So sánh phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên (E2, P125) và khảo sát tình hình nhiễm virus dịch tả heo ở heo sinh sản tại một số cơ sở chăn nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ****************** NGUYỄN TIẾN DŨNG So sánh phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên E2, P125 và khảo sát tình hình nhiễm v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

******************

NGUYỄN TIẾN DŨNG

So sánh phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên (E2, P125) và khảo sát tình hình nhiễm virus dịch tả heo ở heo sinh

sản tại một số cơ sở chăn nuôi

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh

Chương 1

MỞ ĐẦU

Dịch tả heo (DTH) là một bệnh thuộc danh mục bệnh nguy hiểm và bắt buộc công bố dịch (OIE) Bệnh đã gây tổn hại nặng nề cho ngành chăn nuôi heo thế giới nói chung và ngành chăn nuôi Việt Nam nói riêng Chi phí để chống bệnh DTH là rất lớn, tại Bỉ năm 1990 là 208 triệu Euro (Saatkamp và cs, 2000), Hà Lan năm

1997 là 2,3 tỉ USD (Terpstra và de Smit, 2000) Đối với Việt Nam bệnh xảy ra tại các tỉnh miền Trung vào năm 1974 trên 400.000 heo (Đào Trọng Đạt và Trần Thị

Tố Liên, 1989) Trong 3 năm (1999 – 2001) tại 8 tỉnh đồng bằng sông Cửu Long bệnh đã xảy ra trên 30.000 heo (Hồ Thị Việt Thu, 2002)

Bệnh thường xảy ra 2 dạng cấp tính và mãn tính, nhưng quan trọng hơn hết

là dạng mãn tính vì dạng này trên nái có khả năng gây ra hiện tượng dung nạp miễn dịch cho heo con làm giảm khả năng bảo hộ của vaccin phòng bệnh DTH, tăng cao tình trạng mang trùng trong đàn heo Chính vì thế ở các vùng chăn nuôi heo trên toàn thế giới việc theo dõi tỷ lệ nhiễm virus DTH là điều luôn được thực hiện định

kỳ nhằm nắm vững tình trạng nhiễm virus của đàn heo nuôi

Phương pháp ELISA để phát hiện kháng nguyên của virus dịch tả heo E2 và P125 là sự lựa chọn hàng đầu của các trại cũng như cơ quan thú Y Sở dĩ lựa chọn 2 phương pháp này vì kháng nguyên P125 là một protein có bản chất là enzyme có thể thẩm thấu qua màng tế bào nên có thể hiện diện nhiều nơi, nhất là trong máu và huyết thanh Còn E2 là một protein cấu trúc nên dễ phát hiện khi dùng kháng thể đơn dòng tương ứng

Kỹ thuật ELISA tìm kháng nguyên (E2, P125) đã được ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán kháng nguyên DTH do dễ thực hiện và ít tốn kém Nhằm tìm hiểu thêm

về sự tương đồng giữa hai phương pháp này trên các loại mẫu xét nghiệm khác

nhau (huyết thanh, bệnh phẩm, máu có chất kháng đông) chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“So sánh phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên (E2, P125) và khảo sát

tình hình nhiễm virus dịch tả heo ở heo sinh sản tại một số cơ sở chăn nuôi”

- Phát hiện virus DTH hiện diện trong đàn heo sinh sản tại một số cơ sở chăn

nuôi tại thành phố Hồ Chí Minh với ELISA P125

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Đặc điểm dịch tễ

2.1.1 Trên thế giới

Năm 1810, một bệnh giống như bệnh DTH xuất hiện ở bang Tennessee được

mô tả bởi Dahle (trích dẫn bởi Bùi Quang Anh, 2001) Đến năm 1830, bệnh DTH mới được báo cáo đầu tiên ở bang Ohio (Hoa Kỳ) sau đó tại nhiều quốc gia khác Đến năm 1885, Salmon và Smith cho rằng căn bệnh là do vi khuẩn, đây là sự nhầm lẫn Đến năm 1903, Dorset và Schweinitz khẳng định căn bệnh là do virus gây ra

Từ năm 1962-1976, Mỹ thực hiện chương trình thanh toán bệnh DTH với tổng chi phí lên đến 140 triệu đô la, và ngày nay bệnh đã không còn xuất hiện ở nước này (van Oirschot, 1999)

Từ năm 1822 – 1862, các trận dịch DTH ở Châu Âu đã gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho nhiều quốc gia như Pháp (1822), Đức (1833), Anh (1862) (van Oirschot, 1999)

Đặc biệt, từ 1993 – 1998 có nhiều ổ dịch DTH xảy ra nghiêm trọng tại một số quốc gia như Đức (1993-1997) có 280 ổ dịch; Hà Lan 1997 có 424 ổ dịch; Ý có 80

ổ dịch; ở Bỉ (1997) lần đầu tiên xảy ra dịch DTH Trong năm 1997, có hơn 8 triệu heo đã bị giết hủy tại 5 nước Châu Âu (Đức, Hà Lan, Italia, Tây Ban Nha và Bỉ) (Nguyễn Tiến Dũng, 2002)

Ở Châu Âu bệnh DTH lại xuất hiện vào tháng 1 và tháng 9 năm 1999 do Hungari nhập heo bất hợp pháp (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002) Gần đây, ngày 08/8/2000 trận dịch DTH xảy ra nghiêm trọng ở Anh phải giết hủy 12.000 heo, gây thiệt hại kinh tế đáng kể

Năm 2000-2002 ở Tây Ban Nha đã bùng phát DTH tại 2 tỉnh Lerida và Barcelona ở 49 trại với 291.058 heo chết hoặc tiêu hủy (Allepuz, 2007)

Hình 2.1: Bản đồ phân bố bệnh DTH trên thế giới 2008 (OIE, 2008)

Theo Wee và cs (2005), từ năm 2002 – 2003 bệnh DTH đã bùng phát trên 65 trại heo ở Hàn Quốc Năm 2006 bệnh xuất hiện ở Ấn Độ

Ở Trung Quốc, nhiều tỉnh vẫn xuất hiện bệnh sau khi thực hiện chiến dịch tiêm phòng vaccin, đặc biệt là các tỉnh giáp biên giới Lào, Myanmar và Việt Nam Ngoài ra nhiều trận dịch khác cũng được ghi nhận ở các quốc gia Đông Nam Á (Thái Lan, Myanmar, Malaysia, Philippine, Indonesia, Việt Nam, Lào và Campuchia)

Trong 3 năm (2005- 2007) trên thế giới có 19 quốc gia báo cáo bệnh DTH với 132 ổ dịch, trong đó có 3.273 heo mắc bệnh và 36.165 heo tiêu hủy (OIE, 2007) Đặc biệt từ năm 2008 đến nay bệnh DTH vẫn xảy ra trên nhiều quốc gia

