So sánh phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên (E2, P125) và khảo sát tình hình nhiễm virus dịch tả heo ở heo sinh sản tại một số cơ sở chăn nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ****************** NGUYỄN TIẾN DŨNG So sánh phương pháp ELISA phát kháng nguyên (E2, P125) khảo sát tình hình nhiễm virus dịch tả heo heo sinh sản số sở chăn ni LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Năm 2011 Chương MỞ ĐẦU Dịch tả heo (DTH) bệnh thuộc danh mục bệnh nguy hiểm bắt buộc công bố dịch (OIE) Bệnh gây tổn hại nặng nề cho ngành chăn ni heo giới nói chung ngành chăn ni Việt Nam nói riêng Chi phí để chống bệnh DTH lớn, Bỉ năm 1990 208 triệu Euro (Saatkamp cs, 2000), Hà Lan năm 1997 2,3 tỉ USD (Terpstra de Smit, 2000) Đối với Việt Nam bệnh xảy tỉnh miền Trung vào năm 1974 400.000 heo (Đào Trọng Đạt Trần Thị Tố Liên, 1989) Trong năm (1999 – 2001) tỉnh đồng sông Cửu Long bệnh xảy 30.000 heo (Hồ Thị Việt Thu, 2002) Bệnh thường xảy dạng cấp tính mãn tính, quan trọng hết dạng mãn tính dạng nái có khả gây tượng dung nạp miễn dịch cho heo làm giảm khả bảo hộ vaccin phòng bệnh DTH, tăng cao tình trạng mang trùng đàn heo Chính vùng chăn ni heo toàn giới việc theo dõi tỷ lệ nhiễm virus DTH điều thực định kỳ nhằm nắm vững tình trạng nhiễm virus đàn heo ni Phương pháp ELISA để phát kháng nguyên virus dịch tả heo E2 P125 lựa chọn hàng đầu trại quan thú Y Sở dĩ lựa chọn phương pháp kháng nguyên P125 protein có chất enzyme thẩm thấu qua màng tế bào nên diện nhiều nơi, máu huyết Còn E2 protein cấu trúc nên dễ phát dùng kháng thể đơn dòng tương ứng Kỹ thuật ELISA tìm kháng nguyên (E2, P125) ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán kháng nguyên DTH dễ thực tốn Nhằm tìm hiểu thêm tương đồng hai phương pháp loại mẫu xét nghiệm khác (huyết thanh, bệnh phẩm, máu có chất kháng đông) tiến hành thực đề tài: “So sánh phương pháp ELISA phát kháng nguyên (E2, P125) khảo sát tình hình nhiễm virus dịch tả heo heo sinh sản số sở chăn nuôi” Mục tiêu - Đánh giá mức độ tương đồng, độ nhạy, độ chuyên biệt hai phương pháp ELISA (E2, P125) - Phát tỷ lệ nhiễm virus DTH đàn heo sinh sản thành phố Hồ Chí Minh Yêu cầu - So sánh phương pháp ELISA (E2, P125) với phương pháp RT-PCR làm chuẩn - Phát virus DTH diện đàn heo sinh sản số sở chăn nuôi thành phố Hồ Chí Minh với ELISA P125 Chương TỔNG QUAN 2.1 Đặc điểm dịch tễ 2.1.1 Trên giới Năm 1810, bệnh giống bệnh DTH xuất bang Tennessee mơ tả Dahle (trích dẫn Bùi Quang Anh, 2001) Đến năm 1830, bệnh DTH báo cáo bang Ohio (Hoa Kỳ) sau nhiều quốc gia khác Đến năm 1885, Salmon Smith cho bệnh vi khuẩn, nhầm lẫn Đến năm 1903, Dorset Schweinitz khẳng định bệnh virus gây Từ năm 1962-1976, Mỹ thực chương trình tốn bệnh DTH với tổng chi phí lên đến 140 triệu đô la, ngày bệnh không xuất nước (van Oirschot, 1999) Từ năm 1822 – 1862, trận dịch DTH Châu Âu gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho nhiều quốc gia