BƯỚC đầu NGHIÊN cứu bào CHẾ CAO hà THỦ ô đỏ

Hà thủ ô đỏ đã được sử dụng từ lâu trong những bài thuốc dân gian Á Đông và được lưu truyền đến ngày nay trong các sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm... Trong Dược điển Việt Nam, tiêu chuẩn chất lượng Hà thủ ô đỏ và thành phẩm ở nước ta chỉ dựa trên hoạt chất anthraglycosid, song những năm gần đây, các tài liệu nước ngoài không còn sử dụng hoạt chất này nữa mà dựa trên các hoạt chất thuộc nhóm stilben. Các hoạt chất thuộc nhóm stilben là thành phần chống oxy hóa có trong Hà thủ ô đỏ được chú ý nhiều do khả năng chữa được các bệnh rối loạn của tuổi già, bệnh lão khoa như rối loạn tim mạch, rối loạn nhận thức, Alzheimer… Những nghiên cứu mới trên in vivo và in vitro về khả năng chống oxy hóa, ethyl acetat được chứng minh có khả năng chiết hoạt chất stilben nhiều. Mặt khác, lần đầu tiên Dược điển Trung Quốc 2005 đã đưa tiêu chuẩn định lượng hoạt chất trên vào tiêu chuẩn Hà thủ ô đỏ và Hà thủ ô đỏ chế cũng như trong những bài thuốc chứa Hà thủ ô đỏ. Anthraglycosid bị giảm gần như không còn trong quá trình chế biến nhưng thành phần stilben phải đạt được tiêu chuẩn định lượng trong giới hạn cho phép. Do vậy khi chế biếnbào chế cao Hà thủ ô đỏ và chế phẩm theo tiêu chuẩn mới này, ngoài tiêu chuẩn cũ về hoạt chất anthraglycosid, ta cần phải đưa tiêu chuẩn mới về định lượng thành phần stilben. Việc định lượng hoạt chất này rất phức tạp như chất chuẩn khó tinh chế và phải định lượng bằng phương pháp HPLC nên ta có thể thay bằng định lượng hoạt chất thô qua chiết xuất bằng ethyl acetat. Do đó, đề tài “Bước đầu nghiên cứu bào chế cao Hà thủ ô đỏ theo tiêu chuẩn mới” được thực hiện với những nội dung sau: Kiểm nghiệm nguyên liệu nhằm chọn lựa dược liệu Hà thủ ô đỏ sống để chế biến thành Hà thủ ô đỏ chế trên cơ sở định lượng hoạt chất anthraglycosid và hàm lượng nhóm stilben thô chiết được bằng ethyl acetat. Xây dựng quy trình chế biến Hà thủ ô đỏ với Đậu đen theo phương pháp cổ truyền và khảo sát sự thay đổi của thành phần anthraquinon, hợp chất stilben thô trước và sau khi chế biến. Xây dựng quy trình bào chế cao Hà thủ ô đỏ từ Hà thủ ô đỏ chế với Đậu đen và đề xuất tiêu chuẩn thành phẩm và phương pháp kiểm nghiệm.

Trang 1

LÊ THỊ ANH THẢO

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ CAO HÀ THỦ Ô ĐỎ

THEO TIÊU CHUẨN MỚI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Trang 2

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2010

Trang 3

LÊ THỊ ANH THẢO

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ CAO HÀ THỦ Ô ĐỎ

THEO TIÊU CHUẨN MỚI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Thầy hướng dẫn: Th.S LÊ VĂN LĂNG

Trang 4

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2010

Trang 5

MỤC LỤC

Lời cám ơn iv

Danh mục các chữ viết tắt v

Danh mục các hình vi

Danh mục các bảng vii

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI, TRANG THIẾT BỊ 16

3.1.2 Hóa chất, dung môi 16

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ 16

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.2.1 Xử lý nguyên liệu 17

3.2.2 Kiểm nghiệm dược liệu [5], [20] 17

3.2.5 Thẩm định quy trình phân tích 24

3.2.8 Xây dựng quy trình chiết xuất tối ưu với sự giúp đỡ của phần mềm thông minh 26

3.2.8.1 Mô hình thực nghiệm 26

Y = 27

3.2.8.2 Quy trình chiết xuất 27

3.2.8.3 Phân tích dữ liệu 27

3.2.8.4 Thực nghiệm kiểm chứng 28

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

4.1 KIỂM NGUYÊN LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ: 30

4.6 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO HÀ THỦ Ô ĐỎ 44

4.6.1 Thiết kế mô hình chiết xuất 44

Trang 6

LỜI CẢM ƠN

Xin kính gửi lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Lê Văn Lăng đã quan tâm và tận tình chỉ bao, giúp

đỡ tạo mọi điều kiện cho em có thể hoàn thành được khóa luận.

Xin chân thành cam ơn cô Th.S Lê Thị Thu Vân-Giang viên Bộ môn Bào chế đã dành thời gian quý báu để nhận xét, đánh giá và phan biện giúp cho khoá luận hoàn chỉnh hơn.

Xin cam ơn thầy Đỗ Quang Dương-Bộ môn Vi tính Dược và cô Võ Thị Bạch Huệ- Môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm đã giúp đõ em trong quá trình làm khóa luận.

Vô cùng cam ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về trang thiết bị giúp cho việc hoàn thành khoá luận của quý thầy cô ở bộ môn Bào Chế, Bộ Môn Dược Liệu, Bộ môn Hóa Dược, Bộ Môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm…

Vô cùng biết ơn Ban Chủ Nhiệm Khoa Dược và quý thầy cô đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt kiến thức trong suốt khoá học.

Trang 7

Xin chân thành cám ơn các bạn lớp D2005, đặc biệt là các bạn tham gia làm khóa luận tại bộ môn Bào Chế và em Khoa D2006 đã quan tâm, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận.