Bảng 2.1: Bệnh DTH tại một số quốc gia đầu năm 2008

Nguồn: Thái Quốc Hiếu, 2009

2.1.2 Tại Việt Nam

Theo Đào Trọng Đạt và Trần Thị Tố Liên (1989), ở Việt Nam bệnh DTH được

Houdemer xác định đầu tiên vào năm 1923 - 1924 Năm 1986 có 481 ổ DTH, năm

1974 các ổ DTH xảy ra từ Thanh Hóa dọc theo quốc lộ 1 vào tới Quảng Trị đã giết

chết hơn 400.000 heo Đặc biệt năm 1978 các ổ DTH ở miền Tây Nam bộ đã giết

chết hơn 15.000 heo

Dịch lớn xảy ra ở miền Bắc Việt Nam vào tháng 12-1959, tháng 3-1960 dịch

nổ ra ở Lào Cai, Sơn La, Hà Đông, Thanh Hóa, Nghệ An, năm 1963 dịch lan sang

một số tỉnh Cao Bằng, Bắc Cạn, Lạng Sơn, Thái Nguyên Cuối năm 1974, dịch xảy

ra ở hầu hết các tỉnh phía Bắc với tổng số 524 ổ dịch Từ năm 1975-1979 dịch có

phần lắng xuống nhưng đến năm 1980 dịch lại bùng phát ở 13 tỉnh biên giới với 360

ổ dịch (Trịnh Văn Thịnh, 1985)

Tại miền Nam, năm 1973, bệnh xảy ra ở 11 trại heo xung quanh Sài Gòn

Năm 1981 bệnh xảy ra tại 15 tỉnh Nam bộ gây chết 145.078 con heo (Đào Trọng

Đạt và Trần Thị Tố Liên, 1989)

Ở đồng bằng Sông Cửu Long theo báo cáo của các Chi Cục Thú Y tỉnh, chỉ

trong vòng 3 năm (1999- 2001) đã có 30.281 heo ở 8 tỉnh trong vùng mắc bệnh gây

chết và loại thải 22.004 con, trong đó thiệt hại lớn nhất là tỉnh Đồng Tháp, Cần Thơ,

Vĩnh Long (Hồ Thị Việt Thu, 2002)

Ngoài các ổ dịch lớn, nhiều ổ dịch lẻ tẻ nhưng kéo dài triền miên đã xuất

hiện tại các trại có quy mô nhỏ, hộ gia đình Bệnh thường xảy ra ở thể không điển

hình, tình trạng nhiễm trùng ở mức độ cao thấp khác nhau Đây chính là nguyên

nhân quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tiêm phòng, làm giảm năng suất chăn

nuôi, gây thiệt hại lớn về kinh tế

Theo Hồ Việt thu (2002), ở đồng bằng sông Cửu Long được ghi nhận số ca

bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng năm 1999-2001 như sau:

Bảng 2.2: Tình hình bệnh DTH ở đồng bằng sông Cửu Long từ 1999-2001

1999 2000 2001 Năm

Tỉnh

Số con nghi bệnh

Số con chết %

Số con nghi bệnh

Số con chết %

Số con nghi bệnh

Số con chết %

cũng là nguyên nhân của các vụ dịch Theo báo cáo của Phân Viện Thú Y Miền

Trung, 9 tháng đầu năm 2002 tỷ lệ nhiễm virus DTH lưu hành ở các tỉnh Miền

Trung là 40-60% (Trích dẫn của Nguyễn Tiến Dũng, 2002a) Kết quả chẩn đoán

bệnh dịch tả heo ở Trung Tâm Thú Y Vùng Đà Nẵng bằng phương pháp ELISA

trên mẫu nghi ngờ bệnh DTH: Tỷ lệ nhiễm chung của các tỉnh khu vực Miền Trung

(8 tỉnh và một thành phố trong đó có 3 tỉnh miền núi Đắc Lắc, Gia Lai, Kontum) là

57,30%, tỉnh có tỷ lệ nhiễm cao nhất là Quảng Ngãi 68,80%, Khánh Hòa 54,10%, Bình Định có tỷ lệ nhiễm thấp nhất là 48,50%

Loại heo bị nhiễm bệnh

* Heo dưới 30 kg tỷ lệ nhiễm là 64,70%

Bệnh xá Thú Y trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh khi xét nghiệm 32 mẫu máu tại trại heo Tân Trung (Củ Chi) bằng phương pháp ELISA E2,

đã phát hiện 2 mẫu dương tính chiếm tỷ lệ 6,28% (5/2010)

Kết quả chẩn đoán DTH tại Trung Tâm Thú Y Trung Ương: xét nghiệm 122 mẫu huyết thanh trên nái thì có 8 mẫu dương tính chiếm 6,56% Điều này cho thấy bệnh dịch tả heo vẫn có mặt ở nhiều cơ sở chăn nuôi hiện nay

heo (chiếm tỷ lệ 9,52%) Ở Sóc Sơn đã phát hiện 3 trường hợp (chiếm tỷ lệ

21,43%) Huyện Triệu Phong và Đông Hà chưa phát hiện trường hợp nào

Bảng 2.4 Kết quả xét nghiệm huyết thanh heo nái tại một số cơ sở chăn nuôi phía

Hồ Huỳnh Mai (2003) thực hiện khảo sát tình hình dịch tả trên heo hạ thịt tại thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang (mẫu lấy từ heo nghi DTH), tỷ lệ nhiễm là 31,81%

Nguyễn Cẩm Tuyền (2003) khảo sát tại tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu, cho thấy tỷ

lệ nái ở hộ dân dương tính với P125 là 10% (31/310 mẫu xét nghiệm được lấy ngẫu nhiên) Xét nghiệm 30 mẫu bệnh phẩm có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ bệnh DTH, tỷ lệ dương tính là 23,33%

Theo Cục Thú Y, tuy bệnh DTH không nổ ra những ổ dịch lớn và gây thiệt hại như những năm trước đây, nhưng vẫn là mối đe dọa lớn đối với ngành chăn nuôi heo, gây khó khăn cho chăn nuôi và xuất khẩu Năm 2005 cả nước có 9.773 ổ dịch (Nguyễn Thu Hà, 2008)

2.2 Đặc điểm sinh học của virus DTH

2.2.1 Phân loại

Virus DTH được xếp vào:

Họ Flaviviridae

Giống Pestivirus

Chi: Flavivirus, Hepacivirus và Pestivirus

Virus DTH thuộc chi Pestivirus (Trần Đình Từ, 2005), chi này không truyền lây

qua côn trùng Theo Becher và cs (2003), chi này bao gồm các loại virus gây bệnh

tiêu chảy bò 1 (Bovine viral diarrhoea virus 1- BVDV 1), tiêu chảy bò 2 (Bovine viral diarrhoea virus 2- BVDV 2), bệnh ở cừu (Border disease virus – BDV), bệnh DTH cổ điển (Classical swine fever virus – CSFV)

2.2.2 Đặc điểm hình thái và cấu tạo

Đặc điểm hình thái

Virus DTH có hệ gen ARN chuỗi đơn, mạch dương, dài khoảng 12,3 kb có

vỏ bọc bên ngoài, hình cầu đường kính 40-50 nm, đối xứng khối 20 mặt, khối lượng phân tử khoảng 60106 Da