Pháp (1822), Đức (1833), Anh (1862) (van Oirschot, 1999) Đặc biệt, từ 1993 – 1998 có nhiều ổ dịch DTH xảy nghiêm trọng số quốc gia Đức (1993-1997) có 280 ổ dịch; Hà Lan 1997 có 424 ổ dịch; Ý có 80 ổ dịch; Bỉ (1997) lần xảy dịch DTH Trong năm 1997, có triệu heo bị giết hủy nước Châu Âu (Đức, Hà Lan, Italia, Tây Ban Nha Bỉ) (Nguyễn Tiến Dũng, 2002) Ở Châu Âu bệnh DTH lại xuất vào tháng tháng năm 1999 Hungari nhập heo bất hợp pháp (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002) Gần đây, ngày 08/8/2000 trận dịch DTH xảy nghiêm trọng Anh phải giết hủy 12.000 heo, gây thiệt hại kinh tế đáng kể Năm 2000-2002 Tây Ban Nha bùng phát DTH tỉnh Lerida Barcelona 49 trại với 291.058 heo chết tiêu hủy (Allepuz, 2007) Hình 2.1: Bản đồ phân bố bệnh DTH giới 2008 (OIE, 2008) Theo Wee cs (2005), từ năm 2002 – 2003 bệnh DTH bùng phát 65 trại heo Hàn Quốc Năm 2006 bệnh xuất Ấn Độ Ở Trung Quốc, nhiều tỉnh xuất bệnh sau thực chiến dịch tiêm phòng vaccin, đặc biệt tỉnh giáp biên giới Lào, Myanmar Việt Nam Ngoài nhiều trận dịch khác ghi nhận quốc gia Đông Nam Á (Thái Lan, Myanmar, Malaysia, Philippine, Indonesia, Việt Nam, Lào Campuchia) Trong năm (2005- 2007) giới có 19 quốc gia báo cáo bệnh DTH với 132 ổ dịch, có 3.273 heo mắc bệnh 36.165 heo tiêu hủy (OIE, 2007) Đặc biệt từ năm 2008 đến bệnh DTH xảy nhiều quốc gia Bảng 2.1: Bệnh DTH số quốc gia đầu năm 2008 Quốc gia Số ổ dịch Số heo hủy Bulgaria 318 Croatia 125 12.259 Đức 734 Nga 11 581 Nguồn: Thái Quốc Hiếu, 2009 2.1.2 Tại Việt Nam Theo Đào Trọng Đạt Trần Thị Tố Liên (1989), Việt Nam bệnh DTH Houdemer xác định vào năm 1923 - 1924 Năm 1986 có 481 ổ DTH, năm 1974 ổ DTH xảy từ Thanh Hóa dọc theo quốc lộ vào tới Quảng Trị giết chết 400.000 heo Đặc biệt năm 1978 ổ DTH miền Tây Nam giết chết 15.000 heo Dịch lớn xảy miền Bắc Việt Nam vào tháng 12-1959, tháng 3-1960 dịch nổ Lào Cai, Sơn La, Hà Đơng, Thanh Hóa, Nghệ An, năm 1963 dịch lan sang số tỉnh Cao Bằng, Bắc Cạn, Lạng Sơn, Thái Nguyên Cuối năm 1974, dịch xảy hầu hết tỉnh phía Bắc với tổng số 524 ổ dịch Từ năm 1975-1979 dịch có phần lắng xuống đến năm 1980 dịch lại bùng phát 13 tỉnh biên giới với 360 ổ dịch (Trịnh Văn Thịnh, 1985) Tại miền Nam, năm 1973, bệnh xảy 11 trại heo xung quanh Sài Gòn Năm 1981 bệnh xảy 15 tỉnh Nam gây chết 145.078 heo (Đào Trọng Đạt Trần Thị Tố Liên, 1989) Ở đồng Sông Cửu Long theo báo cáo Chi Cục Thú Y tỉnh, vịng năm (1999- 2001) có 30.281 heo tỉnh vùng mắc bệnh gây chết loại thải 22.004 con, thiệt hại lớn tỉnh Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long (Hồ Thị Việt Thu, 2002) Ngoài ổ dịch lớn, nhiều ổ dịch lẻ tẻ kéo dài triền miên xuất trại có quy mơ nhỏ, hộ gia đình Bệnh thường xảy thể khơng điển hình, tình trạng nhiễm trùng mức độ cao thấp khác Đây nguyên nhân quan trọng ảnh hưởng đến hiệu tiêm phòng, làm giảm suất chăn nuôi, gây thiệt hại lớn kinh tế Theo Hồ Việt thu (2002), đồng sông Cửu Long ghi nhận số ca bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng năm 1999-2001 sau: Bảng 2.2: Tình hình bệnh DTH đồng sơng Cửu Long từ 1999-2001 1999 Năm Số nghi Tỉnh bệnh Số chết 2000 Số % nghi bệnh Số chết 2001 Số % nghi bệnh Số chết % An Giang 467 267 57,17 161 142 88,20 Bạc Liêu 273 257 94,14 334 279 83,53 Cần Thơ 1.861 1.597 85,81 2.338 1.580 67,58 Đồng Tháp 4.608 3.464 75,17 4.616 3.128 67,76 Kiên Giang 408 406 99,51 631 534 84,63 Sóc Trăng 20 20 100 52 43 82,69 Trà Vinh 265 209 78,87 620 525 84,68 1.596 847 53,00 927 750 80,91 9.498 7.067 80,46 9.679 6.981 80,00 Vĩnh Long Tổng 11.095 7.956 71,7 Nguồn: Hồ Thị Việt Thu, 2002 Ngồi loại hình heo hồn toàn khỏe mạnh mang trùng nguyên nhân vụ dịch Theo báo cáo Phân Viện Thú Y Miền Trung, tháng đầu năm 2002 tỷ lệ nhiễm virus DTH lưu hành tỉnh Miền Trung 40-60% (Trích dẫn Nguyễn Tiến Dũng, 2002a) Kết chẩn đoán bệnh dịch tả heo Trung Tâm Thú Y Vùng Đà Nẵng phương pháp ELISA mẫu nghi ngờ bệnh DTH: Tỷ lệ nhiễm chung tỉnh khu vực Miền Trung (8 tỉnh thành phố có tỉnh miền núi Đắc Lắc, Gia Lai, Kontum) 57,30%, tỉnh có tỷ lệ nhiễm cao Quảng Ngãi 68,80%, Khánh Hịa 54,10%, Bình Định có tỷ lệ nhiễm thấp 48,50% Loại heo bị nhiễm bệnh * Heo 30 kg tỷ lệ nhiễm 64,70% * Heo từ 30-50 kg tỷ lệ nhiễm 59,40% Qua kiểm tra 139 mẫu huyết heo bị rối loạn sinh sản có 49 mẫu dương tính dịch tả chiếm tỷ lệ 35,30% Lê Văn Đẳng (2007) khảo sát 350 mẫu huyết nái, nọc tỉnh Bạc Liêu có tỷ lệ dương tính thấp 1,71% khơng có nọc dương tính với P125 (khảo sát trại hộ chăn ni) Tỷ lệ heo dương tính với P125 khảo sát lò mổ 11,43% Những nghiên cứu khác Trung Tâm Thú Y Vùng Thành Phố Hồ Chí Minh (2003) trại chăn ni heo tập trung Đồng Nai (trại có số nái 40 lấy 15 mẫu máu, trại có nái nhiều 400 lấy 25 mẫu) phát virus gây bệnh DTH 8/9 trại khảo sát Trại có tỷ lệ nhiễm thấp 7,86% cao 26,66% Cả trại có sử dụng vaccin phịng bệnh DTH chặt chẽ, heo nái chủng lần năm Bệnh xá Thú Y trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh xét nghiệm 32 mẫu máu trại heo Tân Trung (Củ Chi) phương pháp ELISA E2, phát mẫu dương tính chiếm tỷ lệ 6,28% (5/2010) Kết chẩn đốn DTH Trung Tâm Thú Y Trung Ương: xét nghiệm 122 mẫu huyết nái có mẫu dương tính chiếm 6,56% Điều cho thấy bệnh dịch tả heo có mặt nhiều sở chăn ni Bảng 2.3: Tình hình dịch bệnh DTH số tỉnh phía Bắc Địa Phương Mẫu huyết Mẫu bệnh phẩm Số mẫu Dương tính Hà Nội 0 4 Hà Tây 3 8 Hải Phòng 0 Hưng Yên 53 1 Nam Định 1 Quảng Trị 65 2 Thái Bình 0 3 Phú Thọ 0 122 24 23 Tổng Số mẫu Dương tính Nguồn: Nguyễn Tiến Dũng, 2002b Tại huyện Hải Lăng phát hai trường hợp heo nái nhiễm virus dịch tả heo (chiếm tỷ lệ 9,52%) Ở Sóc Sơn phát trường hợp (chiếm tỷ lệ 21,43%) Huyện Triệu Phong Đông Hà chưa phát trường hợp Bảng 2.4 Kết xét nghiệm huyết heo nái số sở chăn ni phía Bắc Trại heo Xét nghiệm virus DTH Số mẫu Mẫu dương % Trại A - Hà Tây 94 0 Trại B – Hà Nam 24 0 Hải Lăng 21 9,52 Triệu Phong 26 0 Đơng Hà 18 0 Sóc Sơn 14 21,43 Nguồn: Nguyễn Tiến Dũng, 2002b Hồ Huỳnh Mai (2003) thực khảo sát tình hình dịch tả heo hạ thịt thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang (mẫu lấy từ heo nghi DTH), tỷ lệ nhiễm 31,81% Nguyễn Cẩm Tuyền (2003) khảo sát tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu, cho thấy tỷ lệ nái hộ dân dương tính với P125 10% (31/310 mẫu xét nghiệm lấy ngẫu nhiên) Xét nghiệm 30 mẫu bệnh phẩm có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ bệnh DTH, tỷ lệ dương tính 23,33% Theo Cục Thú Y, bệnh DTH không nổ ổ dịch lớn gây thiệt hại năm trước đây, mối đe dọa lớn ngành chăn ni heo, gây khó khăn cho chăn ni xuất Năm 2005 nước có 9.773 ổ dịch (Nguyễn Thu Hà, 2008) 2.2 Đặc điểm sinh học virus DTH 2.2.1 Phân loại Virus DTH xếp vào: Họ Flaviviridae Giống Pestivirus Chi: Flavivirus, Hepacivirus Pestivirus Virus DTH thuộc chi Pestivirus (Trần Đình Từ, 2005), chi không truyền lây qua côn trùng Theo Becher cs (2003), chi bao gồm loại virus gây bệnh tiêu chảy bò (Bovine viral diarrhoea virus 1- BVDV 1), tiêu chảy bò (Bovine viral diarrhoea virus 2- BVDV 2), bệnh cừu (Border disease virus – BDV), bệnh DTH cổ điển (Classical swine fever virus – CSFV) 2.2.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo Đặc điểm hình thái Virus DTH có hệ gen ARN chuỗi đơn, mạch dương, dài khoảng 12,3 kb có vỏ bọc bên ngồi, hình cầu đường kính 40-50 nm, đối xứng khối 20 mặt, khối lượng phân tử khoảng 60106 Da LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên: Nguyễn Tiến Dũng sinh ngày 09 tháng 09 năm 1979 huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long Con Ông Nguyễn Văn Phương Bà Phạm Thị Cưởng Tốt nghiệp tú tài trường Trung học phổ thông cấp 2-3 Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long, năm 1997 Tốt nghiệp Đại học ngành Thú Y hệ chức Đại học Nông Lâm, Thủ Đức TP Hồ Chí Minh Sau làm việc Công Ty TNHH Virbac Việt Nam Tháng 9/2007 theo học Cao học ngành Thú Y Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, TP Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: Vợ Võ Kim Huyền, sinh năm 1983, kết hôn năm 2005 Con trai: Nguyễn Nhật Thăng sinh năm 2007 Địa liên lạc: 33/1, tổ 50, khu phố 11, phường Tân Chánh Hiệp, quận 12 Điện thoại: 0917.10.30.20 - 0944.79.15.79 Email: tiendung092000@yahoo.com, tiendung092000@gmail.com ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan kết trình bày luận án cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình Tác giả Nguyễn Tiến Dũng iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: - PGS TS Nguyễn Văn Khanh - Th.S Nguyễn Văn Dũng - Th.S Huỳnh Thị Thu Hương - Th.S Đặng Thị Thu Hường Đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, tồn thể quý thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y giúp đỡ khích lệ tơi thực luận án tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn tồn thể cán nhân viên Phịng Huyết Thanh Trạm Chẩn Đốn Xét Nghiệm Điều Trị, Chi Cục Thú Y TP Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ tơi thực kỹ thuật xét nghiệm trình làm đề tài Tơi xin tri ân gia đình người thân dành cho tơi tình u thương với động viên khích lệ để tơi an tâm hồn thành luận án Nguyễn Tiến Dũng iv TÓM TẮT Đề tài "So sánh phương pháp ELISA phát kháng nguyên (E2, P125) khảo sát tình hình nhiễm virus dịch tả heo heo sinh sản số sở chăn nuôi" thực số mẫu gởi chẩn đoán từ trại 13 sở chăn ni có đăng ký chương trình an tồn dịch với Chi Cục Thú Y ba huyện Củ Chi, Hóc Mơn, Nhà Bè địa bàn thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thực từ năm 2009 đến năm 2010 Các kết nghiên cứu trình bày sau đây: So sánh xét nghiệm ELISA E2 ELISA P125 lấy RT-PCR làm chuẩn (1) Trên mẫu huyết thanh: Hai phương pháp ELISA tương đồng với trị số kappa (K=0,82) độ nhạy ELISA P125 cao (Se=66,67%) độ nhạy ELISA E2 (Se=50%), độ chuyên biệt hai (Sp=100%) (2) Trên mẫu bệnh phẩm: Mức độ tương đồng (K=0,9), độ nhạy ELISA E2 cao (Se=100%) độ nhạy ELISA P125 (Se=90%) Độ chuyên biệt hai phương pháp (Sp=90%) (3) Trên mẫu máu kháng đông cho mức độ tương đồng (K=0,60), độ nhạy phương pháp ELISA E2 (Se=100%) cao ELISA P125 (50%), độ chuyên biệt ELISA E2 (Sp=93,75%) cao ELISA P125 (Sp=87,50%) Kết tỷ lệ nhiễm theo xét nghiệm ELISA P125 Trên tổng số 671 mẫu huyết thu nhập đàn heo sinh sản khoẻ mạnh, khơng có dấu hiệu lâm sàng Các tỷ lệ nhiễm virus dịch tả heo sau: + Tỷ lệ nhiễm chung: 0,60% + Tỷ lệ nhiễm nái: 0,47% + Tỷ lệ nhiễm nọc: 3,70% Tỷ lệ nhiễm theo lứa đẻ, qui mô, địa bàn: + Theo lứa đẻ, tỷ lệ nhiễm 1,05% (nhóm lứa); 0,35% (nhóm từ - lứa) 0% (nhóm >5 lứa) v + Theo qui mô đàn, tỷ lệ nhiễm 2,18% (1.000 con/đàn) + Theo địa bàn, tỷ lệ nhiễm 0,23% Củ Chi; 0,97% Hóc Mơn 2,38% Nhà Bè Tóm lại, đề tài cho thấy số đặc điểm khác phương pháp ELISA E2 ELISA P125 ba loại mẫu (huyết thanh, bệnh phẩm, máu kháng đông) tỷ lệ nhiễm virus DTH khu vực thành phố Hồ Chí Minh thấp, vi ABSTRACT The thesis: “Compare diagnosis ELISA to detect E2 and P125 antigens and investigate prevalence of hog cholera virus infection in breeding pigs at some pig farms” was carried out with samples sent to laboratory, wich were from 13 pig farms registered in program of safety in HCMC (Cu Chi, Hoc Mon, Nha Be districts) from 2009 to 2010 Based on RT-PCR, we compared results of ELISA (E2, P125) from pathologic tissues, sera and anticoagulated blood of pigs that had CSF symptoms (1) With serum samples, two ELISA kit had kappa K = 0.82 + ELISA E2 method: sensitivity Se = 50 %, specificity Sp = 100 %; + ELISA P125 method: sensitivity Se = 66.67 %, specificity Sp = 100 % (2) The result of samples of lesions had the same level of kappa K = 0.90 + ELISA E2 method: sensitivity Se = 100 %, specificity Sp = 90 %; + ELISA P125 method: sensitivity Se = 90 %, specificity Sp = 90 % (3) With anticoagulated blood samples, kappa K = 0,60 + ELISA E2 method: sensitivity Se = 100 %, specificity Sp = 93.75 %; + ELISA P125 method: sensitivity Se = 