LÊ THỊ ANH THẢO

Trang 8

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DĐVN Dược điển Việt Nam

DĐTQ Dược điển Trung Quốc

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

In vitro Trong ống nghiệm

In vivo Trên sinh vật

RSD Độ lệch chuẩn tương đối

(Relative Standard Deviation)SKLM Sắc ký lớp mỏng

Trang 9

Y = 27

DANH MỤC CÁC BẢNG MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

Trang 10

Y = 27

Trang 11

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Hà thủ ô đỏ đã được sử dụng từ lâu trong những bài thuốc dân gian Á Đông và được lưutruyền đến ngày nay trong các sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm Trong Dược điển Việt Nam,tiêu chuẩn chất lượng Hà thủ ô đỏ và thành phẩm ở nước ta chỉ dựa trên hoạt chấtanthraglycosid, song những năm gần đây, các tài liệu nước ngoài không còn sử dụng hoạt chấtnày nữa mà dựa trên các hoạt chất thuộc nhóm stilben Các hoạt chất thuộc nhóm stilben làthành phần chống oxy hóa có trong Hà thủ ô đỏ được chú ý nhiều do khả năng chữa được cácbệnh rối loạn của tuổi già, bệnh lão khoa như rối loạn tim mạch, rối loạn nhận thức,

Alzheimer… Những nghiên cứu mới trên in vivo và in vitro về khả năng chống oxy hóa, ethyl

acetat được chứng minh có khả năng chiết hoạt chất stilben nhiều

Mặt khác, lần đầu tiên Dược điển Trung Quốc 2005 đã đưa tiêu chuẩn định lượng hoạt chấttrên vào tiêu chuẩn Hà thủ ô đỏ và Hà thủ ô đỏ chế cũng như trong những bài thuốc chứa Hàthủ ô đỏ Anthraglycosid bị giảm gần như không còn trong quá trình chế biến nhưng thànhphần stilben phải đạt được tiêu chuẩn định lượng trong giới hạn cho phép Do vậy khi chếbiến-bào chế cao Hà thủ ô đỏ và chế phẩm theo tiêu chuẩn mới này, ngoài tiêu chuẩn cũ vềhoạt chất anthraglycosid, ta cần phải đưa tiêu chuẩn mới về định lượng thành phần stilben.Việc định lượng hoạt chất này rất phức tạp như chất chuẩn khó tinh chế và phải định lượngbằng phương pháp HPLC nên ta có thể thay bằng định lượng hoạt chất thô qua chiết xuất bằngethyl acetat

Do đó, đề tài “Bước đầu nghiên cứu bào chế cao Hà thủ ô đỏ theo tiêu chuẩn mới” được thựchiện với những nội dung sau:

- Kiểm nghiệm nguyên liệu nhằm chọn lựa dược liệu Hà thủ ô đỏ sống để chế biến thành Hàthủ ô đỏ chế trên cơ sở định lượng hoạt chất anthraglycosid và hàm lượng nhóm stilbenthô chiết được bằng ethyl acetat

- Xây dựng quy trình chế biến Hà thủ ô đỏ với Đậu đen theo phương pháp cổ truyền và khảosát sự thay đổi của thành phần anthraquinon, hợp chất stilben thô trước và sau khi chếbiến

- Xây dựng quy trình bào chế cao Hà thủ ô đỏ từ Hà thủ ô đỏ chế với Đậu đen và đề xuấttiêu chuẩn thành phẩm và phương pháp kiểm nghiệm

Trang 12

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 HÀ THỦ Ô ĐỎ

Tên khoa học: Polygonum multiflorum Thunb.

Họ: Rau Răm (Polygonaceae) [15]

Hình 2.1 Hà thủ ô đỏ

2.1.1 Mô tả thực vật [8], [18], [2], [10], [6]

Dây leo bằng thân quấn, sống lâu năm Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn vào nhau Rễ phình thành

củ, màu nâu đen, củ nguyên có hình giống củ khoai lang, vỏ xù xì, ruột màu nâu đỏ Lá mọc

so le hình mũi tên, gốc hình tim, đầu thuôn nhọn, dài 5–8 cm, rộng 3–4 cm, 3–5 gân xuất phát

từ gốc lá, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng; cuống dài khoảng 2 cm, phủ lông tơ, bẹ chìamỏng, ngắn, có lông dài

Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, dài hơn lá; lá bắc ngắn; hoa nhỏnhiều, màu trắng; nhị 8, thường dính vào gốc của bao hoa

Quả hình 3 cạnh, nhẵn bóng, nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài phát triển thành những cánhrộng

Mùa hoa: tháng 9–11; mùa quả: tháng 12-2

Trang 13

2.1.2 Phân bố sinh thái [8], [18], [2]

Chi Fallopia Adans gồm các loài là cây thân cỏ và dây leo nhỏ, phân bố rộng rãi ở vùng cận

nhiệt đới và nhiệt đới Ở Việt Nam, có 1 loài là cây Hà thủ ô đỏ Trên thế giới, Hà thủ ô đỏ có

ở Trung Quốc, Bắc Lào, Nhật Bản và Ấn Độ Ở Việt Nam, Hà thủ ô đỏ chỉ có ở một số tỉnhvùng núi cao (trên 1000 m) phía Bắc

Hà thủ ô đỏ là cây ưa khí hậu ẩm mát của vùng cận nhiệt đới và vùng nhiệt đới núi cao Cây

ưa sáng và có thể hơi chịu bóng

Hà thủ ô đỏ ra hoa quả nhiều hằng năm Sau khi quả già, phần thân leo trên mặt đất tàn lụi, hạtgiống phát tán ra xung quanh và sẽ nảy mầm vào mùa xuân – hè năm sau

Nguồn dược liệu Hà thủ ô đỏ ở Việt Nam trước khá dồi dào Tuy có khu phân bố rộng nhưngqua hàng chục năm khai thác liên tục và bị tàn phá do nạn phá rừng làm nương rẫy, vùng phân

bố tự nhiên của cây dần bị thu hẹp Hà thủ ô đỏ đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam để bảo vệ[1]

Hà thủ ô đỏ ít bị sâu bệnh Cần chú ý phòng trừ dế hại mầm non

Cây trồng sau 2–3 năm thì thu hoạch, để lâu quá củ dễ bị thối Năng suất trung bình đạt1,5–2,5 tấn củ khô/ha

Để tăng năng suất, Hà thủ ô đỏ được trồng trong nhà kính với những điều kiện tốt như nhiệt

độ, độ ẩm và phân bón thường xuyên có thể cho Hà thủ ô đỏ đạt chất lượng bằng sản phẩmngoài thị trường trong vòng 6–12 tuần [28]

2.1.3 Bộ phận dùng [8], [6]

Rễ củ tròn hoặc hình thoi không nhất định, thường có những sống lồi dọc theo củ Củ dài 6-16

cm, chỗ phình có đường kính 4-8 cm Có thể gặp những củ dài đến 40 cm, đường kính trên 10

cm Mặt ngoài màu nâu đỏ, mặt cắt màu hồng, có bột Vị hơi đắng chát Rễ củ được thu háivào mùa thu, đào về rửa sạch đất, bỏ rễ con Củ nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi hoặc bổ tư, phơihay sấy khô Nếu đồ chín rồi phơi khô thì tốt hơn

Trang 14

Hình 2.2 Công thức hóa học của các anthraquinon trong Hà thủ ô đỏ.