Cấu tạo bộ gen

Hệ gen của DTH chứa vùng 5’ không mã hóa (5’ untranslated region- UTR), một khung đọc mở (open reading frame – ORF) và vùng 3’ không mã hóa ORF mã hóa một polyprotein lớn khoảng 3.900 acid amin gồm 4 protein cấu trúc (C, E0, E1, E2) và 8 protein không cấu trúc (Npro, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) (Meyers và cs, 1996)

Hình 2.2: Cấu trúc các vùng trên bộ gen mã hóa protein tương ứng của Pestivirus

(Beer và cs, 2007)

- C: protein của nucleocapsid

- E0, E1, E2: glycoprotein của vỏ

- p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B: vỏ bọc bên ngoài có bản chất

định tính độc của virus DTH Tuy nhiên E2 là một trong những thành phần biến đổi

nhiều nhất trong bộ gen của Pestivirus

Glycoprotein E0 được xem là kháng nguyên đích thứ hai đối với kháng thể trung hòa và góp phần vào việc quyết định tính độc của virus DTH (Meyers và cs, 1996)

Các yếu tố ảnh hưởng đến protein cấu trúc (Windisch và cs, 1996)

 Khi các chất bột đường bị phân giải thì hoạt động của enzyme Rnase bị giảm

vì cấu trúc glycoprotein của E2 có chứa tới 50% chất bột đường

 Kháng thể đơn dòng Mab cho thấy đã ngăn cản mạnh hoạt động của Rnase

và đồng thời cũng ảnh hưởng mạnh tới việc trung hòa virus gây nhiễm

2.2.3 Chức năng các protein của virus DTH

Bảng 2.5 : Chức năng các protein của virus DTH

Protein Gen mã

hóa protein

Chức năng

C p14 tham gia tạo nucleocapsid

E0 gp48 glycoprotein màng với hoạt tính Rnase

NS5B p125 chức năng ARN polymerase phụ thuộc ARN

Nguồn: Thái Quốc Hiếu, 2009 Dựa vào trình tự gen gp55 mã hóa protein E2, các chủng được phân chia thành 3 nhóm chính: 1.1, 1.2, 1.3, 2.1, 2.2, 2.3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 (Panton và cs, 2000)

- Nhóm 1.1 gồm các virus được phân lập ở Nhật (1960), Brazil và Nam Triều Tiên (1980), Thái Lan (1990)

- Nhóm 1.2 gồm các virus được phân lập ở Tây Âu (1940), Malaysia và

- Nhóm 2.2 gồm các virus được phân lập ở Singapore (1980), Thái Lan (1990), Tây Âu (1980 và 1990)

- Nhóm 2.3 gồm các virus được phân lập ở Nhật (1970), Tây Âu (1980 và 1990), Đông Âu (1990)

- Nhóm 3.1 gồm các virus được phân lập ở Anh (1960)

- Nhóm 3.2 gồm các virus được phân lập ở Nam Triều Tiên (1980 và 1990)

- Nhóm 3.3 gồm các virus được phân lập ở Thái Lan (1990)

- Nhóm 3.4 gồm các virus được phân lập ở Nhật (1970) và Đài Loan (1990)

Ở Việt Nam, virus DTH thuộc phân nhóm 2.1 và 2.2 có sự đồng nhất từ Bắc đến Nam

2.2.4 Đặc tính sinh miễn dịch

Miễn dịch chống bệnh DTH là mô hình miễn dịch cổ điển của 3 kiểu đề kháng chính đối với sự nhiễm bệnh Đó là đề kháng tự nhiên, đề kháng do miễn dịch thụ động và đề kháng do miễn dịch chủ động

Sự đề kháng tự nhiên xảy ra dựa trên khác biệt gen giữa các động vật khác loài và trong cùng một loài Tất cả động vật khác ngoài heo đều có sức đề kháng mạnh đối với DTH Trong cùng một loài, cho dù DTH là một trong những bệnh gây chết heo nhiều nhất, luôn luôn có một vài heo trong từng bầy đàn có khả năng đề kháng bệnh DTH Số lượng heo này thường không nhiều; có lẽ ít hơn 5% số heo có miễn dịch tự nhiên đối với DTH (Nguyễn Thị Thu Hồng, 2010)

Theo Terpstra (1977), heo nái được tiêm phòng sẽ truyền kháng thể cho heo con qua sữa đầu trong 36-48 giờ đầu, hệ thống tiêu hóa của heo con sẽ hấp thu globulin miễn dịch để chuyển trực tiếp vào máu nhằm bảo vệ heo con ở 2 tháng đầu, và kháng thể này tồn tại trên 7 tuần

Heo nái khi tiêm phòng DTH sẽ có kháng thể chống lại bệnh nhưng hàm lượng kháng thể không đồng đều giữa các nái Hàm lượng kháng thể trong huyết

thanh của heo mẹ lúc 2 ngày sau khi đẻ và lượng kháng thể thụ động ở heo con 2 ngày tuổi nhận được từ heo mẹ cũng không đồng đều và rất biến động ngay cả heo cùng lứa (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2002) Điều này gây khó khăn cho chúng ta trong việc tiêu diệt bệnh DTH

Hiện tượng dung nạp miễn dịch trên heo con

Dung nạp miễn dịch là trạng thái cơ thể không sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với một kháng nguyên Dung nạp miễn dịch (DNMD) tự nhiên (hay DNMD sơ sinh) là DNMD với các kháng nguyên đã được tiếp xúc ngay từ thời bào thai (Phạm Văn Ty, 2001)

Virus có khả năng đi qua hàng rào bảo vệ của nhau thai để lây nhiễm cho bào thai ở giai đoạn đầu của thai kỳ (từ 50-70 ngày của thai kỳ), lúc tế bào chưa có thẩm quyền miễn dịch, dẫn đến trạng thái DNMD trên heo sơ sinh Heo nhiễm virus DTH bẩm sinh này sẽ không có đáp ứng miễn dịch đối với virus DTH; tuy nhiên vẫn có đáp ứng kháng thể bình thường đối với các kháng nguyên khác

Heo nhiễm virus có sự suy giảm đáng kể IgG trong sữa đầu Hàm lượng IgM

và IgG trong huyết thanh trên heo nhiễm virus huyết thấp có ý nghĩa so với heo không nhiễm virus Không có chứng cứ về sự tổng hợp IgG trong huyết thanh các heo còi và mang virus dai dẳng này Cơ chế bệnh lý của hiện tượng rối loạn globulin miễn dịch có lẽ do tuyến ức bị teo trầm trọng với sự suy kiệt các mô lympho của tuyến ức cũng như ở lách, hạch lympho hầu và ngoại vi trên heo nhiễm virus huyết đã được khảo sát

Heo nái mang thai bị nhiễm virus là vật mang trùng miễn dịch, còn heo bị dung nạp miễn dịch là heo nhiễm thể phát muộn với tình trạng nhiễm huyết dai dẳng sẻ thải virus liên tục cho đến khi chết, do đó chúng đóng vài trò chủ yếu trong việc lây nhiễm virus DTH trong đàn Cần xét nghiệm phát hiện và tiến hành loại thải heo mang trùng nhằm đảm bảo an toàn dịch, cho chính trang trại chăn nuôi, góp phần từng bước nâng cao hiệu quả của chương trình tiêm phòng chống DTH cả nước (Nguyễn Thị Thu Hồng, 2010)

