BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HÀNH, CÔNG NGHỆ SINH HỌC, Tiếp cận phương pháp PCR, Sử dụng phương pháp PCR, phát hiện Salmonella trong mẫu vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD:

TS NGUYỄN MINH XUÂN HỒNG ThS TÔN BẢO LINH

NHÓM THỰC HIỆN:

VÕ ĐÌNH TÍN

LÊ BẠCH NGỌC TRÂN HOÀNG QUANG BÌNH

Tp Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2017

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH SÁCH BẢNG 2

DANH SÁCH HÌNH 3

Chương 1 Mở đầu 4

1.1 Đặt vấn đề 4

1.2 Mục tiêu 5

Chương 2 Tổng quan 5

2.1 Khái quát về Salmonella 5

2.2 Kỹ thuật PCR 7

Chương 3 Vật liệu và phương pháp 9

3.2.1 Phương pháp thực hiện 9

3.2.1 Tiền tăng sinh mẫu 9

3.2.2 Qui trình tách chiết DNA 9

3.2.3 Thực hiện phản ứng PCR 12

3.2.4 Điện di kiểm tra kết quả PCR 13

3.2.2 Đọc kết quả 16

Chương 4 Kết luận 17

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 12 Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt của các phản ứng PCR 12

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1: Dung dịch tiện tăng sinh 9

Hình 3.2: Loại bỏ xác mẫu trong dung dịch tiện tăng sinh 9

Hình 3.3: Thu kết tủa 10

Hình 3.4: Thu kết tủa lần 2 10

Hình 3.5: Làm lạnh dung dịch 11

Hình 3.6: Phản ứng PCR 11

Hình 3.7: Các bước chuẩn bị gel agarose 1% 14

Hình 3.8:Các bước thực hiện điện di trên gel agarose 14

Hình 3.9: Chọn hiệu điện thế điện di 14

Hình 3.10 Xem kết quả chạy điện di 15

Hình 3.11 Xem kết quả chạy điện di dưới đèn UV 15

Chương 1

Mở đầu

1 Đặt vấn đề

Cuộc sống ngày càng phát triển, nhiều thiết bị hiện đại được phát minh giúp cho ngành công nghệ thực phẩm phát triển, đáp ứng được nhu cầu của con người về thực phẩm Bên cạnh đó, các phương pháp chế biến thực phẩm cũng được cải tiến hơn, nhiều phương pháp nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm đã được đưa ra, giúp rút ngắn thời gian chế biến, tăng cấu trúc, màu sắc và hương vị của sản phẩm

Tuy nhiên, vấn đề được quan tâm nhất trong ngành thực phẩm đó là vấn đề vệ sinh

an toàn thực phẩm Một trong những loài vi sinh vật có khả năng gây ngộ độc cao và được

quan tâm nhiều nhất đó là Salmonella Salmonella là tên chung của nhiều loại vi khuẩn Chúng có thể có mặt ở các loại thịt gia cầm và trứng, hay ở cả trái cây và rau nữa Hầu hết

các loại Salmonella đều tác hại trực tiếp vào bao tử khiến người bệnh đau bụng, tiêu chảy và

nôn mửa trong vài ngày Cũng có loại vào đường ruột, gây thương hàn khiến người bệnh có

thể tử vong Do đó, việc phát hiện Salmonella có trong thực phẩm được đặt lên hàng đầu.

Phương pháp hiện đại gần đây được sử dụng nhiều là PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp khuếch đại DNA chuyên biệt bằng cách sử dụng mồi chuyên biệt Trong bài báo cáo này, nhóm xin trình bày phương pháp PCR được sử dụng để phát hiện

Salmonella trong thực phẩm.

2 Mục tiêu

- Tiếp cận phương pháp PCR

- Sử dụng phương pháp PCR phát hiện Salmonella trong mẫu vật.

Chương 2 Tổng quan

2.1 Khái quát về Salmonella

Salmonella được xếp vào giới Bacteria, ngành Proteobacteria, họ

Enterobacteriaceae, chi Salmonella Giống Salmonella hiện nay được chia thành 2 loài:

Salmonella bongori (không gây bệnh) và Salmonella enterica (gây bệnh) Ðến nay, hơn

2.500 kiểu huyết thanh thuộc chi Salmonella

S enterica lại được chia ra làm 6 dưới loài khác nhau là S enterica (S enterica I), S.

salamae (S enterica II), S arizonae (S enterica IIIa), S diarizonae (S enterica IIIb), S houtenae (S enterica IV) và S indica (S enterica VI) Phần lớn, các serotype thuộc S enterica I là nguyên nhân gây hơn 99,9 % các bệnh nhiễm trùng ở người và động vật.