Emodin, emodin-8-O-β-D-glucosid, physcion là những anthraquinon được biết đến do tácdụng kháng viêm, kháng khuẩn, bổ máu, nhuận tràng Những dẫn chất 1,8-dihydroxyanthraquinon là những thành phần gây tẩy xổ mạnh Hầu hết những thành phần

hydroxyanthraquinon đều có khả năng kháng Salmonella typhinium mạnh Trong đó, emodin

còn được quan tâm nhiều do khả năng thay đổi cấu trúc gen của vi khuẩn [34]

Emodin trong nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc đã được chứng minh có tác dụng

hạ huyết áp, giảm tác dụng co mạch của phenylephrin, serotonin

Emodin và physcion được xem là hoạt chất anthraquinon chống oxy hóa mạnh nhất và có tácdụng bảo vệ thành mạch [33]

Trang 15

2,3,5,4’ tetrahydroxystilbene–2–0–β–D–glucosid là chất bột màu nâu vô định hình, có trongthành phần của thuốc làm mọc tóc do có khả năng kích thích sự hình thành melanin, chiếmtrong rễ là 1 – 3% [24].

2,3,5,4’ tetrahydroxystilbene–2–0–β–D–glucosid trong những nghiên cứu gần đây được cho làmột trong những hoạt chất chính của Hà thủ ô đỏ có khả năng chống oxy hóa mạnh, tăng sựgiải phóng NO, giảm lipid máu và giảm tổn thương gan do chế độ ăn nhiều chất oxy hóa đồngthời làm tăng khả năng ghi nhớ của chuột [19]

Hình 2.3 2,3,5,4’ tetrahydroxystilbene–2–0–β–D–glucosidCác nhà khoa học đánh giá cao 2,3,5,4’ tetrahydroxystilbene–2–0–β–D–glucosid trong việcchữa trị bệnh Alzheimer và bệnh rối loạn nhận thức của người già trong tương lai

2,3,5,4’ tetrahydroxystilbene–2–0–β–D–glucosid và những dẫn xuất ester của nó đã được

chứng minh là có tác dụng ức chế enzyme Acetylcholinesterase in vitro [31].

Bên cạnh đó, 2,3,5,4’ tetrahydroxystilbene–2–0–β–D–glucosid còn có khả năng kháng viêmdùng để điều trị các bệnh viêm kết ruột thay thế cho các kháng viêm hiện đang sử dụng donhiều tác dụng phụ và khả năng tái phát cao [32]

Rhaponticosid là glucosid của trihydroxy-3,5,3’-methoxy-4’-stilben Chất này có hoạt tínhestrogen và có huỳnh quang xanh dưới ánh sáng tử ngoại [6]

Tanin [12], [8]

Hà thủ ô đỏ có chứa acid gallic, catechin, epicatechin

Trong đó acid gallic là bột vô định hình có hoạt tính chống oxy hóa và thu dọn gốc tự do mạnhnhất

Tanin trong Hà thủ ô đỏ còn được nghiên cứu cho thấy có khả năng chống đột biến gen và

kháng khối u in vivo [21].

Trang 16

Hà thủ ô đỏ còn có tác dụng bổ thận âm, dùng khi chức năng thận âm kém, dẫn đến lưng đau,

di tinh liệt dương, phụ nữ bạch đới, kinh nguyệt không đều, có thể dùng chung với hương phụ,ngải cứu, củ gai, lá sung, ích mẫu, đậu đen

Đồng thời Hà thủ ô đỏ có tác dụng chống viêm, dùng trong các trường hợp mụn nhọt, chân lởngứa

Hà thủ ô đỏ có tác dụng nhuận tràng thông tiện, dùng trong các trường hợp thiếu máu vô lực

mà dẫn đến đại tiện bí táo Ngoài ra còn dùng chữa trĩ, đi ngoài ra máu có kết quả tốt

Hà thủ ô đỏ còn có tác dụng nội tiết kiểu oestrogen, tác dụng kiểu progesteron nhẹ trên nộimạc tử cung, tăng tiết sữa và chống viêm

Hợp chất stilben trong Hà thủ ô đỏ có tác dụng dự phòng tổn thương gan trên chuột khi cho ăncác lipid oxy hóa Ngoài ra, resveratrol, piceid, 2,3,5,4’ tetrahydroxystilbene–2–0–β–D–glucosid còn ức chế sự peroxide lipid hóa gây ra bởi ADP và NADPH ở những vi tiểu thểtrong gan chuột Resveratrol (thành phần stilben trong rễ Hà thủ ô đỏ) có tác dụng kháng nấmkháng khuẩn

2.1.6 Công dụng- những bài thuốc và dược phẩm có chứa Hà thủ ô đỏ [18]

2.1.6.1 Công dụng

Hà thủ ô đỏ làm thuốc bổ gan thận, bổ máu, thuốc dùng nhiều cho người có râu tóc bạc sớm,lưng gối đau mỏi, di tinh, đại tiện ra huyết, ung nhọt, tràng nhạc, thần kinh suy nhược, sốt rétlâu ngày Dây Hà thủ ô đỏ dùng làm thuốc an thần, thuốc cầm mồ hôi Dùng ngoài trị lở ngứa

Tính vị: vị đắng, chát, tính ấm.

Quy kinh: vào 2 kinh can, thận.

Trang 17

2.1.6.2 Trong y học dân gian

Chữa huyết hư, máu nóng, tóc khô hay rụng, sớm bạc, hồi hộp chóng mặt, ù tai hoa mắt, mỏilưng mỏi gối, khô, khát, táo bón, dùng Hà thủ ô đỏ chế, sinh địa, huyền sâm, mỗi vị 20 g sắcuống

Chữa người già xơ cứng mạch máu, huyết áp cao hoặc nam giới yếu khó có con, dùng Hà thủ

ô đỏ, tằm gửi dâu, kỷ tử, ngưu tất sắc uống

Bổ khí huyết, mạnh gân cốt: Hà thủ ô trắng và Hà thủ ô đỏ, ngâm nước vo gạo, luyện với mật.Chữa đái buốt, ra máu: lá Hà thủ ô đỏ, lá Huyết dụ sắc uống

Điều kinh bổ huyết: Hà thủ ô đỏ, Đậu đen, nấu với rượu và mật ong thành cao

2.1.6.3 Trong Dược điển và sản xuất dược phẩm

Dược điển Việt Nam ghi nhiều bài thuốc như Sâm nhung bổ thận (viên hoàn), Huyết KhangMinh (viên hoàn)…

Trong sản xuất dược phẩm có rất nhiều dạng bào chế chứa Hà thủ ô đỏ như viên nang Sángmắt của Traphaco, Hà Sâm, Hà Sinh của Xí nghiệp 3 tháng 2 và những trà giảm béo và thuốc

- Giảm tác dụng nhuận tràng do antraglycosid giảm đi đáng kể trong phương pháp ngâm

- Tăng tác dụng bổ thận, dẫn thuốc vào kinh thận bằng cách chế với dịch nước Đậu đen 2.1.7.2 Biến đổi trong quá trình chế biến [28], [8], [13]

Biến đổi thành phần hóa học

Trang 18

Hà thủ ô đỏ sau khi chế biến có lượng tanin, dẫn chất antraquinon tự do và dẫn chấtantraquinon toàn phần, phospholipid đều giảm rõ rệt so với Hà thủ ô đỏ sống Hoạt chất2,3,5,4’ tetrahydroxystilbene–2–0–β–D–glucosid cũng giảm trong quá trình chế biến.

