh với thí nghiệm tương tự tiến hàn h enzyme thô KẾT QUẢ THỰC HÀNH 2.1.Xây dựng đƣờng chuẩn để xác định hoạt tính amylase Bảng 3.1 Mối quan hệ hàm lượng tinh bột (mg) mật độ quang (OD) Ống Tinh bột (mg) 0,0 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 0,154 0,287 0,404 0,444 0,668 ∆OD = ODi – OD0 0,000 0.8 0.7 0.3 0.6 0.2 0.5 0.1 0.4 ≈ 8,90 2.2.4 Hiệu suất tinh ch ế (%) : UTC 242,9 UTH 2320,5 HTCB-TC 8,90 HTCB-TH 12,85 Bảng 3.2 Các thơng số q trình tinh c hế tinh chế Thơ 180,6 12,85 2320,5 Tinh chế 27,3 242,9 10,47% Mức tinh chế 0,693 8,90 2.3.Nhận xét Bảng 3.3 Đánh giá thơng số q trình tinh chế Thơng số Kết Tiêu chuẩn Đánh giá Hiệu suất tinh chế 10,47% Thấp Ho ạt tính chun bi ệt thơ 12,85 Ho ạt tính chuyên bi ệt tinh 8,90 Tốt Mức tinh chế 0,693 Thấp = 2.2.5 Mức tinh chế : = ≈ 10, 47% ≈ 0,693 Hiệu suất Thông số A280 U U/A280 Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH ∆OD Tuần 04 CỐ ĐỊNH CGTase LÊN Tốt ALGINAT ≥ 4: Tốt (Ngày 25/12/2013) -oOo - TÓM TẮT LÝ THUYẾT − Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) enzyme có khả chuyển hóa tinh bột chất tương tự (bài thực tập dùng maltodextrin) thành cyclodextrin − Việc cố định CGTase lên alginate tận dụng khả tái sử dụng enzyme, giảm chi phí nghiên cứu sản xuất, tăng cường tính ổn định hoạt tính enzyme Bài thực tập sử dụng gel Ca-alginate để cố định enzyme theo phương pháp:  Bắt giữ: Cho dung dịch CaCl2 0,2M vào dung dịch chứa enzyme alginate  Hấp phụ: Cho dung dịch enzyme tiếp xúc với hạt gel Ca-alginate đệm Tris-HCl pH8 − Các hạt gel sau cố định enzyme rửa đệm Tris-Hcl pH8 đem xác định hoạt độ enzyme cố định Dịch lọc dịch rửa hạt gel xác định lượng pro tein tự để xác định hàm lượng hiệu suất trình cố định enzyme lên alginate  Xác định hàm lƣợng protein: Dựa vào độ chuyển dời λmax thuốc nh uộm Coomasie Brilliant Blue từ 464 (màu mâu đỏ, dạng tự do) sang 595 (màu xanh, dạng kết hợp vớ i protein)  Xác định hoạt độ enzyme: Dựa vào khả hấp phụ phân tử chất vào lõi kỵ nước cyclodextrin Bài thực tập sử dụng phenolphthalein (pH 10,5 có màu hồng đậ m), bị cyclodextrin ∆OD hấp phụ bị giảm nồng độ làm giảm cường độ màu KẾT QUẢ THỰC HÀNH 2.1 Xây dựng đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng protein Bảng 4.1 Mối quan hệ hàm lượng protein (mg) mật độ quang (O D) Ống Trắng Nồng độ BSA (µg/mL) 0,0 10 20 30 40 ∆OD595 = ODi – OD0 0,000 0,139 0,283 0,407 `0,489 0.6 y = 0.0125x + 0.0144 R² = 0.9904 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 45 10 15 20 25 30 35 40 Nồng độ BSA (µg/mL) Hình 4.1 Mối quan hệ hàm lượng protein (mg) mật độ quang (OD) (phƣơn g pháp Bradford) Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH 2.2.Xây dựng đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng β-cyclodextrin (β-CD) Bảng 4.2 Mối quan hệ nồng độ β-CD mật độ quang (OD) Ống Trắng Hàm lượng β-CD (mg) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 