Kỹ thuật PCR được Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985.
Phương pháp PCR dựa trên nguyên tắc của một phản ứng sinh hoá: tổng hợp nhiều bản sao ADN từ trình tự ADN xác định nhờ enzyme. Một phản ứng khuếch đại đặc trưng bao gồm trình tự ADN cần quan tâm, một enzyme tổng hợp ADN chịu nhiệt,
hai đoạn nucleotide mồi, bốn loại deoxynucleotide triphosphat (dNTP), dịch đệm cho phản ứng và magnesium (Võ Thị Tuyết, 2009).
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Một chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1: Giai đoạn biến tính ADN bởi sự tăng nhiệt đến 950C hay cao hơn trong 15 giây đến 2 phút, trong giai đoạn này 2 mạch đơn của ADN tách rời nhau để đoạn mồi có thể dò tìm và gắn vào.
Bước 2: là giai đoạn bắt cặp, trong giai đoạn này chu kỳ nhiệt được giảm xuống 40-600C. Ở nhiệt độ này các đoạn nucleotide mồi sẽ bắt cặp với từng mạch đơn của ADN mẫu tại vị trí xác định và đóng vai trò là đoạn mồi tổng hợp ADN nhờ enzyme chịu nhiệt. Bước này kéo dài khoảng 30-60 giây.
Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài, nó tổng hợp đoạn ADN bước này kéo khoảng 1-2 phút với nhiệt độ khoảng 720C.
Hình 2.4: Tiến trình của PCR
(Nguồn: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif)
2.5.5.2 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) Kỹ thuật này kết hợp phản ứng phiên mã ngược (reverse transcription) tổng hợp cDNA từ mẫu RNA với phản ứng khuếch đại DNA từ cDNA nhờ enzyme polymerase (polymerase chain reaction).
Do kỹ thuật PCR chỉ khuếch đại trình tự ADN, cần phải chuyển đổi RNA thành cDNA nhờ hoạt tính reverse transcriptase. Đoạn mồi sử dụng trong kỹ thuật này là mồi ngược của PCR giai đoạn sau (đây là đoạn mồi chuyên biệt gen), hoặc có thể là oligo-dT (để bắt cặp với đuôi poly A của các mRNA), hoặc là các hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA (Phạm Phong Vũ, 2005).
Để thực hiện phản ứng PCR, phức hợp cDNA và RNA được xử lý nhiệt 950C trong 2 phút nhằm làm biến tính cDNA và RNA, bất hoạt reverse transriptase và tách reverse transriptase ra khỏi cDNA. Sau đó mồi xuôi sẽ bắt cặp với cDNA và DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch bổ sung. cDNA mạch kép sẽ được sao chép lặp lại nhiều lần trong phản ứng PCR nhờ hoạt tính của DNA polymerase cùng với các cặp mồi chuyên biệt. Mồi bắt cặp với mạch phiên mã gọi là mồi xuôi (sense primer), còn mồi ngược (antisense primer) bắt cặp với mạch không phiên mã.
CRL (EU Reference Laboratory for CSF) (2002) đề nghị chẩn đoán bằng
đoạn mồi khuếch đại gen đích trên vùng 5’NCR (Vilcek và ctv., 1996):
Mồi xuôi 5’ ATG CCC T/ATA GTA GGA CTA GCA 3’ (100-120) Mồi ngược 5’ TCA ACT CCA TGT GCC ATG TAC 3’ (383-363) để phát hiện vi rút DTH.
Bảng 2.7 : So sánh đặc tính của các kỹ thuật chẩn đoán để phát hiện virus DTH Kỹ thuật
Đặc tính
FAT ELISA Phân lập RT-PCR
Độ nhạy Trung bình Trung bình Cao Cao Độ đặc hiệu Trung bình Trung bình Cao Cao
Khả năng tự động hóa Không Cao Không Trung bình
Thời gian 3-4 giờ 6-20 giờ >72 giờ 8 giờ
Giá thành Thấp Thấp Cao Trung bình
Nguồn: CEC, 2003.
2.5.5.3 Kỹ thuật real-time PCR
Vào năm 1992-1993 Higuchi và cộng sự đã tiên phong phân tích PCR bằng cách thiết lập hệ thống phát hiện các sản phẩm khuếch đại khi các sản phẩm này được tích lũy. Hệ thống real-time bao gồm máy luân nhiệt, có hệ thống chiếu mẫu bằng tia UV và tín hiệu huỳnh quang được thu thập qua CCD (Charge coupled device) camera. Ethidium bromide được thêm vào trong mỗi phản ứng khi có sự khuếch đại, số lượng DNA sợi đôi tăng lên thì ethidium bromide xen vào mạch đôi do đó tín hiệu huỳnh quang tăng lên.
Ngày nay các nhà khoa học không ngừng cải tiến kỹ thuật real-time PCR đồng thời phát minh ra các chất chỉ thị huỳnh quang khác.
Khái niệm
real-time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn DNA chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng real-time PCR quá trình nhân bản DNA đang diễn ra trong từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp.
real-time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phương pháp PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành.
Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên sự khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu, sản phẩm khuếch đại được đánh dấu bằng chất chỉ thị màu hay probe gắn huỳnh quang. Trong khi chạy real-time PCR, đầu đọc real-time PCR sẽ phát hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở bước nhiệt độ trong các chu kỳ nhiệt tùy vào mỗi phương pháp phát hiện tín hiệu màu. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên phần mềm và biết được nồng độ và tác nhân gây bệnh ban đầu của mẫu xét nghiệm dựa vào nồng độ DNA chuẩn. Nồng độ DNA trong mẫu xét nghiệm sẽ được xác định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu của mẫu chuẩn.