Trong đó, một số loài Salmonella có tầm quan trọng trong chẩn đoán bệnh ở ngườivà động

vật là:

- S typhi: chỉ gây bệnh cho người Ở Việt Nam, bệnh thương hàn chủ yếu do vi khuẩn

này gây ra

- S paratyphy A: chỉ gây bệnh thương hàn cho người Ở Việt Nam, thường phát

hiệnvi khuẩn này sau vi khuẩnS typhi

- S paratyphy B: gây bện thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi có ở súc vật, thương

phát hiệnở các nước châu Âu

- S paratyphy C: vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả năng gây bệnh

viêm dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết, thường xuất hiệnở các nước Đông Nam Á

- S typhimurium và S enteritidis gây bệnh cho người và gia súc, là nguyên nhân chủ

yếu của nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn do vi khuẩn Salmonella

- S choleraesuis: là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm trùng huyết do vi

khuẩn

Về hình thái, Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hình que, ngắn, hai đầu hơi tròn,

kích thước trung bình khoảng 0,4 – 0,6 x 1 – 3 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S gallimarum và S pullorum, có khoảng 7 đến 12 tiên mao bao quanh thân; phát triển tốt ở nhiệt độ 6 °C- 42 °C, thích hợp nhất ở 37 °C, pH thích hợp là 6,8 – 7,2

Đặc điểm nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển được trên các

môi trường nuôi cấy thông thường, làmđục môi trường canh thang sau 18 h Trên môi

trường thạch thường, khuẩn lạc Salmonella tròn, lồi, trắng xám, trong, bờ đều, đường kính

khoảng1 – 1,5 mm Salmonella có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như HE (hektoen entericagar), XLD (xylose lysine deoxycholate) Trên môi trường HE, khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, một số dòngSalmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.Còn

trên môi trường XLD, khẩn lạc đặc trưng của Salmonella có màu hồng trong suốt,có hay không cótâm đen, một số dòng Salmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết

khuẩn lạc, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ

Đặc điểm sinh hóa Phần lớn, các chủng Salmonella không lên men lactose, lên men

glucose và sinh hơi Phản ứng oxidase âm tính, indol âm tính, VP âm tính, ure âm tính, H2S dương tính

2.2 Kỹ thuật PCR

PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp được sử dụng trong sinh học phân tử

để khuếch đại một hay một vài bản sao của đoạn DNA bất kì của sinh vật, tạo thành hàng triệu bảo sao từ một trình tự đặc trưng ban đầu Phương pháp này được áp dụng phổ biến

để khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu và rất hữu ích trong chẩn đoán và theo dõi các bệnh di truyền, định danh sinh vật và nghiên cứu chức năng gen

Phản ứng PCR gồm các thành phần: DNA khuôn, mồi xuôi và mồi ngược, các nucleodite (dNTP), enzyme DNA polymerase, MgCl2 và dung dịch đệm

Thông qua các chu kì luân nhiệt, các đoạn DNA mục tiêu được tổng hợp nhờ enzyme

DNA polymerase.

Hình 2.1 Thành phần và một chu kì nhiệt của phản ứng PCR.

Chương 3 Vật liệu và phương pháp

3.1 Dụng cụ và thiết bị

3.1.1 Dụng cụ

Pipet 200-

1000 µL Pipet 20- 200 µL

Pipet 2.0- 20 µL

Pipet 1.0-10 µL

Kéo Bao tay Đầu hút pipet 200-1000 µL Đầu hút pipet 20- 200 µL

3.1.2 Thiết bị

Cân phân tích

Tủ hút

Máy ly tâm tốc độ 6000 vòng,

>11.000 vòng

Bộ điện di ngang

Máy Vortex Máy PCR

Lò vi sóng Water bath (1000C)

3.2 Phương pháp thực hiện

3.2.1 Tiền tăng sinh mẫu

Cân 25 g mẫu cho vào túi nylon vô trùng, bổ sung 100 mL môi trường BPW vào túi Ủ mẫu đã chuẩn bị trên ở 37 + 1 oC trong 18 ( + 2) giờ

3.2.2 Qui trình tách chiết DNA

 Lấy 2 mL dịch tiền tăng sinh mẫu vào ống eppendorf

Hình 3.1: Dung dịch tiện tăng sinh

 Ly tâm 6000 vòng/10 giây để loại bớt xác mẫu, thu dịch nổi để ly trích DNA

Hình 3.2: Loại bỏ xác mẫu trong dung dịch tiện tăng sinh

 Ly tâm 11.000 vòng/10 phút, đổ bỏ dịch nổi và thu kết tủa (sinh khối tế bào)

Hình 3.3: Thu kết tủa

 Huyền phù tủa trong 1 mL dung dịch PBS hoặc nước cất vô trùng

 Ly tâm 11.000 vòng trong 10 phút, sau đó bỏ dịch nổi và thu phần tủa

Hình 3.4: Thu kết tủa lần 2

 Huyền phù tủa trong 200 µL dung dịch đệm TE bằng cách vortex trong 10 giây

 Đun các ống mẫu ở 100 oC trong 15 phút.