2.2.5 Con đường truyền lây

Hình 2.3: Con đường truyền lây của virus DTH (Trần Đình Từ,1999)

2.2.5.1 Truyền lây trực tiếp

Đây là phương pháp truyền lây chủ yếu, nguồn bệnh bao gồm heo bệnh, heo bệnh mãn tính, heo con dung nạp miễn dịch

Nếu ở giai đoạn 70 ngày heo mang trùng dai dẳng, heo con sinh ra có vẻ bình thường và có thể sống được vài tháng, nhưng những heo này bài thải virus ra môi trường với một số lượng lớn gây nguy hiểm cho quần thể (van Oirschot, 1999)

2.2.5.2 Truyền lây gián tiếp

a/ Thức ăn

Virus có thể xác định dễ dàng trong heo chết và tồn tại lâu trong các sản phẩm thịt đông lạnh Chính vì lý do này virus có thể gây bệnh đối với các trường hợp tận dụng thức ăn dư thừa của các nhà hàng (chưa qua nấu chín) Đây cũng là nguồn lây virus DTH nguy hiểm (Dahle và Liess, 1992)

b/ Xe vận chuyển gia súc

Trong các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy xe vận chuyển gia súc có heo nhiễm bệnh, nhất là các chất tiết của heo mà không được vệ sinh kỹ, cũng là nguồn lây bệnh DTH

c/ Con người

Những người lạ vào chuồng heo nhất là khách tham quan, cán bộ thú y, người nuôi, thương nhân mua heo… cũng được xem là nguồn lây bệnh Sự truyền lây này chủ yếu qua dụng cụ, quần áo, giầy dép Sự truyền lây bệnh DTH thông qua công tác điều trị cũng được chứng minh ở Đức vào năm 1970, heo bị nhiễm virus bởi đội tiêm phòng do sử dụng chung kim tiêm và vaccin (Dahle và Liess, 1992)

d/ Gieo tinh nhân tạo

Virus DTH lây truyền qua tinh dịch được ghi nhận ở Hà Lan trong trận dịch (1997-1998) (Elbers và cs, 1999) Đường lây nhiễm qua tinh dịch là một con đường hết sức nguy hiểm vì cự ly truyền đi rất xa, và rất nguy hiểm cho những trại nhập tinh từ ngoài vào

e/ Phân

Sau khi virus bài thải ra môi trường theo con đường nước tiểu và phân thì virus tồn tại trong hai tuần ở bể chứa phân với nhiệt độ 200 C Tuy nhiên virus bài thải qua đường này là rất thấp (Edwards, 2000), chính vì thế đường truyền lây này

là yếu tố không quan trọng

f/ Động vật khác

Các loài thú khác như chuột, chim cũng được đề cập như là một tác nhân cơ học bởi vì chúng có thể tiếp xúc thường xuyên với heo (có thể chạy từ trại này sang trại khác) (van Oirschot, 1999)

2.4 Đường xâm nhập và cơ chế sinh bệnh

Virus DTH xâm nhập chủ yếu qua đường tiêu hóa, ngoài ra có thể xâm nhập qua đường hô hấp, niêm mạc mắt, đường sinh dục, các vết thương ở da

Bệnh truyền qua tinh dịch từ những heo đực giống hoặc có thể truyền qua nhau thai gây rối loạn sinh sản

Theo Trần Thanh Phong (1996), khoảng 7 giờ sau khi xâm nhập vào vật chủ qua đường tiêu hóa, vị trí nhân lên đầu tiên là hạch amidan, hạch vùng hầu họng, 16 giờ sau virus vào hệ thống lâm ba rồi vào máu (trong các đại thực bào) Theo vòng tuần hoàn virus đến định vị, sinh sản và phá hủy tế bào nội mạc mao mạch, những mãnh vỡ sẽ tụ lại làm tắc mạch dẫn đến nhồi huyết ở lách, xuất huyết ở ruột…

Sau 5-6 ngày nhiễm, nhiễm trùng huyết lần thứ 2 xảy ra Đây là thời điểm xuất hiện các triệu chứng, số lượng virus sẽ đạt tối đa trong máu vào ngày thứ 7 Sự suy yếu hệ thống miễn dịch tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn khác xâm nhập Đa

số heo bệnh cấp tính thường bị chết do rối loạn tuần hoàn nghiêm trọng Ngoài ra virus còn có thể tồn tại bên trong đại thực bào gây ra sự cảm nhiễm dai dẳng

2.5 Chẩn đoán

2.5.1 Chẩn đoán phân biệt bệnh tích DTH

Bảng 2.6 : Đặc điểm bệnh lý của bệnh DTH

Thời gian nhiễm Sau khi sinh Sau khi sinh Trước khi sinh

Diễn biến của bệnh

Thời gian ủ bệnh ngắn, heo mỏi mệt, sốt cao, bỏ ăn, viêm kết mạc mắt, táo bón, xuất huyết dưới da, rối loạn vận động

Thời gian ủ bệnh ngắn, trải qua 3 giai đoạn: 1 sốt nhẹ

bỏ ăn

2 Bình thường

3 Bệnh trở lại và nghiêm trọng hơn

Bệnh xảy ra chậm, heo bỏ ăn, mỏi mệt Thân nhiệt bình thường đến tăng nhẹ, viêm khớp, viêm da, rối loạn vận động

hoặc biến mất Tăng giảm liên tục

Giảm bạch cầu Bạch cầu giảm

nhanh

Bạch cầu lúc đầu giảm sau đó tăng Bạch cầu giảm chậm

Thời gian chết 10-20 ngày 30-90 ngày 60-330 ngày

Bệnh tích

Xuất huyết đặc biệt

ở hạch lâm ba, thận và lách

Loét van hồi manh tràng, nhồi huyết ở

lách

Hạch lâm ba sưng và teo tuyến giáp

Nguồn: Van Oirchot, 1999

2.5.2 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang (FAT- fluorescent antibody test)

Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang được ứng dụng với mẫu cắt lạnh là một trong những phương pháp phát hiện nhanh Các mẫu nên được thu thập từ những heo có triệu chứng hoặc chết, không cho vào chất bảo quản và được giữ trong đá lạnh

Các mẫu được lấy gồm hạch amidan, lách, thận và van hồi manh tràng (EU Diagnostic manual, 2002) Tuy nhiên kỹ thuật còn mặt hạn chế là độ nhạy thấp, đặc biệt là những trường hợp heo ở giai đoạn ủ bệnh hoặc mãn tính

2.5.2.1 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp

Trong kỹ thuật này, người ta gắn kháng thể với chất phát màu huỳnh quang Các kháng thể đó được gọi là conjugate Sau đó sử dụng kháng thể để tìm kháng nguyên

Các mẫu kháng nguyên cần tìm được gắn lên một phiến kính, sau đó nhỏ conjugate lên mẫu Nếu có kháng nguyên thì conjugate sẽ gắn bám vào kháng nguyên Rửa conjugate dư thừa và kiểm tra phiến kính bằng kính hiển vi huỳnh quang, nếu có kháng nguyên trong mẫu thì vi trường sẽ phát sáng Ngược lại nếu không có kháng nguyên trong mẫu thì conjugate bị rửa trôi và vi trường không phát sáng