Hà thủ ô đỏ sống chứa 7,68% tanin, 0,259% dẫn chất antraquinon tự do, 0,805% dẫn chấtantraquinon toàn phần và 3,49% phospholipid

Hà thủ ô đỏ đã chế biến chứa 3,82% tanin, 0,113% dẫn chất antraquinon tự do, 0,25% dẫn chấtantraquinon toàn phần và 1,82% phospholipid [8]

Biến đổi tác dụng sinh học[13]

Thử tác dụng trên Chuột nhắt trắng thì thấy lô thử chế phẩm Hà thủ ô đỏ chế tăng trọng nhanh,

lô thử chế phẩm Hà thủ ô đỏ sống tăng trọng chậm, có chuột còn giảm trọng

Tác dụng nhuận tràng của mẫu chế giảm rõ rệt so với mẫu sống

Theo y học cổ truyền, chế Hà thủ ô đỏ với Đậu đen có tác dụng dẫn thuốc vào kinh thận.2.1.7.3 So sánh giữa Hà thủ ô sống, Hà thủ ô đỏ đã chế với Đậu đen và Đậu đen [4], [18].

Bảng 2.1 : So sánh giữa Hà thủ ô sống, Hà thủ ô đỏ đã chế với Đậu đen và Đậu đen

3,49% phospholipid

3,82% tanin, 0,113%

dẫn chất antraquinon tự

do, 0,25% dẫn chấtantraquinon toàn phần

Có tác dụng bổ thận Những vịthuốc chế với Đậu đen có tácdụng bổ thận thủy

Dùng dưới dạng sao vàng để trịmột số chứng bệnh dị ứng,nhiễm khuẩn như lở ngứa, mụn

nhọt

Nhận xét: Hà thủ ô đỏ sau khi được chế với Đậu đen làm tăng tác dụng bổ huyết, bổ gan thận,giảm suy nhược đồng thời giảm tác dụng phụ lên đường tiêu hóa

Trang 19

Chế Hà thủ ô đỏ với Đậu đen [5], [13], [16]:

- Chế theo Dược điển Việt Nam:

Ngâm: rửa sạch, ngâm với nước vo gạo 2 ngày đêm

Nấu: nấu với dịch Đậu đen đến khi chín đều Vớt ra thái phiến Tẩm dịch nấu, phơi hoặc sấy,làm nhiều lần đến khi hết dịch nước Đậu đen thì phơi khô kiệt

- Chế biến theo phương pháp đồ:

Ngâm: Hà thủ ô đỏ ngâm nước vo gạo 4 ngày đêm, mỗi ngày thay nước 1 lần Vớt ra, rửasạch

Đồ: rải Đậu đen và Hà thủ ô đỏ vào chõ Cứ 1 lớp Đậu đen lại 1 lớp Hà thủ ô đỏ Đồ đến khiĐậu đen chín nhừ Loại bỏ Đậu đen Phơi Hà thủ ô đỏ đến khi khô Làm như vậy nhiều lần.Thái phiến, phơi sấy đến khô kiệt

Tiêu chuẩn thành phẩm: phiến dày 1 – 2 mm, màu nâu đen, khô cứng, ít chát

- Phương pháp đồ với rượu:

Hà thủ ô đỏ thái lát cho vào chậu, đổ rượu ngâm 1 đêm

Ngày hôm sau bỏ vào chõ đồ khoảng 4 giờ, lấy ra phơi chỗ râm mát cho đến khô, lại đem đồ 2lần

- Chưng với Đậu đen:

Hà thủ ô đỏ: 10 kg

Đậu đen: 2 kg

Trang 20

Trước hết đem Đậu đen nấu kỹ lấy nước Dùng nước Đậu đen ngâm Hà thủ ô đỏ cho mềm,chưng 4-6 giờ, ủ 24 giờ, có thể lặp lại vài lần cho đến khi Hà thủ ô đỏ có màu đen Thái phiến.Phơi khô Tiếp tục lấy dịch chưng còn lại, tẩm vào Hà thủ ô đỏ Phơi khô.

- Nấu với Đậu đen:

Hà thủ ô đỏ: 10 kg

Đậu đen: 2 kg

Lấy Hà thủ ô đỏ và Đậu đen, thêm nước, ngâm và nấu kỹ, đến khi toàn bộ nước ngấm hết vào

Hà thủ ô đỏ, lấy ra thái phiến Phơi khô

- Phương pháp đơn gian

Phương pháp này thấy ở vùng Ninh Hiệp và nhiều nơi sản xuất để cung cấp cho thị trường tựdo

Hà thủ ô đỏ ngâm cho đến khi mềm, thái lát phơi cho se lại Đậu đen đem nấu lấy nước, xongđem Hà thủ ô đỏ vào nước đun và đảo đều liên tục cho đến khi cạn thì đem ra phơi Thườngthời gian từ khi đun đến lúc hoàn thành khoảng 2 giờ

2.1.8 Phân đoạn chiết với ethyl acetat và hoạt tính chống oxy hóa [14], [19].

Trong bài nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của Hà thủ ô đỏ in vitro và in vivo, các nhà

khoa học Trung Quốc đã so sánh hoạt tính sinh học giữa các dịch chiết H2O, ethyl acetat,hexan và butanol Chỉ có dịch chiết H2O và ethyl acetat thể hiện hoạt tính chống oxy hóa Dịchchiết H2O thể hiện hoạt tính tốt ở liều thấp 200 mg/kg, tuy nhiên khi tăng liều lên đến 400mg/kg thì dịch chiết H2O lại giảm khả năng bảo vệ tế bào gan chống lại chất độc CCl4 Nghiêncứu cho rằng có sự hiện diện của chất gây độc gan trong dịch chiết H2O của Hà thủ ô đỏ.Ngược lại, phân đoạn ethyl aceate thể hiện khả năng chống oxy hóa mạnh ở liều thấp 80mg/kg và không thể hiện độc tính ở liều cao Đáng chú ý hơn là hoạt tính chống oxy hóa củaphân đoạn ethyl acetat ở liều 80mg/kg mạnh gấp 3 lần dịch chiết H2O ở liều 200 mg/kg [23]