OD550 0,407 0,260 0,206 0,135 0,102 0,077 ∆OD550 = OD0 – ODi 0,147 0,201 0,272 0,315 0,330 0.4 y = 0.3179x + 0.0519 R² = 0.9136 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.2 1.2 0.4 0.6 0.8 Hàm lƣợng β-CD (mg) Hình 4.2 Mối quan hệ hàm lượng β-CD (mg) mật độ quang (OD) 2.3.Kết xác định hàm lƣợng hiệu suất protein cố định 2.3.1 Xác định hàm lượng protein chế phẩm CGTase − Độ pha loãng: n = 200 lần − OD595: 0,149 Thế vào phương trình hồi quy y = 0.0125x + 0.0144 → x = 10,768 µg/mL −3 − Áp dụng cơng thức: Hàm lƣợng protein/mL enzyme = n × x × 10 → Hàm lư ợng protein −3 chế phẩm CGTase 1mL chế phẩm: 200 × 10,768 × 10 = 2,1536 mg 2.3.2 Xác định hàm lượng protein cố định Bảng 4.3 Kết xác định hàm lượ ng hiệu suất cố định enzyme Phƣơng pháp BẮT GIỮ HẤP PHỤ Thể tích dịch lọc + dịch rửa (mL) 50mL OD595 0,117 0,198 0,082 0,1469 protein 8,208 14,688 (Độ phaNồng lỗngđộ : 10 lần) (µg/mL) Hàm lượng protein khơng cố định (mg) Hàm lượng protein cố định (mg) Hiệu suất cố định 2,0716 96,19% 2.4.Kết xác định hoạt tính protein cố định 2.4.1 Xác định hoạt tính enzyme chế phẩm CGTase − Độ pha loãng: n = 50 lần 2,0067 93,18% Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH − ODthử = 0,367 ; ODchứng = 0,447 → ∆OD = 0,08 Thế vào phương trình hồi q uy y = 0,3179x + 0,0519, ta có x = 0,0884 mg β-CD = 88,4 µg β-CD − Hoạt tính chung CGTase tự (HTCTD): ≈ 8,1667 U 0,3179 ×1135 ×15  Tính theo cơng thức : HTCTD (x ×10 × n a × M× t U / mL) = (Trong đó: x(µg) khối lượng β-CD tạo thành ; n độ pha loãng ; a hệ số góc phương trình hồi quy, M = 1135 khối lượng riêng CD ; 10 = 1mL/0,1mL tỉ l ệ enzyme tham gia ≈ 3,7921 U/mg 2,1536 phản ứng t (phút) thời gian phản ứng.) 88, ×10 × 50  Kết : HTCTD = − Hoạt tính riêng CGTase tự (HTRTD): HTCTD HL proteinTD  Tính theo cơng thức : HTR TD (U / mg protein) = (Trong đó: HL proteinTD hàm lượng protein tự chế phẩm CGTase (2 ,1536 mg)) 8,1667  Kết : HTRTD = 2.4.2 Xác định hoạt tính enzyme cố định − Hoạt tính chung CGTase cố định (HTCCD) tính theo cơng thức HT x × 8,04 0,3 × M × t CC D ( U) = (Trong đó: x(µg) khối lượng β-CD tạo thành ; 8,04 g tổng khối lượng hạt gel thu ; 0,3 g khối lượng mẫu 10 hạt gel ; M = 1135 khối lượng riêng CD t (phút) thời gian phản ứng.) − Hoạt tính riêng CGTase cố định (HTRCD) tính theo cơng thức HTRCD (U / mg protein) = HTCCD HL proteinCD Chế phẩm cố định (Trong : HL protein CD tự hàm Tiêuđó chí Chế phẩm dolượng protein cố định thu được) − Tỷ lệ hoạt tính tỷ lệ HTRCD HTRTD Bảng 4.4 Kết xác định hoạt tính enzyme cố định Phƣơng pháp BẮT GIỮ HẤP PHỤ OD550 chứng 0,364 0,318 OD550 thử 0,178 0,189 ∆OD = ODchứng – ODthử 0,186 0,129 Lượng β-CD (µg) tạo thành 421,83 242,53 Hàm lượng protein cố định (mg) 2,0716 2,0067 Hoạt tính chung (U) 0,664 0,382 Hoạt tính riêng (U/mg protein) 0,3205 0,1904 Tỷ lệ hoạt tính (HTRTD = 3,7921) 8,452% 5,021% 2.5.Nhận xét − Hiệu suất hai phương pháp cố định cao (96,19% 