2.5.2.2 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang gián tiếp

Kỹ thuật này gồm có 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng thể đặc hiệu, kháng kháng thể đặc hiệu đã gắn chất huỳnh quang và kháng nguyên chẩn đoán

Kháng thể đặc hiệu ở đây có hai chức năng: là kháng thể đối với kháng nguyên chẩn đoán và là kháng nguyên đối với kháng kháng thể gắn chất huỳnh quang

Nếu so sánh giữa hai phương pháp này, kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp có thời gian thực hiện nhanh hơn, chi phí thấp hơn, ngược lại kỹ thuật kháng thể huỳnh quang gián tiếp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhưng thời gian thực hiện dài hơn, conjugate kháng thể huỳnh quang gián tiếp ít phổ biến hơn (Wise và

cs, 2005)

2.5.3 Kỹ thuật ELISA (Enzyme linked imunosorbent assay)

2.5.3.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên

Kỹ thuật ELISA phát hiện protein không cấu trúc P125 có trong tất cả các chủng virus DTH; sử dụng kháng thể đơn dòng kháng P125 để phát hiện virus DTH, mật độ quang trong các giếng phản ứng sẽ chứng minh được sự có mặt của virus trong mẫu huyết tương, huyết thanh, bạch cầu, máu kháng đông hoặc chiết xuất từ mô Phương pháp này có ưu điểm là kết quả nhanh, chính xác, kiểm tra được trên heo còn sống, tiện lợi khi xét nghiệm với số lượng mẫu lớn Bên cạnh đó, cũng có một số hạn chế như kháng nguyên P125 không thể phân biệt với bệnh tiêu chảy do virus ở bò

Về nguyên lý, khi virus tồn tại trong cơ thể heo và phát triển trong tế bào thì đồng thời virus sản sinh một loại protein không thuộc cấu trúc (được sản sinh chỉ khi có sự tái sản virus) của nó đó là protein P125 Bản chất của protein này là một enzyme nên nó có thể thẩm thấu qua màng tế bào và do đó protein này có trong huyết thanh, máu, bạch cầu và hầu hết các cơ quan phủ tạng khác Với kỹ thuật này nếu mẫu dương tính nghĩa là có virus đang hiện diện trong cơ thể gia súc Thời gian thực hiện phản ứng nhanh, xác định trên những heo nhiễm bệnh ở thể cấp tính, mãn tính và kể cả thể dung nạp miễn dịch không tạo ra kháng thể nhưng mang trùng

Cơ chế của phản ứng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng thuần khiết đặc hiệu với kháng nguyên P125 Kháng nguyên P125 có trong mẫu bệnh phẩm sẽ kết hợp với kháng thể đơn dòng này và sử dụng chất đổi màu hydrogen peroxyd và tetramethyl Kỹ thuật này được dùng trong phòng thí nghiệm, động vật thử nghiệm cũng như quy mô đại trà là nơi có dịch Mật độ quang trong các giếng phản ứng sẽ chứng minh được sự có mặt của virus trong mẫu cần xét nghiệm

Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên virus DTH trong các mẫu máu và mô thích hợp để chẩn đoán nhanh những đàn bị nhiễm Một số bộ kít thương mại có thể phát hiện kháng nguyên glycoprotein E2 bằng cách dùng kháng thể đơn dòng (Mab) gắn trực tiếp tại những điểm quyết định kháng nguyên (epitop) của glycoprotein E2

Một số bộ kít thương mại khác dùng kháng thể đơn dòng gắn trực tiếp với những protein không cấu trúc của virus (được sản sinh khi có sự tái sản virus), như kháng nguyên P125 Sự phát hiện kháng nguyên như thế cũng có tầm hữu ích thực tiễn để nhận biết những thú mang trùng Tuy nhiên phương pháp này có độ nhạy không cao

và có khả năng cho kết quả dương tính giả (Hồ Huỳnh Mai, 2009)

2.5.3.2 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể

Kỹ thuật này tương đối đơn giản và nhanh, thực hiện trên số lượng mẫu lớn nhằm xác định heo cảm nhiễm Kỹ thuật này dùng để phân biệt kháng thể sinh ra ở heo do virus DTH hay do virus gây tiêu chảy ở bò thông qua sự gắn kết giữa hai kháng thể đơn dòng và những epitop khác nhau trên glycoprotein E2 Tuy vậy kỹ thuật này không thể áp dụng trong những đàn heo đã được chủng ngừa vaccin virus nhược độc vì không thể phân biệt được kháng thể E2 hiện diện là do virus xâm nhập hay do đáp ứng vaccin Kỹ thuật này có kết quả dương tính giả cao

2.5.4 Kỹ thuật trung hòa virus (Virus neutralization test)

Trên môi trường nuôi cấy như phôi gà (động vật cảm thụ) hoặc môi trường tế bào, virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho đối tượng trên Khi virus gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng chúng sẽ bị trung hòa không nhân lên được và không gây bệnh tích cho tế bào trong môi trường nuôi cấy

Phương pháp trung hòa này được xem là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng tốn nhiều thời gian và không thích hợp cho việc khảo sát quần thể lớn Do đó người ta sử dụng phương pháp ELISA để khảo sát quần thể lớn, và phương pháp này được thực hiện để kiểm tra lại những trường hợp nghi ngờ khi thực hiện phương pháp ELISA

2.5.5 Phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử

2.5.5.1 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 Phương pháp PCR dựa trên nguyên tắc của một phản ứng sinh hoá: tổng hợp nhiều bản sao ADN từ trình tự ADN xác định nhờ enzyme Một phản ứng khuếch đại đặc trưng bao gồm trình tự ADN cần quan tâm, một enzyme tổng hợp ADN chịu nhiệt,

hai đoạn nucleotide mồi, bốn loại deoxynucleotide triphosphat (dNTP), dịch đệm cho phản ứng và magnesium (Võ Thị Tuyết, 2009)

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Một chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Giai đoạn biến tính ADN bởi sự tăng nhiệt đến 950C hay cao hơn trong 15 giây đến 2 phút, trong giai đoạn này 2 mạch đơn của ADN tách rời nhau để đoạn mồi có thể dò tìm và gắn vào

Bước 2: là giai đoạn bắt cặp, trong giai đoạn này chu kỳ nhiệt được giảm xuống 40-600C Ở nhiệt độ này các đoạn nucleotide mồi sẽ bắt cặp với từng mạch đơn của ADN mẫu tại vị trí xác định và đóng vai trò là đoạn mồi tổng hợp ADN nhờ enzyme chịu nhiệt Bước này kéo dài khoảng 30-60 giây

Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài, nó tổng hợp đoạn ADN bước này kéo khoảng 1-2 phút với nhiệt độ khoảng 720C

Hình 2.4: Tiến trình của PCR

(Nguồn: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif)

2.5.5.2 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)

Kỹ thuật này kết hợp phản ứng phiên mã ngược (reverse transcription) tổng

hợp cDNA từ mẫu RNA với phản ứng khuếch đại DNA từ cDNA nhờ enzyme

polymerase (polymerase chain reaction)