Trang 21

Trong một nghiên cứu về khả năng bảo vệ thành mạch của anthraquinon trong Hà thủ ô đỏ,dịch chiết ethyl acetat có chứa anthraquinon của Hà thủ ô đỏ cũng thể hiện khả năng chốngoxy hóa, cải thiện được chứng thiếu máu cơ tim cục bộ cũng như khả năng chống độc ganmạnh trong khi dịch chiết ethyl acetat không có chứa anthraquinon không thể hiện khả năngnày Hơn nữa khả năng phục hồi, co thành mạch của dịch chiết ethyl acetat có chứaanthraquinon được đánh giá cao nhất so với những chất được so sánh như α-tocopherol acetate

và emodin [33]

Các nhà nghiên cứu Nhật Bản cũng đã tìm thấy tác dụng chống đột biến gen và khả năngkháng khối u của Hà thủ ô đỏ Trong các phân đoạn ether, ethyl acetat, H2O, chỉ có phân đoạnethyl acetat thể hiện khả năng kháng khối u mạnh và phụ thuộc liều [21]

Trong nghiên cứu ở New Jersey, các nhà nghiên cứu lại một lần nữa khẳng định chỉ có phânđoạn chiết ethyl acetat từ dịch chiết cồn mới thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do làm giảmlipid máu và tổn thương tế bào gan mạnh nhất [19]

Dung môi ethyl acetat còn thể hiện khả năng chiết được các chất chống oxy hóa của những

dược liệu khác như cây Desmodium gangetium, còn gọi là cây Lá sém hay cây Cỏ dinh, Thóc

lép sông Hồng, là một loại cây được người dân Ấn Độ sử dụng từ lâu đời trị rắn cắn, ung thư,tiểu đường… Dịch chiết ethyl acetat thể hiện khả năng chống oxy hóa mạnh qua tác dụngchống lại những tổn thương thành mạch và chứng thiếu máu cục bộ trên chuột Khả năng này

có thể do sự chống oxy hóa lipid của dịch chiết [26], [18]

Ngoài ra, khi nghiên cứu cây Marsilea quadrifolia, Rau bợ nước, là loại cây dân gian hay sử

dụng chữa tắt sữa cho Phụ nữ sau sinh, người ta nhận thấy dịch chiết ethyl acetat của dượcliệu này có khả năng kháng khuẩn, giảm độc và chống oxy hóa mạnh so với các dung môiđược sử dụng như ether dầu hỏa, clorofom [30]

2.2 CAO LỎNG [5]

2.2.1 Định nghĩa

Trang 22

Cao lỏng là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó cồn vànước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác,quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc.

Giai đoạn II:

Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết bằng phương pháp khác nhau để thuđược cao lỏng có tỷ lệ theo như quy ước (1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu)

Cô dịch chiết trên cách thủy hoặc cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60 0C cho đếnkhi cao lỏng đạt tỷ lệ quy định Cao lỏng có khuynh hướng bị lắng cặn vì vậy để cao lỏng ởchỗ mát trong thời gian 3 ngày rồi lọc

2.2.3 Yêu cầu chất lượng

Nội dung của một tiêu chuẩn cao dược liệu gồm các phần sau đây:

- Đặc điểm mô tả: mô tả đặc điểm thể chất, màu sắc, mùi, vị của cao dược liệu

- Các chỉ số vật lý: độ tan, pH, riêng đối với cao lỏng thì có thêm chỉ tiêu về khối lượng riêng,

tỷ trọng, hàm lượng ethanol, độ trong và độ đồng nhất

- Định tính: các phản ứng hóa học hay phương pháp sắc ký để xác định các hoạt chất chínhtrong cao dược liệu

Trang 23

- Thử tinh khiết: mô tả các yêu cầu về độ tinh khiết của một cao dược liệu (tạp chất, độ ẩm, trotoàn phần, tro không tan trong acid hydrochlorid, tro tan trong nước, tro sulfat, dư lượng thuốcbảo vệ thực vật, các chất độc do ô nhiễm, giới hạn kim loại nặng, giới hạn tạp chất phóng xạ)

- Xác định hàm lượng: phương pháp xác định hoạt chất hay một nhóm hợp chất trong dượcliệu

- Một số nội dung không có tính chất ràng buộc về tiêu chuẩn chất lượng như: bảo quản, tính

vị quy kinh, công năng, chủ trị, liều dùng…

2.3 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT [3], [17]

2.3.1 Phương pháp ngâm

Là phương pháp đơn giản nhất đã có từ cổ xưa

Cách tiến hành: Cho dược liệu đã xử lý vào dụng cụ chiết (bình chiết, thùng gỗ hoặc kimloại…), đổ dung môi cho ngập dược liệu, sau một thời gian nhất định rút lấy dịch chiết (lọchoặc gạn) Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, người ta có thể khuấy

Ưu điểm: là phương pháp đơn giản rẻ tiền, dễ thực hiện, đặc biệt là nơi chưa có điều kiện đầu

tư thiết bị

Nhược điểm: Thao tác thủ công, năng suất thấp, thời gian chiết kéo dài, không chiết kiệt hoạtchất, muốn chiết kiệt phải tốn nhiều dung môi

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất

2.3.2.1 Yếu tố dược liệu

Cấu trúc dược liệu:

Dược liệu dùng để chiết xuất có thể là một phần hay toàn bộ động vật, thực vật, khoáng vậthoặc vi sinh vật

Trang 24

Bản chất của nguyên liệu đóng vai trò rất lớn trong quá trình chiết xuất Dược liệu non, mỏngmanh như hoa, chồi, lá non… dung môi dễ thấm qua nên quá trình chiết xuất diễn ra nhanh.Ngược lại, loại dược liệu già có cấu trúc rắn chắc như rễ, thân, thân rễ… được bao bọc bởichất xơ nước như nhựa sáp nên dung môi khó thấm vào dược liệu, quá trình hòa tan chiết xuấtdiễn ra chậm hơn.