93,18%), o hụt thấp Phương pháp hấp phụ cho hiệu suất thấp phương pháp bắt giữ − So sánh hoạt tính enzyme theo bảng 4.5, ta thấy kết hoạt tính chế phẩm cố định thấp so với chế phẩm tự Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang 10 Báo cáo thực hành : CƠNG NGHỆ VI SINH Bảng 4.5 So sánh kết xác định hoạt tính enzyme Phương pháp bắt giữ Phương pháp hấp phụ Hoạt tính chung Hoạt tính riêng Tỉ lệ hoạt tính 8,1667 U 3,7921 U/mg 100% 0,664 U 0,3205 U/mg 8,452% 0,382 U 0,1904 U/mg 5,021% 2.6.Qui trình cố định CGTase lên alginate 2.6.1 Phương pháp bắt giữ 15mL dung dịch alginate 2% + mL enzym Hỗn hợp enzym + alginate - Nhỏ từ từ hỗn hợp vào 30mL CaCl2 0,2M - Ủ 15 phút - Lọc lấy hạt gel Ca-alginate-enzyme - Rửa gel đệm Tris-HCl pH8 (2 × 10mL) Hạt gel Dịch lọc + rửa (Enzyme cố địn (Enzyme tự do) h) 2.6.2 Phương pháp hấp phụ 30mL dung dịch CaCl2 0,2M - Nhỏ vào từ từ giọt 15mL alginate 2%enzym Hạt gel Ca-alginate - Cho vào 20mL đệm Tris-HCl pH8 - 2mL anzyme CGTase ủ 45 phút - Lọc lấy hạt gel Ca-alginate-enzyme - Rửa gel đệm Tris-HCl pH8 (2 × 10mL) Hạt gel Dịch lọc + rửa (Enzyme cố địn (Enzyme tự do) h) Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang 11 Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH Tuần CẢM ỨNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ H ỢP ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE (PA GE) Ngày 30/12/2013 -oOo - TÓM TẮT LÝ THUYẾT 1.1.Cảm ứng biểu protein tái tổ hợp − Dùng IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) để cảm ứng tạo thành T7 RNA polymerase giúp cảm ứng biểu protein tái tổ hợp chủng E.coli BL21(DE3) mang đoạn gen amyE (mã hóa cho α-amylase) vector pET28b(+) − Chủng sử dụng: Phân lập vi khuẩn thuộc chủng B21(DE3) có chứa vector pET28b(+) mang đoạn gen amyE dựa tiêu chí đề kháng với kanamycin (do vector pET28b(+) m ang gen Kan giúp vi khuẩn mọc mơi trường chứa kanamycin 30µg/mL) 1.2.Điện di gel polyacrylamide − Phân tích protein tái tổ hợp thu sai cảm ứng biểu IPT G để xem protein thu dạng tan hay khơng tan nhằm có biện pháp thu hồi tinh chế thích hợp − Nguyên nhân: Do protein biểu mức cao tế bào khác tế bào nguyên thủy (khác trình hâu dịch mã) làm cho protein gập lại không trở không tan môi trường nội bào kết tập thành thể vùi − Kỹ thuật phân tích : PAGE biến tính (SDS-PAGE) hệ đệm khơng liên tục Laemmli − Đối tƣợng phân tích:  Mơi trường ni cấy (có chứa IPTG) chủng E.coli BL21(DE3) có chứa gen amyE  Mơi trường ni cấy (khơng chứa IPTG) chủng E.coli BL21(DE3) có chứa gen amyE − Nội dung phân tích:  Phân tích tổng lượng protein thu  Phân tích tổng lượng protein tan potein khơng tan Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang 12 QUY TRÌNH THỰC TẬP Báo cáo th ực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH Chủng E.coli AmyE/380 - Phân lập thạch LBK30 (30 C, 24h) - Lấy khóm cấy vào 2mL LBK30 Dịch nuôi cấy E.coli AmyE/380 (LBK30) hông thêm IPTS - - Pha loãng 1:100 với LBK30 ống ắc 200 rpm (2-3h) - nghiệm (25mL/ống) - Lắc 200 rpm (37 C) tới đạt OD600 = 0,6 - Thêm IPTS - Lắc 200 rpm (2-3h) - Ly tâ Mẫu phân tích m 12000 rpm – phút - Phân tán cắn 1/10 thể t ích Tris-HCl pH8, 10mmol - Thêm 40µl đệm tải SDS 4X vortex – phút - Đun nóng 95 C nạp 10µL vào gel SDS-PAGE Đệm phân tán tế bào iêu âm lần × 30s/lần - Ly tâm 12000 rpm - Phân tán cắn - Ủ đá 10 phút, tán s - Ly tâm 14000 rpm – phút - Nƣớc + 1/3 thể tíc h đệm tải SDS 4X Đun 95 C nạp 0µL vào gel SDS-PAGE - Phân tán cắn 100µL đệm tải SDS 1X Đun 95 C nạp 0µL vào gel SDS-PAGE P h â n t í c h p r o t e i n tổn g Phân tích protein tan/khơng tan Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang 13 Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH Buổi 6: TINH CHẾ PROTEIN BẰNG SẮC KÝ ÁI L ỰC TINH CHẾ LYSOZYME BẰNG SẮC KÝ TRAO Đ ỔI ION Ngày 08/01/2014 -oOo - TÓM TẮT LÝ THUYẾT 1.1.Nguyên tắc sắc ký lực 2+ 2+ − Sắc ký lực ion kim loại (IMAC) sử dụng ion hóa trị II (Cu , Ni ,…) để gắn kết đặc hiệu với peptid có nhiều (từ 6-8 phân tử) histidine (Protein-HisTag) Protein giải hấp phụ dung dịch chứa imidazole có nồng độ cao (~100mM) Protein thu đem định lượng phương pháp đo quang OD595 với thuốc thử Bradford (Sử dụng đường chuẩn thi ết lập tuần 4.) O N H OH NH2 histidine N HN N imidazole − Bài thực tập tinh chế protein thu từ chủng E.coli AmyE/380 t ạo dòng (chứa vector pET28b(+)) IMAC sử dụng Ni-Sepharose − Vai trò số dung dịch đệm sử dụng  Đệm chạy 1X (chứa imidazole 5mM): Rửa cân cột h đẩy protein tạp sót lại nhựa sắc ký ngồi  Đệm rửa 1X (chứa imidazole 50mM): Rửa khỏi cột protein tạp có đ i HisTag sót lại nhựa sắc ký ngồi (do chúng gắn khơng đặc hiệu với nhựa)  Đệm 1X (chứa imidazole 100mM): Đẩy protein đích nhựa sắc ký ngồi  Đệm xả 1X (chứa EDTA 100mM): Rửa imidazole khỏi cột sau dùng cách tạo 2+ phức với ion Ni (có gắn với imidazole), phức hợp bị rửa khỏi cột nhằm thu h ồi imidazole  Đệm ion 1X (chứa NiSO4 100mM): Cân cột trước dùng sau r ửa với đệm xả 2+ cách bổ sung ion Ni thiếu nhựa bị đệm xả rửa trôi 1.2.Nguyên tắc sắc ký trao đổi ion − Dựa vào tính chất lưỡng tính enzyme mà chất phân tử protein Sử dụng vật liệu mang điện tích trái dấu với điện tích protein (trong mơi trường thích hợp) giúp ph ân lập loại protein mong muốn nhờ tạo liên kết tĩnh điện với phân tử − Mỗi ∆ODloại protein có giá trị pH đẳng điện (pHi) định mà protein trung hòa điện Tùy vào pH mơi trường mà protein có điện tích khác  pH < pHi : Tích điện dương Nhựa trao đổi ion sử dụng cationide  pH > pHi : Tích điện âm Nhựa trao đổi ion sử dụng anionide − Bài thực tập phân lập lysozyme (pI = 10) môi trường pH (đệm chạy chứa 50mM Tris HCl) nên sử dụng nhựa cationide SP-sepharose FF Protein giải hấp phụ khỏi nh ựa cách thêm đệm chứa ion với nồng độ cao (chứa 2M NaCl, 50 mM Tris Hcl pH 8) cạ nh tranh gắn kết với lysozyme Protein thu đem định lượng