50 %, specificity Sp = 87.50 % The study was carried out on 671 serum samples of clinically healthy breeding pigs The results showed that, with ELISA P125 kit, the general prevalence was 0.60 %, meanwhile prevalence on sows was 0.47 % and on boars was 3.70 % Distribution of prevalence in differeut parities was: - 0.44% (1st litter sow) - 0.15% (2nd to 5th litter sow) - 0% (more than 5th litter sow) Prevalence in differeut herd size: - 2.10% (smaller than 500 heads) - 0% (500-1000 heads) - 0.24% (larger than 1000 heads) vii Prevalence in district Cu Chi, Hoc Mon and Nha Be was 0.23%, 0.97% and 230%, respectively In brief, our research showed the different characteristies of ELISA E2 and ELISA P125 method with three kinds of sample (serum, lesion and anticoagulated blood) and prevalence of hog cholera virus infection in Ho Chi Minh city viii CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT TIẾNG ANH NGHĨA TIẾNG VIỆT BDV Border disease virus Virus gây bệnh cừu BVDV Bovine viral diarrhoea virus Virus gây bệnh tiêu chảy bò CRL EU Community Reference Phịng thí nghiệm tham chiếu Laboratory for CSF EU bệnh DTH CSF Classical swine fever Dịch tả heo cổ điển CSFV Classical swine fever virus Virus dịch tả heo DNA Deoxyribonucleic acid Axít nhân ELISA Enzyme-linked Phản ứng hấp thụ miễn dịch nối immunosorbent assay kết enzyme FAT Fluorescent antibody test Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang IFN Interferon Là cytokine, có vai trị ngăn cản nhân virus tế bào hỗ trợ đáp ứng miễn dịch Mab Monoclonal antibody Kháng thể đơn dịng NTR Non-translated region Vùng khơng mã hóa OD Optical density Mật độ quang học OIE Office International des Tổ chức Dịch tễ Thế Giới Epizooties ORF Open reading frame Khung đọc mở PK-15 Pig kidney – 15 Dòng tế bào thận heo PK - 15 PCV2 Porcine circovirus type PRRS Porcine reproductive and Hội chứng rối loạn sinh sản hô respiratory syndrome hấp heo ix RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription polymerase Kỹ thuật khuếch đại gen phiên mã SK-6 Axít nhân RNA chain reaction ngược Swine kidney – Dòng tế bào thận heo SK - VIẾT TẮT NGUYÊN CHỮ CTV Cộng tác viên CS Cộng DTH Dịch tả heo x MỤC LỤC TRANG Trang tựa i Lý lịch cá nhân ii Lời cam đoan iii Lời cảm tạ iv Tóm tắt v Abstract vii Danh mục chữ viết tắt ix Mục lục .xi Danh mục bảng xiv Danh mục biểu đồ, hình đồ xvi Chương 1: MỞ ĐẦU Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 Đặc điểm dịch tễ 2.1.1 Trên giới 2.1.2 Tại Việt Nam .5 2.2 Đặc điểm sinh học virus DTH 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo 2.2.3 Chức protein virus DTH 12 2.2.4 Đặc tính sinh miễn dịch 13 2.2.5 Con đường truyền lây 15 2.2.5.1 Truyền lây trực tiếp 15 2.2.5.2 Truyền lây gián tiếp 16 2.3 Động vật cảm thụ 17 2.4 Đường xâm nhập chế sinh bệnh 17 2.5 Chẩn đoán 18 2.5.1 Chẩn đoán phân biệt bệnh tích DTH .18 2.5.2 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang (FAT- fluorescent