Tùy theo bản chất của các chất có trong dược liệu mà người ta quy định chiết từ dược liệu tươihay khô Đối với các trường hợp đặc biệt người ta còn phải xử lý nguyên liệu trước khi đemchiết xuất

Mức độ phân chia dược liệu

Nguyên liệu được chia nhỏ thì thời gian thẩm thấu qua vách giảm làm cho quá trình chiếtnhanh hơn Tuy nhiên, càng chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn lọc của quá trình càng giảm, dịchchiết càng có nhiều tạp chất Để tránh dập nát tế bào dược liệu, nên dùng phương pháp phânchia nhỏ dược liệu bằng những tế bào theo nguyên lý cắt

Chất tan

Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng nhanh Kích thướcphân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách tế bào càng giảm

2.3.2.2 Yếu tố dung môi

Việc lựa chọn một dung môi hay hỗn hợp dung môi dùng trong chiết xuất là rất quan trọng vàtùy theo bản chất của mỗi loại dược liệu Cơ sở lựa chọn một dung môi để chiết xuất là tínhphân cực của hợp chất có trong dược liệu và tính chất của dung môi

Dung môi đóng vai trò chủ yếu đến tương tác của các chất tan trong dung dịch

Tỉ lệ dung môi và dược liệu

Lượng dung môi càng nhiều thì càng chiết được nhiều hoạt chất Tuy nhiên, có nhiều trườnghợp tăng tỉ lệ dung môi/dược liệu lên đã không làm tăng tỷ lệ hoạt chất một cách tương ứng

mà chỉ làm tăng lượng tạp chất Do đó cần tìm tỉ lệ dung môi/dược liệu thích hợp để đạt hiệusuất chiết, chất lượng dịch chiết tốt và có hiệu quả kinh tế

pH của dung môi

Trang 25

Thực nghiệm cho thấy pH dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, do đó cần tìm pH thíchhợp cho dược liệu cần chiết xuất.

2.3.2.3 Yếu tố kỹ thuật chiết xuất

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ chiết xuất được lựa chọn tùy thuộc vào tính chất của dược liệu và dung môi Nhiệt độcao có tác dụng làm giảm độ nhớt của dung môi, làm tăng độ tan và tốc độ khuyếch tán, có tácdụng phá hủy các tổ chức tế bào dược liệu Nhiệt độ tăng quá mức có thể phá hủy hoạt chất,tăng tạp chất, làm hao hụt dung môi có nhiệt độ sôi thấp

Sự khuấy trộn

Khuấy trộn làm tăng vận tốc tan và khuyếch tán hoạt chất vào dịch chiết

Thời gian chiết xuất

Thời gian chiết xuất càng dài thì lượng chất khuyếch tán vào dung môi càng tăng Tuy nhiênđến thời gian nhất định thì hoạt không tăng đáng kể mà chỉ tăng thêm tạp chất, ngoài ra còn cóthể phân hủy hoặc thủy phân tạp chất

Thời gian chiết xuất được dự tính phụ thuộc vào độ mịn dược liệu, phương pháp chiết, bảnchất dung môi, nhiệt độ chiết…

Trang 26

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI, TRANG THIẾT BỊ

3.1.1 Nguyên liệu

Hà thủ ô tươi, khô và chế của Trung tâm nghiên cứu nuôi trồng và chế biến cây thuốc Đà LạtLâm Đồng, nguồn gốc Việt Nam

Hà thủ ô đỏ chế (Radix Polygonum multiflorum), lô sản xuất 010509, đạt tiêu chuẩn chất

lượng theo DĐVN III của phòng Khoa Học Công Nghệ của công ty cổ phần dược liệu TW2.Dược liệu trên được cung cấp bởi cơ sở kinh doanh thuốc phiến và thuốc thành phẩm DượcPhát, nguồn gốc Trung Quốc

3.1.2 Hóa chất, dung môi

Dung môi dùng trong SKLM: methanol, benzen, ethyl acetat, ether etylic …

Dung môi dùng chiết xuất cao dược liệu: ethanol, ethyl acetat

Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254, cỡ hạt 0,015-0,04 mm

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu định tính định lượng anthraglycosid như NaOH, NH3,HCl, CoCl2,6H2O, H2SO4, H2O2…

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Cân phân tích Precísa XB220A (Thụy Sĩ) và cân Satorius TE142 (Đức)

Máy soi UV 2 bước sóng 254 nm và 365 nm VilBer Lourinat (Pháp)

Trang 27

Tủ sấy Memmert (Đức), tủ nung Carbolite Funaces (Anh), máy đo độ ẩm Kern (Đức).

Bể siêu âm Sonorex RK510H (Pháp), bếp cách thủy Memmert (Đức)

Bộ dụng cụ đun hồi lưu dùng để định lượng (a), máy đo quang Shimadzu PharmaSpec

UV-1700 (Nhật) (b)

3.1.4 Phần mềm chuyên dụng

Phần mềm Design Expert 6.0.6 bằng mô hình D-Optimal

Phần mềm nghiên cứu của khoa dược Đại học Y dược tìm ra thông số tối ưu do TS Đỗ QuangDương cung cấp và xử lý số liệu

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Xử lý nguyên liệu

Hà thủ ô đỏ tươi được rửa sạch và sấy khô

Hà thủ ô đỏ đã chế được xay nhỏ và rây qua rây 1 cm

3.2.2 Kiểm nghiệm dược liệu [5], [20]

Mô tả

Rể củ tròn, hoặc hình thoi, không đều, củ nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặtthành từng miếng to Mặt ngòai có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành Mặtcắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ítlõi gỗ Vị chát

Vi phẫu

Lớp bần gồm 3 - 4 hàng tế bào thành dày Mô mềm vỏ phát triển nhiều, rải rác có nhiều tinhthể calci oxalat hình cầu gai và hình thoi Từng đám libe cấp II rời nhau xếp thành một vòngtròn ứng với các đám gỗ cấp II ở bên trong Tầng sinh libe-gỗ Gỗ cấp II chạy vào đến tâm

Trang 28

Tia ruột chạy từ tâm cắt libe-gỗ cấp II thành từng đám Ngoài ra có các bó libe gỗ thứ cấpđược hình thành sau gỗ cấp II nằm riêng lẻ hoặc chụm với nhau rải rác khắp mô mềm vỏ.

Bột

Mùi nhẹ, màu nâu hồng, vị hơi chát Soi dưới kính hiển vi thấy: Nhiều hạt tinh bột đơn hoặckép đôi, kép ba, nằm riêng lẻ hoặc kết thành khối, đường kính 5-25 µm, rốn hình sao hay phânnhánh

Rải rác có các mảnh mạch điểm Tinh thể calci oxalat hình cầu gai, đường kính 20 - 50 µm.Mảnh bần gồm các tế bào hình đa giác thành dày có màu đỏ nâu Mảnh mô mềm có tế bàothành mỏng chứa tinh bột Sợi nhỏ dài có vách dày với nhiều ống trao đổi

Tiến hành: Cho 2-3 g bột đem thử vào một chén sứ hoặc chén platin đã nung và cân bì Nung

ở nhiệt độ không quá 450 0C trong 4 giờ, làm nguội rồi cân Tính tỉ lệ phần trăm của tro toànphần theo dược liệu đã làm khô trong không khí

Tro không tan trong dung dịch acid hydrocloric

Không quá 2%.