Do kỹ thuật PCR chỉ khuếch đại trình tự ADN, cần phải chuyển đổi RNA

thành cDNA nhờ hoạt tính reverse transcriptase Đoạn mồi sử dụng trong kỹ thuật

này là mồi ngược của PCR giai đoạn sau (đây là đoạn mồi chuyên biệt gen), hoặc cĩ

thể là oligo-dT (để bắt cặp với đuơi poly A của các mRNA), hoặc là các

hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn

trên RNA (Phạm Phong Vũ, 2005)

Để thực hiện phản ứng PCR, phức hợp cDNA và RNA được xử lý nhiệt

950C trong 2 phút nhằm làm biến tính cDNA và RNA, bất hoạt reverse transriptase

và tách reverse transriptase ra khỏi cDNA Sau đĩ mồi xuơi sẽ bắt cặp với cDNA và

DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch bổ sung cDNA mạch kép sẽ được sao chép lặp

lại nhiều lần trong phản ứng PCR nhờ hoạt tính của DNA polymerase cùng với các

cặp mồi chuyên biệt Mồi bắt cặp với mạch phiên mã gọi là mồi xuơi (sense

primer), cịn mồi ngược (antisense primer) bắt cặp với mạch khơng phiên mã

CRL (EU Reference Laboratory for CSF) (2002) đề nghị chẩn

đoán bằng

đoạn mồi khuếch đại gen đích trên vùng 5’NCR (Vilcek và ctv., 1996):

Mồi xuơi 5’ ATG CCC T/ATA GTA GGA CTA GCA 3’ (100-120)

Mồi ngược 5’ TCA ACT CCA TGT GCC ATG TAC 3’ (383-363)

để phát hiện vi rút DTH

Bảng 2.7 : So sánh đặc tính của các kỹ thuật chẩn đốn để phát hiện virus DTH

Kỹ thuật Đặc tính

Nguồn: CEC, 2003

2.5.5.3 Kỹ thuật real-time PCR

Vào năm 1992-1993 Higuchi và cộng sự đã tiên phong phân tích PCR bằng cách thiết lập hệ thống phát hiện các sản phẩm khuếch đại khi các sản phẩm này được tích lũy Hệ thống real-time bao gồm máy luân nhiệt, có hệ thống chiếu mẫu bằng tia UV và tín hiệu huỳnh quang được thu thập qua CCD (Charge coupled device) camera Ethidium bromide được thêm vào trong mỗi phản ứng khi có sự khuếch đại, số lượng DNA sợi đôi tăng lên thì ethidium bromide xen vào mạch đôi

do đó tín hiệu huỳnh quang tăng lên

Ngày nay các nhà khoa học không ngừng cải tiến kỹ thuật real-time PCR đồng thời phát minh ra các chất chỉ thị huỳnh quang khác

Khái niệm

real-time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn DNA chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang Trong phản ứng real-time PCR quá trình nhân bản DNA đang diễn ra trong từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp

real-time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phương pháp PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành

Nguyên tắc

Phương pháp dựa trên sự khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu, sản phẩm khuếch đại được đánh dấu bằng chất chỉ thị màu hay probe gắn huỳnh quang Trong khi chạy real-time PCR, đầu đọc real-time PCR sẽ phát hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở bước nhiệt độ trong các chu kỳ nhiệt tùy vào mỗi phương pháp phát hiện tín hiệu màu Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên phần mềm và biết được nồng độ và tác nhân gây bệnh ban đầu của mẫu xét nghiệm dựa vào nồng độ DNA chuẩn Nồng độ DNA trong mẫu xét nghiệm sẽ được xác định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu của

2.5.6 Phương pháp tiêm động vật thí nghiệm

Phương pháp này chẩn đoán chính xác bệnh, nhưng tốn nhiều thời gian và tiền bạc Phương pháp này thường sử dụng heo 3 - 4 tháng tuổi khỏe mạnh, được kiểm tra không có kháng nguyên và kháng thể bệnh DTH Bệnh phẩm thường dùng

để tiêm heo thí nghiệm là máu, lách, hay bệnh phẩm nghi ngờ

2.6 Phòng bệnh

2.6.1 Chăn nuôi an toàn sinh học

Người chăn nuôi phải thực hiện các biện pháp chăn nuôi an toàn sinh học như sau: a) Vệ sinh, sát trùng chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi thường xuyên: mùa hè hàng ngày cọ rửa chuồng, máng ăn, máng uống

b) Sau khi xuất bán heo, phải tổng tẩy uế, sát trùng chuồng trại, môi trường và để trống chuồng từ 5-7 ngày

c) Heo mới mua về phải nhốt riêng ít nhất 7 ngày để theo dõi lâm sàng cho đến khi chắc chắn không có bệnh mới được nhập nuôi chung với đàn heo cũ đang có

d) Chăm sóc nuôi dưỡng tốt, hạn chế khách tham quan

2.6.2 Phòng bằng vaccin

Tiêm phòng bệnh dịch tả heo phải thực hiện như sau:

a) Đối với heo con sinh ra từ heo mẹ đã được tiêm phòng: tiêm cho heo con từ 35 -

45 ngày tuổi;

b) Đối với heo con sinh ra từ heo mẹ chưa được tiêm phòng: Có thể tiêm cho heo con 7 ngày tuổi, sau 3 tuần tiêm nhắc lại, hoặc tiêm cho heo con 14 ngày tuổi, sau 2 tuần tiêm nhắc lại

c) Đối với heo nái mang thai: tiêm phòng trong thời gian mang thai từ ngày thứ 85 đến 93

Hiện nay có nhiều loại vaccin phòng bệnh DTH trên thị trường, việc sử dụng các loại vaccin tùy theo nhu cầu và quy trình của từng trại Cơ bản có 2 loại vaccin:

- Vaccin chết: phổ biến nhất là vaccin kết tinh tím, miễn dịch hình thành sau khi tiêm 3 tuần và kéo dài khoảng 6 tháng, không dùng cho heo dưới 40 kg Ưu

điểm của vaccin này là mức độ an toàn cao nhưng có nhược điểm là đáp ứng miễn

dịch chậm, kém và thời gian bảo hộ chỉ được vài tháng ngay cả sau khi tiêm nhắc lại

nhiều lần

- Vaccin nhược độc có nhiều loại, thường sử dụng loại vaccin nhược độc qua

thỏ hoặc dê hóa (chủng C, chủng GPE-, chủng Thiverval), miễn dịch hình thành sau

4-7 ngày và thời gian (trên 18 tháng) Tuy nhiên, nếu mức độ nhược độc chưa đạt

yêu cầu thì độ an toàn và tính ổn định về di truyền của chủng virus là vaccin sẽ

không đảm bảo; do vậy, sau khi tiêm phòng, heo có triệu chứng lâm sàng như sốt,

xuất huyết (Nguyễn Tiến Dũng, 2002c)

Bảng 2.8: Quy trình tiêm phòng vaccine DTH theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Nguồn: Thái Quốc Hiếu, 2009