phương pháp đo quang OD595 với thuốc thử Bradford (Sử dụng đường chuẩn thiết lập tuần 4.) Chỉ lấy kết có OD595 từ 0,139 trở lên (tương ứng ống số 1) Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang 14 Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH KẾT QUẢ THỰC HÀNH (PHẦN Sắc ký trao đổi ion) 2.1 Xây dựng đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng protein Bảng 6.1 Mối quan hệ hàm lượng protein (mg) mật độ quang (O D) Ống Trắng Nồng độ BSA (µg/mL) 0,0 10 20 30 40 ∆OD595 = ODi – OD0 0,000 0,139 0,283 0,407 0,489 0.6 y = 0.0125x + 0.0144 0.5 0.4 R² = 0.9904 0.3 0.2 0.1 0 45 10 15 20 25 30 35 40 Nồng độ BSA (µg/mL) Hình 6.1 Mối quan hệ hàm lượng protein (mg) mật độ quang (OD) (phƣơn g pháp Bradford) 2.2 Kết thực tập Bảng 6.2 Kết trình tinh chế lysosyme Mẫu A B C D1 D2 D3 Thể tích (mL) 1 1 OD595 0,359 0,378 0,410 0,091 0,024 29,088 31,648 6,128 0,768 20 20 10 10 61,28 7,68 0,054 Nồng độ protein (µg/mL) 27,568 3,168 Hệ số pha lỗng 100 Hàm lượng protein (µg) 2756,8 581,76 1898,88 3,168 − Tổng khối lượng protein (ống A): 2756,8 µg − Tổng khối lượng protein thu ống D: 68,96 µg (Ống D3 bị loại nằm ngồi khoảng tuyến tính đường chuẩn Bradford) D 68,96 A 2756,8 − − Nhận xét:  Hiệu suất tinh chế 2,5% thấp  Tổng khối lượng protein C 1898,88 ≈ 68,88% tổng lượng protein chứng tỏ dịch C chứa nhiều protein tạp mẫu tinh chế chứa protein đích Hiệu suất tinh chế: H =×100% = ×100% ≈ 2,5% Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang 15 SƠ ĐỒ QUÁ TRÌNH TINH CHẾ 3.1.Tinh chế sắc ký lực Cột rỗng - Rửa nước cất vô trùng Báo cáo - Phân tán nhựa sắc ký (úp ng SINH ửa) thực hành : CÔNG NGHỆ VI Cột chứa nhựa sắc ký - Thêm 2mL Ni-Sepharose, để Dịch nuôi cấy E.coli yên 1h - Ly tâm 10.000 rpm, phút - Thu lấy cắn tế bào Cột chứa nhựa sắc ký (gắn Ni-Sepharose) Hoạt hóa cột : - 0,5mL × lần nước cất vơ trùng - 0,5mL × lần đệm ion 1X - 0,5mL × lần đệm chạy H 1X Cắn tế bào - Phân tán đệm chạy H 1X - Tán siêu âm (giữ lạnh) - Ly tâm 10.000rpm, phút Dịch A (nƣớc nổi) Cột hoạt hóa Lấy 1,0mL nap vào cột Dịch B - 0,5mL × đệm chạy H X - 0,5mL × đệm rửa H 1X OD595 ≥ 0,1 Dịch C 39 - Từng 1mL đệm H 1X OD595 ≥ 0,1 39 - 0,5mL × đệm chạy H X Cột cân Dịch D Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang 16 3.2.Tinh chế sắc ký trao đổi ion Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH Cột rỗng - Rửa nước cất vô tr ùng - Phân tán nhựa sắc ký (úp ngửa) Dịch lòng trắng trứng Cột chứa nhựa sắc ký - Ly tâm 10.000 rpm, phút - Thêm 2mL SP-Sepharose, để yên 1h Dịch A (nƣớc nổi) Cột chứa nhựa sắc ký (gắn SP-Sepharose) Hoạt hóa cột : - 0,5mL × lần nước cất vơ trù ng - 0,5mL × lần đệm chạy L 1X Cột hoạt hóa Lấy 1,0mL nap vào cột Dịch B - 0,5mL × đệm chạy L X OD595 ≥ 0, Dịch C 139 - Từng 1mL đệm L 1X OD595 ≥ 0, 139 - 0,5mL × đệm chạy L X Cột cân (Bảo quản 4-8 C, EtOH 24%) Dịch D Nhóm thực tập IV – Chiều thứ − Bàn số – Tiểu nhóm Trang 17