antibody test) 19 xi 2.5.2.1 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp 19 2.5.2.2 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang gián tiếp .19 2.5.3 Kỹ thuật ELISA (Enzyme linked imunosorbent assay) 20 2.5.3.1 Kỹ thuật ELISA phát kháng nguyên 20 2.5.3.2 Kỹ thuật ELISA phát kháng thể 21 2.5.4 Kỹ thuật trung hòa virus (Virus neutralization test) 21 2.5.5 Phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử .21 2.5.5.1 Kỹ thuật PCR 21 2.5.5.2 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) .23 2.5.6 Phương pháp tiêm động vật thí nghiệm 25 2.6 Phòng bệnh 25 2.6.1 Chăn ni an tồn sinh học .25 2.6.2 Phòng vaccin 25 2.7 Các cơng trình nghiên cứu liên quan .27 Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 29 3.1.Thời gian địa điểm thực 29 3.1.1 Thời gian 29 3.1.2 Địa điểm 29 3.1.3 Đối tượng khảo sát 30 3.2 Vật liệu 30 3.2.1 Cách lấy mẫu 30 3.2.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 31 3.2.3 Các kít dùng chẩn đoán 32 3.3 Nội dung thực 33 3.4 Xử lý số liệu 35 Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 37 4.1 So sánh phương pháp ELISA (E2, P125) lấy RT-PCR làm phương pháp chuẩn 37 xii 4.1.1 So sánh ELISA (E2, P125) mẫu huyết (xem RT-PCR phương pháp chuẩn) 37 4.1.2 So sánh phương pháp ELISA (E2, P125) mẫu bệnh phẩm (xem RTPCR phương pháp chuẩn) 41 4.1.3 So sánh phương pháp ELISA (E2, P125) mẫu máu kháng đông (xem RT-PCR phương pháp chuẩn) 45 4.1.4 So sánh độ nhạy, độ chuyên biệt, mức độ tương đồng hai phương pháp ELISA (xem RT-PCR phương pháp chuẩn) 48 4.1.4.1 Độ nhạy .48 4.1.4.2 Độ chuyên biệt 49 4.1.4.3 Mức độ tương đồng 50 4.2 Phát tỷ lệ nhiễm virus DTH phương pháp ELISA P125 50 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm heo sinh sản 50 4.2.2 Tỷ lệ nhiễm virus DTH theo nhóm heo 53 4.2.2.1 Trên nái .53 4.2.2.2 Trên nọc 54 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm virus DTH theo lứa đẻ nái 56 4.2.4 Tỷ lệ nhiễm virus DTH theo qui mô đàn 57 4.2.5 Tỷ lệ nhiễm virus DTH theo địa bàn .58 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 5.1 Kết luận 60 5.2 Đề nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 Phụ lục .73 Xử lý thống kê .100 xiii DANH SÁCH BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Bệnh DTH số quốc gia đầu năm 2008 Bảng 2.2: Tình hình bệnh DTH đồng sông Cửu Long từ 1999-2001 Bảng 2.3: Tình hình dịch bệnh DTH số tỉnh phía Bắc Bảng 2.4 Kết xét nghiệm huyết heo nái số sở chăn ni phía Bắc .8 Bảng 2.5: Chức protein virus DTH 12 Bảng 2.6: Đặc điểm bệnh lý bệnh DTH 18 Bảng 2.7: So sánh đặc tính kỹ thuật chẩn đoán để phát virus DTH 23 Bảng 2.8: Quy trình tiêm phịng vaccine DTH theo hướng dẫn nhà sản xuất 26 Bảng 2.9: Quy trình tiêm phòng vaccine DTH số trại TP.HCM Bình Dương .26 Bảng 2.10: Kết phát kháng nguyên P125 từ trại heo An Giang 28 Bảng 3.1: Phân bố mẫu khảo sát tình hình nhiễm virus DTH 13 sở chăn nuôi kỹ thuật ELISA P125 .34 Bảng 3.2: Cách tính