Bảng 2.9 : Quy trình tiêm phòng vaccine DTH tại một số trại ở TP.HCM và

Bình Dương Lịch tiêm phòng (ngày tuổi)

Nguồn: Thái Quốc Hiếu, 2009

* Đối với nái

Vào mỗi lứa đẻ tiêm lúc 3 tuần trước khi sinh hoặc 2 tuần sau cai sữa (đối

với heo nái)

* Đối với heo nọc: 2 lần/năm

2.7 Các công trình nghiên cứu liên quan

Theo Loeffen và cs (2005), kỹ thuật RT-PCR có độ nhạy cao, có thể phát hiện được gen của virus trong mẫu mô heo đã phục hồi bệnh, tác giả đã phát hiện virus DTH trong hạch hầu, khi heo này phục hồi bệnh DTH 63 ngày

Dewulf và cs (2004) gây nhiễm 128 heo (heo cai sữa, heo vỗ béo, heo nái),

tỷ lệ dương tính của phương pháp RT-PCR là 98,9% trong khi đó phương pháp ELISA là 74,7%

Depner và cs (2007) đánh giá xét nghiệm RT-PCR khi xét nghiệm bệnh DTH trên heo rừng cho thấy, kỹ thuật RT-PCR có khả năng phát hiện virus trong giai đoạn ủ bệnh, có biểu hiện lâm sàng, đã phục hồi bệnh và mẫu bệnh phẩm phân huỷ khi virus bị bất hoạt

Kamakawa và cs (2003) đã tiến hành khảo sát bệnh DTH tại Cần Thơ bằng

kỹ thuật RT-PCR trên những heo nghi ngờ Kết quả cho thấy bệnh DTH hiện diện ở tất cả các trang trại khảo sát

Bùi Nghĩa Vượng và cs (2006) chẩn đoán bệnh DTH bằng phương pháp PCR với mẫu máu lấy bằng giấy thấm, tác giả chứng tỏ rằng có thể phát hiện được virus DTH từ các mẫu giấy thấm máu khô giữ ở 370C trong 10 tháng

Trần Thị Dân và cs (2003) sử dụng xét nghiệm ELISA và ghi nhận heo âm tính P125 có dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích gần giống heo dương tính P125

Lê Văn Hùng và cs (2003) ứng dụng RT-PCR để chẩn đoán bệnh DTH tại 5 tỉnh thành phố phía Nam Kết quả cho thấy, nếu lấy mẫu trên những heo còn sống nghi ngờ bệnh DTH thì xét nghiệm chỉ có 3/61 mẫu dương tính chiếm 4,9% trong khi mẫu được lấy từ heo chết nghi bệnh DTH thì dương tính khá cao (5/7 mẫu chiếm 71,4%)

Lê Văn Đẳng (2007) khảo sát 350 heo nái và 42 heo nọc tại hộ dân ở tỉnh Bạc Liêu, tỷ lệ dương tính khá thấp (1,71%) với ELISA P125, tỉ lệ dương tính với P125 trên heo (có biểu hiện lâm sàng) tại lò mỗ là 11,43%

Hồ Huỳnh Mai (2009) xét nghiệm mẫu lách có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ bệnh dịch tả heo bằng ELISA, tỷ lệ dương tính với kháng nguyên E2 của virus DTH chiếm 29,17% Heo nghi bệnh có biểu hiện đặc trưng là: da xuất huyết điểm (64,29%), viêm kết mạc mắt (52,86%), van hồi manh tràng loét hình cúc áo (77,14%), hạch màng treo ruột xuất huyết (61,43%), thận xuất huyết (60%), lách nhồi huyết (42,86%)

Kết quả xét nghiệm ELISA bằng kháng thể đơn dòng để phát hiện kháng nguyên P125 được ghi nhận từ Trung Tâm Thú Y Vùng Cần Thơ cho thấy kết quả ở những đàn heo khỏe mạnh tỷ lệ mang mầm bệnh biến động từ 0 – 4,17%

Hiện tượng mang trùng này còn phụ thuộc vào tình trạng sức khỏe và mức

độ miễn dịch của đàn Trong nghiên cứu “Xác định vai trò virus dịch tả heo trong hội chứng tiêu chảy kéo dài ở lợn con tại các trại chăn nuôi tập trung” ở An Giang (Nguyễn Thị Hạnh Chi, 1999), kết quả xét nghiệm kháng nguyên P125 từ 2 trại của tỉnh có kết quả như sau:

Bảng 2.10: Kết quả phát hiện kháng nguyên P125 từ 2 trại heo ở An Giang

Trại Số lượng (con) Dương tính (con) Tỷ lệ (%)

đó Hà Thị Thanh Lao (2005) khảo sát ở Bà Rịa – Vũng Tàu là 10%, Bùi Trung Trực và cs (2005) là 9,72%

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện

3.1.1 Thời gian

Đề tài được thực hiện từ ngày 01/01/2009 đến ngày 28/08/2010

3.1.2 Địa điểm

- Mẫu huyết thanh và máu kháng đông được lấy trên đàn heo nái, nọc tại 13 cơ

sở chăn nuôi thuộc địa bàn Thành Phố Hồ Chí Minh, được thể hiện qua bản đồ 3.1

Bản đồ 3.1: Phân bố mẫu khảo sát trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh

- Địa điểm xét nghiệm: Trạm Chẩn Đoán- Xét Nghiệm và Điều Trị thuộc Chi Cục Thú y TP.HCM

3.1.3 Đối tượng khảo sát

Heo nái, nọc: mẫu máu lấy tại một số cơ sở chăn nuôi (heo khỏe mạnh) Mẫu huyết thanh, máu kháng đông và bệnh phẩm của heo nghi ngờ bệnh DTH (do khách gởi về trạm để xét nghiệm)

Hình 3.1: Vị trí lấy mẫu (tĩnh mạch chủ trước và tĩnh mạch tai)

- Mẫu bệnh phẩm từ heo nghi bệnh dịch tả được gởi đến trạm gồm (lách, hạch amidan, thận ) Mỗi loại mẫu lấy khoảng 5-10g được cho vào túi ny-lon vô trùng, bảo quản trong thùng có đá, vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm sau khi giết mổ

Tại phòng thí nghiệm mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC trong vòng 2 ngày

kể từ khi nhận mẫu Nếu chưa xét nghiệm ngay thì bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20oC

và tránh rã đông nhiều lần Các mẫu đều có kí hiệu kiểm soát riêng

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Thiết bị:

- Máy đọc ELISA (Benmark - Biorad Laboratories)

- Máy PCR (iQ5 - Bio-rad)

Dụng cụ: găng tay, kéo, bông thấm, ống tiêm, bình trữ lạnh, ống đông,

micropipette

Hình 3.2: Máy đọc gel, máy PCR, máy đọc ELISA

Hình 3.3: Phản ứng trong giếng của phương pháp ELISA

3.2.3 Các bộ kít dùng trong chẩn đoán

Kít ELISA

- Bộ kít (SERELISA ® HCV Ag Mono indirect) phát hiện kháng nguyên P125 của virus DTH của hãng SYNBIOTICS, Pháp