Tiến hành: Cho 25 ml acid hydrochloric 2 M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trungnhững chất không tan vào phễu thủy tinh xốp đã cân bì, hoặc vào một giấy lọc không tro, rửabằng nước nóng rồi đem nung ở 500 0C đến khi khối lượng không đổi Tính tỷ lệ phần trăm củatro không tan trong acid so với dược liệu đã làm khô trong không khí

Chất chiết được trong dược liệu

Không ít hơn 20%, tính theo dược liệu khô

Tiến hành theo phương pháp chiết lạnh, dùng ethanol 30% (TT) làm dung môi.

Trang 29

Tiến hành:

Cân chính xác khoảng 4 g bột dược liệu cho vào trong bình nón 250 ml Thêm chính xác 100

ml ethanol 30 0, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc trong 6 giờ đầu, sau đó để yên 18 giờ.Thêm dung môi cho đủ khối lượng ban đầu Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khôthích hợp Lấy chính xác 20 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đã cân bì trước, cô trongcách thủy đến cắn khô Sấy cắn ở 1050C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy, tính phần trăm lượng chất chiết đượcbằng nước theo dược liệu khô

Định tính

A Lấy 2 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, ngâm với 10 ml nước trong 30 phút, gạn lấy 5

ml, thêm 3 - 4 giọt dung dịch natri hydroxyd (TT) sẽ có màu đỏ sẫm.

B Lấy 0,1 g bột, thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT) đun cách thủy trong 5 phút,

để nguội, lọc, dịch lọc được acid hóa bằng dung dịch acid hydrocloric 10% (TT) đến môi trường acid (thử bằng giấy quỳ), sau đó lắc với 20 ml ether ethylic (TT), lớp ether ethylic có màu vàng cam, gạn lấy 5 ml ether, thêm 5 ml dung dịch amoniac đậm đặc (TT), lớp amoniac

Ban mỏng: Silica gel 60 F254.

Dung môi khai triển: Ethylacetat - methanol - nước (100 : 17 : 13)

Dung dịch thử: Lấy 0,25 g bột dược liệu đun cách thủy với 20 ml ethanol 96% (TT) trong 30

phút, để nguội, lọc, để bay hơi đến cắn khô Cắn thêm vào 10 ml nước và 1 ml dung dịch acid

hydrocloric 10% (TT) đun cách thủy 30 phút, để nguội sau đó lắc với 20 ml ether ethylic (TT)

2 lần, dịch ether được bay hơi còn khoảng 1 ml dùng làm dung dịch thử

Trang 30

Dung dịch đối chiếu: Pha dung dịch emodin 0,1 % trong ethanol 96% (TT) Nếu không có các

chất đối chiếu, dùng 0,25 g bột Hà thủ ô đỏ (mẫu chuẩn), chiết như dung dịch thử

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Saukhi triển khai, để khô bản mỏng trong không khí ở nhiệt độ phòng, phát hiện các vết dưới ánhsáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm và hơi amoniac Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải chocác vết có cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu

Sắc kí lớp mỏng theo DĐTQ

Ban mỏng: silica gel 60 F254

Dung dịch thử: Lấy 0,25 g bột dược liệu đun cách thủy với 20 ml ethanol 96% (TT) trong 30

phút, để nguội, lọc, để bay hơi đến cô đặc

Dung dịch chuẩn: 2,3,5,4’ tetrahydroxystilbene–2–0–β–D–glucosid hoặc dược liệu Hà thủ ô

chuẩn chiết như trên

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Saukhi triển khai, để khô bản mỏng trong không khí ở nhiệt độ phòng, phát hiện các vết dưới ánhsáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho các vết có cùngmàu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu

Hệ dung môi khai triển 1: benzene – cồn 90 0 (2:1) chạy 3,5 cm.

Hệ dung môi khai triển 2: benzene – cồn tuyệt đối (4:1) chạy 7 cm.

Định lượng

- Định lượng anthraquinon:

Cân 0,5 g bột rễ củ Hà thủ ô đỏ cho vào bình nón Thêm vào 5 ml H2SO4, 1 ml H2O2 Sau 15phút, thêm vào 100 ml ether etylic (TT) và chiết nóng với sinh hàn lạnh (t=10 0C) trong 30phút Để nguội, lọc qua bông vào một bình lắng gạn 250 ml, rửa bông bằng 10 ml ether etylic,rồi lấy lớp ether etylic Cho bông và lớp acid trở lại bình nón, lặp lại cách chiết như trên 2 lần,mỗi lần dùng 30 ml ether etylic trong 15 phút Tập trung các dịch lọc vào bình lắng gạn trên,lấy lớp ether etylic

Thêm cẩn thận 50 ml dung dịch kiềm–amoniac (TT) vào dịch chiết ether etylic đựng trongbình lắng gạn, lắc Sau khi hỗn hợp đã phân lớp hoàn toàn, gạn lớp nước màu đỏ trong suốt

Trang 31

vào bình định mức 250 ml Tiếp tục chiết lớp ether 3 lần, mỗi lần 40 ml dung dịch amoniac Tập trung các dịch chiết kiềm vào bình định mức 250 ml và thêm dung dịch kiềm-amoniac cho đến vạch.

kiềm-Đo mật độ quang ở bước sóng 520 nm trong cốc dày 1 cm so sánh với dung dịchkiềm-amoniac

Nồng độ anthranoid trong dung dịch cần đo được biểu thị bằng 1,8-dihydro anthraquinon vàxác định bằng đường tuyến tính xây dựng theo cobalt clorid

Theo quy ước, mật độ quang của dung dịch cobalt clorid 1% bằng mật độ quang của 0,36 mg1,8 dihydroxy anthraquinon trong 100 ml dung dịch kiềm-amoniac

Hàm lượng phần trăm dẫn chất anthraquinon so với dược liệu tính theo công thức:

)100(10

250

h a

c x

c : Nồng độ dẫn chất anthraquinon bằng mg/100ml tính theo đường tuyến tính

a : Khối lượng dược liệu tính bằng gam

h : Độ ẩm dược liệu tính bằng phần trăm

- Khối lượng chất khô chiết bằng ethyl acetat:

Cân chính xác khoảng 4 g Hà thủ ô đỏ cho vào bình nón 250 ml Thêm chính xác 100 ml ethylacetat, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc trong 6 giờ đầu, sau đó để yên 18 giờ Thêm dungmôi đủ khối lượng ban đầu Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp Lấychính xác 20 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đếncắn khô Sấy cắn ở 1050C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh đểxác định khối lượng cắn sau khi sấy, tính phần trăm lượng chất chiết được bằng ethyl acetattheo dược liệu khô

Trang 32

3.2.3 Chế Hà thủ ô đỏ với Đậu đen theo nhiều phương pháp

Các phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ với Đậu đen trong quá trình nghiên cứu:

- Phương pháp 1: Nấu với nước Đậu đen

Hà thủ ô đỏ: 200 g

Đậu đen: 40 g,

Trước hết đem Đậu đen nấu kỹ lấy nước

Dùng nước Đậu đen ngâm Hà thủ ô đỏ cho mềm, nấu đến khi dịch chưng thấm hết vào Hà thủ

ô đỏ, thái phiến, phơi khô

- Phương pháp 2: Đồ với Đậu đen

Hà thủ ô đỏ: 200 g

Đậu đen: 40 g

Lấy Hà thủ ô đỏ và Đậu đen, thêm nước, ngâm và nấu kỹ, đến khi toàn bộ nước ngấm hết vào

Hà thủ ô đỏ, lấy ra thái phiến, phơi khô

- Phương pháp 3: Chưng với Đậu đen

3.2.4.1 Xây dựng đường tuyến tính theo Cobalt clorid (CoCl2.6H2O):

Pha một dãy dung dịch Cobalt clorid (CoCl2.6H2O) có nồng độ từ 0,025 đến 5% và đo mật độquang các dung dịch này ở bước sóng 520 nm Trên trục tung ghi mật độ quang đo được Trêntrục hoành ghi nồng độ dẫn chất anthraquinon tương ứng với nồng độ Cobalt clorid, tính ra mgtrong 100 ml

Trang 33

Theo quy ước, mật độ quang của dung dịch cobalt clorid 1% bằng mật độ quang của 0,36 mg1,8 dihydroxy anthraquinon trong 100 ml dung dịch kiềm-amoniac.

3.2.4.2 Định lượng anthraquinon trong Hà thủ ô đỏ.

Cân 0,5 g bột rễ củ Hà thủ ô đỏ cho vào bình nón Thêm vào 5 ml H2SO4, 1 ml H2O2 Sau 15phút, thêm vào 100 ml ether etylic (TT) và chiết nóng với sinh hàn lạnh (t=10 0C) trong 30phút Để nguội, lọc qua bông vào một bình lắng gạn 250 ml, rửa bông bằng 10 ml ether etylic,rồi lấy lớp ether etylic Cho bông và lớp acid trở lại bình nón, lặp lại cách chiết như trên 2 lần,mỗi lần dùng 30 ml ether etylic trong 15 phút Tập trung các dịch lọc vào bình lắng gạn trên,lấy lớp ether etylic

Thêm cẩn thận 50 ml dung dịch kiềm–amoniac (TT) vào dịch chiết ether etylic đựng trongbình lắng gạn, lắc Sau khi hỗn hợp đã phân lớp hoàn toàn, gạn lớp nước màu đỏ trong suốtvào bình định mức 250 ml Tiếp tục chiết lớp ether 3 lần, mỗi lần 40 ml dung dịch kiềm-amoniac, Tập trung các dịch chiết kiềm vào bình định mức 250 ml và thêm dung dịch kiềm-amoniac cho đến vạch

Đo mật độ quang ở bước sóng 520 nm trong cốc dày 1 cm so sánh với dung dịch amoniac

kiềm-Nồng độ anthranoid trong dung dịch cần đo được biểu thị bằng 1,8-dihydro anthraquinon vàxác định bằng đường tuyến tính xây dựng theo cobalt clorid (TT)

Hàm lượng phần trăm dẫn chất anthraquinon so với dược liệu tính theo công thức:

)100(10

250

h a

c x

c : Nồng độ dẫn chất anthraquinon bằng mg/100ml tính theo đường tuyến tính

a : Khối lượng dược liệu tính bằng gam

h : Độ ẩm dược liệu tính bằng phần trăm

Trang 34

3.2.5 Thẩm định quy trình phân tích

Khao sát độ đúng

Thêm lượng CoCl2.6H2O tương ứng với 80%, 100%, 120% hàm lượng anthraquinon có trongmẫu thử Tiến hành định lượng và xác định tỉ lệ phục hồi trung bình

Khao sát độ lặp lại

Tiến hành lặp lại 6 lần quy trình chiết và định lượng trên cùng một mẫu bột rễ củ Hà thủ ô đỏ

và ghi nhận kết quả Tiến hành xử lý thống kê, xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất chiết

Tiến hành

Ngâm 2 g bột rễ củ Hà thủ ô đỏ lần lượt vào 20 ml cồn 30%, cồn 60%, cồn 90%, ethyl acetat.Ngâm trong 4 giờ Lọc qua bông, rút 5 ml dịch chiết cho vào 2 bình nón, cô cạn trên bếp cáchthủy

Bình 1: Định lượng anthraquinon

Bình 2: Thêm 40 ml ethyl acetat, siêu âm trong 1 giờ 30 phút, lọc, rút 20 ml ethyl acetat vàobình nón 250 ml, cô cạn trên bếp cách thủy Sấy cắn ở 1050C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trongbình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy Tìm khối lượng chấtchiết thô của ethyl acetat

Trang 35

Đo mật độ quang ở bước sóng 520 nm trong cốc dày 1 cm so sánh với dung dịch amoniac.

3.2.7 Khảo sát lượng dung môi ethyl acetat dùng để chiết kiệt anthraquinon trong cao khô chiết bằng cồn 90%

Thêm cẩn thận 30 ml dung dịch kiềm–amoniac (TT) vào dịch chiết ether etylic đựng trongbình lắng gạn, lắc Sau khi hỗn hợp đã phân lớp hoàn toàn, gạn lớp nước màu đỏ trong suốtvào bình định mức 100 ml Tiếp tục chiết lớp ether 30 ml dung dịch kiềm-amoniac Tập trungcác dịch chiết kiềm vào bình định mức 100 ml và thêm dung dịch kiềm-amoniac cho đến vạch

Đo mật độ quang ở bước sóng 520 nm trong cốc dày 1cm so sánh với dung dịch amoniac

Định dạng
Số trang	70
Dung lượng	7,29 MB