 Làm lạnh nhanh các ống này bằng cách đặt ống trong đá 15 phút

Hình 3.5: Làm lạnh dung dịch

 Vortex trong 10 giây Ly tâm ở 11000 vòng trong 10 phút ở 4 oC

 Thu 50 – 100 µL phần dung dịch trên sang một tube mới

 Tiến hành thực hiện phản ứng PCR hoặc bảo quản DNA ly trích ở -20 oC

3.2.3 Thực hiện phản ứng PCR

Chuẩn bị phản ứng PCR với các thành phần như bảng 2.1

Đặt các tube phản ứng vào máy PCR và cài đặt máy theo bảng 2.2

Trình tự mồi khuếch đại đoạn DNA kích thước 429 bp đặc hiệu cho S typhimurium ST11: 5’- GCC AAC CAT TGC TAA ATT GGC GCA -3’

ST15: 5’- GGT AGA AAT TCC CAG CGG GTA CTG G – 3’

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR

Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút (μL)μL)L)

Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt của các phản ứng PCR

Giai đoạn Nhiệt độ (μL) o C) Thời gian Số chu kỳ

Khuếch đại

35

3.2.4 Điện di kiểm tra kết quả PCR

Thể tích dung dịch agarose cần là 190ml nồng độ 1,5% => magarose =2,85g Làm tan agarose cùng với dung dịch đệm TBE 0,5X

Thể tích dung dịch đệm TBE cần là: 500ml nồng độ 10X dùng cho vào bồn điện di + 190ml nồng độ 10X dùng pha agarose = 690ml

Pha 690ml dung dịch đệm TBE từ 10X cần dùng 34,5ml TBE 10X Vậy để pha TBE 0.5X cần:

 Pha 500 ml cần 25 ml TBE 10X

 Pha 190 ml cần 9.5 ml TBE 10X

3.2.4.1 Chuẩn bi gel agarose 1%

+ Cân 2,85g agarose và cho vào bình tam giác

+ Bổ sung 190ml dung dịch đệm TBE 10X (vào bình tam giác và lắc nhẹ)

+ Làm tan agarose bằng lò vi sóng,

+ Đợi agarose nguội khoảng 650C và đổ vào khay gel

+ Gắn lược gel vào khay và đợi khoảng 15 phút cho gel nguội và đông lại

+ Nhẹ nhàng gở lược gel ra khỏi miếng agarose

3.2.4.2 Chuẩn bị bồn điện di

+ Cho 25 ml TBE vào bình 500 ml

+ Cho thêm nước cất, định lượng đến 500 ml

+ Cho 500ml dung dịch đệm TBE 0,5X vào bồn điện di

+ Cho khay gel agarose vào bồn sao cho dung dịch đệm ngập gel 0,5cm

Hình 3.7: Các bước chuẩn bị gel agarose 1%

Đặt gel vào bồn điện di Bơm mẫu vào giếng

Hình 3.8:Các bước thực hiện điện di trên gel agarose

Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút

Hình 3.9: Chọn hiệu điện thế điện di

3.2.2 Đọc kết quả.

Hình 3.10 Xem kết quả chạy điện di

Chương 4 Kết luận

Dựa vào khả năng tích điện của DNA, có thể biết được mẫu kiểm tra có chứa DNA vi khuẩn hay không Vạch số 18 và số 19 (hình 3.9) tương đương với đối chứng dương và đối chứng âm của mẫu Khi có dòng điện đi qua, các phân tử tích điện âm có xu hướng di chuyển

về cực dương của điện trường va ngược lại, phân tử tích điện dương lại có xu hướng di chuyển về cực âm Hình 3.9 cho thấy vệt đối chứng âm (vạch số 19) gần như không di chuyển mà đứng yên, vệt đối chứng dương (vạch số 18) di chuyển xa vạch số 19 và đi về cực

âm của điên trường Qua đó, có thể đọc kết quả kiểm tra rằng nếu vạch mẫu càng di chuyển

xa đối chứng dương và đi về cực âm thì đây chính là DNA của vi khuẩn Để biết được độ dài của vệt kết quả, so sánh giữa dãy vạch đối chứng số 9

Theo kết quả điện di hình 3.9, kết quả của nhóm ở vạch số 3 và số 4, trong đó, vạch số 3(số 3) là kết quả của thịt gà nạc ở 4oC (số 4) là thịt gà xay ở 0oC Hai mẫu số 3 và số 4 đều

chứa DNA của Salmonella nên vệt di chuyển của mẫu khá xa so với vạch đối chứng âm.

Quan sát hình 3.9 cho thấy vệt chứa vi khuẩn di chuyển khá xa vạch đối chứng âm về cực

dương Dựa vào kết quả có thể kết luận rằng thịt gà chứa nhiều Salmonella hơn thịt tôm

(vạch số 4 và 5), thịt heo (vạch số 6 và 7) Dù được bảo quản ở nhiệt độ lạnh đông hay bảo quản ở nhiệt độ mát thì vi khuẩn vẫn tồn tại trong thịt gà mà không bị tiêu diệt Hơn nữa, vi khuẩn có khả năng đề kháng tốt với nhiệt độ lạnh đông Sản phẩm thịt gà xay hay thịt gà nguyên thì vẫn nhiễm vi khuẩn với lượng như nhau Vì vậy, cần có cách bảo quản thịt gà với điều kiện khác tốt hơn để đảm bảo chất lượng thịt