mức độ tương đồng phương pháp xét nghiệm .35 Bảng 4.1: Kết xét nghiệm mẫu huyết phương pháp ELISA (E2, P125) kiểm chứng RT-PCR (n=17) 38 Bảng 4.2: Tỷ lệ dương tính với phương pháp mẫu huyết 39 Bảng 4.3: Mức độ tương đồng phương pháp ELISA (E2, P125) mẫu huyết .39 Bảng 4.4: Độ nhạy, độ chuyên biệt, giá trị chẩn đoán phương pháp ELISA (E2, P125) so với RT-PCR 40 Bảng 4.5 Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm với phương pháp ELISA (E2, P125) kiểm chứng RT-PCR (n=20) 42 Bảng 4.6: Tỷ lệ dương tính với phương pháp mẫu bệnh phẩm 43 Bảng 4.7: Mức độ tương đồng phương pháp ELISA mẫu bệnh phẩm 43 xiv Bảng 4.8: Độ nhạy, độ chuyên biệt, giá trị chẩn đoán hai phương pháp ELISA mẫu bệnh phẩm so với RT-PCR .44 Bảng 4.9: Kết xét nghiệm mẫu máu kháng đông với phương pháp ELISA (E2, P125) kiểm chứng RT-PCR (n=18) 45 Bảng 4.10: Tỷ lệ dương tính với phương pháp mẫu máu kháng đông 46 Bảng 4.11: Mức độ tương đồng phương pháp ELISA mẫu máu kháng đông .46 Bảng 4.12: Độ nhạy, độ chuyên biệt, giá trị chẩn đoán phương pháp ELISA (E2, P125) 47 Bảng 4.13: Kết xét nghiệm ELISA P125 heo sinh sản 13 sở chăn nuôi 51 Bảng 4.14: Kết xét nghiệm ELISA P125 heo nái 13 sở chăn nuôi 53 Bảng 4.15: Kết xét nghiệm ELISA P125 heo nọc sở chăn nuôi .55 Bảng 4.16: Tỷ lệ nhiễm virus DTH heo nái theo lứa đẻ 56 Bảng 4.17: Tỷ lệ nhiễm virus DTH theo quy mô đàn giống 57 Bảng 4.18: Tỷ lệ nhiễm virus DTH theo địa bàn .58 xv DANH SÁCH HÌNH, BIỂU ĐỒ, BẢN ĐỒ HÌNH TRANG Hình 2.1: Bản đồ phân bố bệnh DTH giới 2008 (OIE, 2008) .4 Hình 2.2: Cấu trúc vùng gen mã hóa protein tương ứng Pestivirus (Beer cs, 2007) 10 Hình 2.3: Con đường truyền lây virus DTH (Trần Đình Từ,1999) 15 Hình 2.4: Tiến trình PCR 22 Hình 3.1: Vị trí lấy mẫu (tĩnh mạch chủ trước tĩnh mạch tai) 30 Hình 3.2: Máy đọc gel, máy PCR, máy đọc ELISA 31 Hình 3.3: Phản ứng giếng phương pháp ELISA 32 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1: So sánh độ nhạy hai phương pháp ELISA (E2, P125) 48 Biểu đồ 4.2: So sánh độ chuyên biệt hai phương pháp ELISA (E2, P125) .49 Biểu đồ 4.3: Mức độ tương đồng hai phương pháp ELISA (E2, P125) 50 Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ có heo dương tính theo quy mô đàn 57 BẢN ĐỒ Bản đồ 3.1: Phân bố mẫu khảo sát địa bàn thành phố Hồ Chí Minh 29 Bản đồ 4.1 : Vị trí có mẫu dương tính khu vực khảo sát 52 xvi ... máu có chất kháng đơng) chúng tơi tiến hành thực đề tài: ? ?So sánh phương pháp ELISA phát kháng nguyên (E2, P125) khảo sát tình hình nhiễm virus dịch tả heo heo sinh sản số sở chăn nuôi? ?? Mục tiêu... Số mẫu Cơ sở1 Hóc Mơn Cơ sở Nhà Bè 8 Cơ sở Củ Chi 11.535 1.000 139 Cơ sở Củ Chi 763 153 56 Cơ sở Nhà Bè 12 12 12 Cơ sở Củ Chi 1.428 238 56 Cơ sở Hóc Mơn 60 60 55 Cơ sở Hóc Mơn 655 96 60 Cơ sở. .. phẩm, máu kháng đông Nội dung 2: Khảo sát tỷ lệ nhiễm virus DTH heo sinh sản - Khảo sát tỷ lệ nhiễm virus DTH heo sinh sản sở chăn nuôi phương pháp ELISA P125 33 Đối tượng khảo sát Heo nái, nọc