- Bộ kít (HerChek® CSFV Ag ELISA Test Kit) phát hiện kháng nguyên E2

của virus DTH của hãng IDEXX, Mỹ (xem phụ lục)

Kít, hóa chất ly trích RNA và RT-PCR

- Qiagen®Rneasy Extraction Kit (cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep )

- QIAamp RNA Blood Mini Kit (cat # 52304)

- QIAamp Viral RNA Mini Kit (cat # 52904 50 prep)

- Qiagen® OneStep RT-PCR Kit (cat # 210210)

- -Mercaptoethanol

- RNA đối chứng dương DTH

- MgCl2 25mM (Promega, cat # A3511)

- Agarose

- Nước không có enzym Rnase

CRL (EU Reference Laboratory for CSF) (2002) đề nghị chẩn đoán bằng PCR nhằm vào vùng không mã hóa 5’ (5’NCR)

Đoạn mồi khuếch đại gen đích trên vùng 5’NCR:

Mồi xuôi 5’ ATG CCC T/ATA GTA GGA CTA GCA 3’ (100-120)

Mồi ngược 5’ TCA ACT CCA TGT GCC ATG TAC 3’ (383-363)

để phát hiện vi rút DTH (Vilcek và ctv, 1996)

3.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: So sánh phương pháp ELISA tìm kháng nguyên (E2, P125) lấy

Các chỉ tiêu theo dõi

- Mức độ tương đồng của 2 phương pháp ELISA (E2, P125)

- Độ nhạy, độ chuyên biệt phương pháp ELISA (E2, P125)

- So sánh độ nhạy, độ chuyên biệt, mức độ tương đồng của 2 phương pháp ELISA (E2, P125) trên 3 loại mẫu huyết thanh, bệnh phẩm, máu kháng đông

Nội dung 2: Khảo sát tỷ lệ nhiễm virus DTH trên heo sinh sản

- Khảo sát tỷ lệ nhiễm của virus DTH trên heo sinh sản ở các cơ sở chăn nuôi bằng phương pháp ELISA P125

Đối tượng khảo sát

Heo nái, nọc lấy mẫu huyết thanh tại một số cơ sở chăn nuôi (heo dáng vẻ khỏe mạnh)

Bảng 3.1: Phân bố mẫu khảo sát tình hình nhiễm virus DTH tại 13 cơ sở chăn nuôi

bằng kỹ thuật ELISA P125

Cơ sở

chăn nuôi Địa bàn

Tổng Đàn heo

Tổng đàn giống (nọc, nái) Số mẫu

Các chỉ tiêu theo dõi trên phương pháp ELISA P125

- Tỷ lệ nhiễm virus DTH trên heo: sinh sản, nọc, nái

- Tỷ lệ nhiễm virus DTH theo lứa đẻ

- Tỷ lệ nhiễm virus DTH theo quy mô đàn

- Tỷ lệ nhiễm virus DTH theo từng địa phương

3.4 Xử lý số liệu

- Tỷ lệ nhiễm được trình bày theo tỷ lệ

- So sánh các tỷ lệ bằng trắc nghiệm 2 với phần mềm Minitab 10.0

a/ Mức độ tương đồng: Trị số kappa (K) được tính để đánh giá mức độ tương đồng

của phương pháp ELISA P125 và ELISA E2

Tính bằng phần mềm Win Episcope 2.0 Mức độ phù hợp của xét nghiệm (Theo Trần Thị Dân, 2007): trị số K biến động từ -1 (không thống nhất) qua zero (thống nhất do ngẫu nhiên) đến +1 (thống nhất hoàn toàn)

Bảng 3.2 : Cách tính mức độ tương đồng của 2 phương pháp xét nghiệm

âm hoặc cả hai cùng dương), Po= (a+d)/n

a: Số thú thực sự mắc bệnh được phát hiện bằng phương pháp chẩn đoán

a+c: Tổng số thú thực sự mắc bệnh (phát hiện bằng phương pháp chuẩn)

c/ Độ chuyên biệt được định nghĩa là xác suất để một con thú không bệnh được phát hiện bằng phương pháp chẩn đoán Thể hiện trong công thức sau:

Sp = d/(b+d) Sp: Độ chuyên biệt

d: Số thú không bệnh (phát hiện bằng phương pháp chẩn đoán)

b+d: Tổng số thú thật sự không bệnh (bằng phương pháp chuẩn)

Chương 4

KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 So sánh 2 phương pháp ELISA (E2, P125) lấy RT-PCR làm phương pháp chuẩn

Trong chẩn đoán mọi phương pháp xét nghiệm không hẳn là hoàn hảo với mức độ chính xác 100%, dẫn đến việc kết luận nhiễm bệnh hay không cũng không hoàn toàn tuyệt đối Điều này có thể do mẫu cho phản ứng dương tính giả và ngược lại là âm tính giả Để hiểu biết thêm về vấn đề này chúng tôi tiến hành phân tích độ nhạy, độ chuyên biệt, giá trị chẩn đoán của hai phương pháp ELISA và xem RT-PCR làm phương pháp chuẩn (phương pháp này được Cục Thú Y khuyến cáo sử dụng chẩn đoán bệnh DTH với độ nhạy, độ chuyên biệt cao dù chưa phải là tuyệt đối) Theo Pearson 1998, phương pháp tiêm truyền qua heo là phương pháp phát hiện virus DTH chính xác nhất, tuy nhiên cần nhiều thời gian và rất tốn kém nên ít được sử dụng trong thực tế

Trong suốt thời gian thực hiện 1/2009-8/2001 tổng số mẫu thu thập là:

* Mẫu huyết thanh: 17 mẫu

* Mẫu bệnh phẩm: 20 mẫu

* Mẫu máu kháng đông: 18 mẫu

Các mẫu sử dụng trong nội dung này là mẫu được lấy từ heo nghi ngờ bệnh DTH, gởi từ các cơ sở chăn nuôi về Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm - Điều Trị

4.1.1 So sánh ELISA (E2, P125) trên mẫu huyết thanh (xem RT-PCR là phương pháp chuẩn)

Thực hiện xét nghiệm chẩn đoán bệnh DTH trên 17 mẫu huyết thanh được lấy từ heo nghi ngờ bệnh DTH, phát hiện có 3 mẫu dương tính với kháng nguyên

E2 và 4 mẫu dương tính với kháng nguyên P125 Kết quả dương tính với kháng nguyên E2 và P125 được trình bày qua bảng 4.1

Bảng 4.1: Kết quả xét nghiệm mẫu huyết thanh bằng phương pháp ELISA (E2,

P125) được kiểm chứng bởi RT-PCR (n=17) Stt Ký hiệu mẫu Kết quả (E2) Kết quả (P125) RT-PCR

Bảng 4.2: Tỷ lệ dương tính với 3 phương pháp trên mẫu huyết thanh

độ tương đồng giữa ELISA E2 và P125 được trình bày qua bảng 4.3

Bảng 4.3 Mức độ tương đồng của 2 phương pháp ELISA (E2, P125) trên mẫu huyết

thanh ELISA (E2) Dương Tính Âm Tính Tổng

độ nhạy, độ chuyên biệt và giá trị chẩn đoán của hai phương pháp trên qua bảng 4.4